Name: サーモトガ・マリティマ・メンブレン結合ピロホスファターゼ阻害剤のスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶサーモトガ・マリティマの膜結合ピロホスファターゼ阻害剤スクリーニング法。モリブデンブルー反応を用いた安価で安定した96ウェルプレート形式の手法により、寄生虫病治療薬の発見に貢献します。

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この作品は、ジェーンとアートス・エルッコ財団とBBSRC(BB/M021610)からエイドリアン・ゴールドマンへの助成金によって支えられ、 フィンランドアカデミー(No. 308105)からケニ・ヴィディレーザーイス、(No. 310297)からアンリ・シャアール、(No. 265481)からヤリ・イリ・カハルオマ、ヘルシンキ大学からグスタフ・ボイエ・アフ・ジェンナスへの研究基金。著者たちは、プロジェクト中の彼女の技術的な助けのためにベルナデット・ゲールに感謝します。

1. タンパク質調製
注:TmPPeの発現および精製は、他の場所で13について説明されている。
<ol><li>20 mM2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)pH 6.5、3.5%(v/v)グリセロール、2mMジチオスレイトール(DTT)、および0.05%ドデシルマルトシド(DDM)を含む再活性化緩衝液の10mLを調製する。</li>
	<li>200 mM Tris-Cl pH 8.0、8.0 mM MgCl 2、333 mM KCl、および 67 mM NaCl を含む反応混合物の 10 mL を調製します。 注:Mg2+は、mPPPeの基質としてピロリン酸をキレートするために必要であり、K+は、TmPPPeeがカリウム依存性mPPPAeであるとして酵素活性を増加させるために必要であり、TmPPPesによるナトリウムイオン転座中の酵素活性にはNa+が必要である。</li>
	<li>酵素再活性化のために30 mg/mLリポソームを調製する。<ol>
<li>大豆から20 mMトリスHCl pH 8.0の10 mLに1mMのトリス-HCl pH 8.0を1mM DTTで10mM TTで0.3gのL-α-ホスファチジルコリンに加えます。</li>
		<li>リポソームを氷の上に置き、1秒間のパルス間隔で1分間超音波処理し、1分間一時停止し、溶液が透明な黄色になるまで繰り返します。</li>
		<li>リポソームをアリコートし、液体窒素中で凍結し、使用するまで-80°Cで保存する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>酵素を再活性化します。<ol>
<li><li><li> </li></ol></li><li> </li></ol><ol><li> </li><li> <ol><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></ol></li></ol><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li><li><li> </li><li><li> </li><li><li> </li><li><li></ol><ol><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg"></li><li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg"> </li><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg"> </li></ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここでは、Vidilaserisら14に基づく96ウェルプレート形式のT.マリティマからの膜結合ピロホスファターゼの阻害剤の簡易スクリーニングに関する詳細なプロトコルを報告する。このプロトコルは安価であり、酸性条件下でオルトリン酸およびモリブデン酸から形成され、明確な青色12を有するホスホモリスブデン種に還元される12-ホスホモリブデン酸に基づいている。この方法は、より感受性の高いマラカイトグリーンアッセイ16のような他のプロトコルよりも好ましいが、この方法は、TmPPase再活性化14に必要とされる高リン脂質濃度の存在下での干渉を示さないからである。
スクリーニングプロトコルのワークフローを図1に示し、このプロセスを1時間で完全に達成することができます。このプロトコルは71 °Cおよび5分の反応時間の最適の働く温度...

全細胞タンパク質の約25%が膜タンパク質であり、その約60%が薬物標的1、2である。潜在的な薬物標的の1つは、膜結合ピロホスファターゼ(mPPPases)であり、ピロリン酸の加水分解によって膜全体にプロトンおよび/またはナトリウムイオンをポンプする二量体酵素である。mPPPPアーゼは、細菌、古細菌、植物、およびプロティスト寄生虫などの様々な生物5で見つけることができ、ヒトおよび動物4を除く。プロトイスト寄生虫では、例えば熱帯熱マラリア原虫、トキソプラズマゴンディおよびトリパノソーマ・ブルシは、寄生虫におけるこの発現のノックアウトに必須であり、外部塩基性pH7への曝露時に細胞内pHを維持する失敗につながる。脊椎動物に存在する相同タンパク質の重要性と欠如のために、mPPPPアーゼは、前駆疾患の潜在的な薬物標的として考えることができる3.
本研究におけるmPPPase阻害剤のインビトロスクリーニングは、TmPPPeモデルシステムに基づいている。TmPPPaseは、T.マリティマ由来のナトリウムイオンポンピングおよびカリウムイオン依存性mPPPaseであり、71°C8で最適な活性を有する。この酵素の利点は、例えば、生産および精製の容易さ、良好な熱安定性および高い特異的活性である。TmPPPeは、位置の完全な保存に加えて、プロティストmPPPass3、9およびヴィニャラジエタ10mPPPPPの解決構造に対する全ての触媒残基の同一性に加えて、高い類似性を示す。異なる立体構造のTmPPeの利用可能な構造は、構造ベースの薬物設計実験(仮想スクリーニングおよびde novo設計として)にも有用である。
ここでは、96ウェルプレート形式でTmPPPe阻害剤をスクリーニングするための詳細なプロトコルを報告する(図1)。このプロトコルは、フィスケとSubbarow11によって最初に開発されたモリブデンブルー反応の比色法に基づいている。この方法は、酸性条件下でオルトリン酸およびモリブデン酸から12-ホスホモリブデン酸の形成を伴い、その後、特徴的な青色のホスホモリブデン種種12を与えるために減少する。

<table><tbody><tr><td>粘着シールシート</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタモリブデン酸アンモニウム四水和物</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96Well Multidish</td><td>Thermo Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>8ウェルPCRチューブストリップ0.2 ml、キャップなし (120)</td><td>日本遺伝学</td><td>FG-028</td><td></td></tr><tr><td>ドデシルマルトシド(DDM)</td><td>メルフォード</td><td>B2010-100G</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>1009901001</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>メルク</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>イミド二リン酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&α;-ホスファチジルコリン 大豆レシチン</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8147330500</td><td></td></tr><tr><td>マルチプレート 96ウェルPCRプレート</td><td>バイオ・ラッド</td><td>MLL9651</td><td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td>Nepheloskanアセント(タイプ750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンペトリ皿(サイズ150 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 ソフトウェア</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 加熱ブロック</td><td>グラント機器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムメタヒ素</td><td>フィッシャーケミカル</td><td></td><td></td>12897692</tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二塩基性(Pi)</td><td></td>SigmaS0876-1KG<td></td><td></td></tr><tr><td>ピロリン酸ナトリウム二塩基性</td><td>フルーカ</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>フルーカ</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

サーモトガ・マリティマ・メンブレン結合ピロホスファターゼ阻害剤のスクリーニング

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

膜結合性ピロホスファターゼ(mPPPasaas)は、細菌、古細菌、植物、およびプロティスト寄生虫に生じる二量体酵素です。これらのタンパク質は、ピロリン酸を2つのオルトリン酸分子に切断し、これはプロトンおよび/または膜全体をポンプで送り出すナトリウムイオンと結合される。動物やヒトには相同タンパク質が生じないため、mPPPAxは潜在的な薬物標的の設計において良好な候補となる。ここでは、96ウェルプレート系におけるモリブデンブルー反応を利用したmPPPase阻害剤をスクリーニングするための詳細なプロトコルを提示する。熱性細菌サーモトガマリティマ(TmPPPase)のmPPaseをモデル酵素として使用しています。このプロトコルはシンプルで安価で、一貫性のある堅牢な結果を生み出します。アッセイの開始から吸光度測定まで約1時間しかかからない。このアッセイで生成される青色は長期間安定しているため、前のバッチの直後に後続のアッセイを行うことができ、吸光度は後ですべてのバッチに対して一度に測定することができます。このプロトコルの欠点は、手動で行われるため、疲れ果て、ピペットと時間保持の優れたスキルを必要とする可能性が高いことです。さらに、このアッセイで使用されるアルセイン酸クエン酸溶液には、有毒であり、必要な予防措置で取り扱うべきであるアルセイン酸ナトリウムが含まれています。

このプロトコルでは、8つの化合物(1−8)を、パイロホスファターゼの一般的な阻害剤であるIDPとともに陽性対照として試験した(図2A)。各化合物は、三重で3つの異なる濃度(1μM、5μMおよび20μM)で試験した。スクリーニングのワークフローを図1に示し、サンプルおよび試薬の調製から860nmでの吸光度測定までである。
このプロトコルの終わりに、溶液A+Bおよびアルセニトクエン酸塩を添加した後、溶液は、観察することができるモリブデン酸を有するリン酸イオンの複雑な形成に起因する709 nmおよび860nm14で最大吸収を有する安定な青色を開発し、酵素反応の発生を示す。この実験では、709nm15での吸光度に比べて検出限界や感度が高く、放出されるPi量の測定に860nmでの吸光度を用いた。青色は室温で30分のインキュベーションで完全に発達し、少なくとも...

ここでは、96ウェルプレート形式のモリブデンブルー反応に基づく膜結合ピロホスファターゼ(サーモトガマリティマ由来)阻害剤のスクリーニング方法を提示する。

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

我々のプロトコルは、膜結合パイロホスファターゼの脱活性を阻害する化合物を見つけるためのツールとして機能します。そして、この阻害剤は、いくつかの寄生虫病の治療に使用され得る。このプロトコルは、酵素再活性化に必要な高リン脂質濃度の存在下で干渉を示すことなく、長い時間のための安定した色を生成する安価で簡単です。再活性化緩衝液10ミリリットルを調製し、PH6.5で20ミリモルM-E-S、体積グリセロールで3.5%容量、2ミリモルD-T-T、および0.05%D-D-Mを含む。反応ミキサー10ミリリットルを調製し、200ミリモルトリス塩酸塩をPH8で含有する。8ミリモル塩化マグネシウム、333ミリモル塩化カリウム、および67ミリモル塩化ナトリウム。酵素の再活性化のためにミリリットルリポソームあたり30ミリグラムを調製する。まず、10ミリリットルの塩酸トリトリモルをPH 8で加え、大豆から0.3グラムのLアルファホスファチジルコリンを1ミリモルD-T-Tで加える。リポソームを氷の上に置き、1秒間のポストインターバルで1分間超音波処理します。1 分間一時停止し、透明な黄色になるまで繰り返します。アリコート100マイクロリットルのリポソームは、液体窒素を凍結し、使用されるまでマイナス80°Cで保存します。酵素を再活性化するには、リポソーム溶液を室温で解凍する。リポソーム溶液40マイクロリットルを20%D-Mの22.5マイクロリットルと混合します。55°Cで15分間保持します。そして、室温まで冷却することができます。次いで、36.5マイクロリットルの再活性化緩衝液を加える。混合し、1ミリリットルあたり0.13ミリグラムの総濃度を作るために濃縮タンパク質の1マイクロリットルを追加します。次に、再活性化酵素の20マイクロリットルを反応混合物の1480マイクロリットルに移す。やさしく混ぜてすぐに使います。まず、化合物をD-M-S-Oに溶解し、200マイクロリットルで50ミリモルのストック溶液を作ります。可溶性化合物の場合は、水でストック溶液をマイクロチューブで1ミリリットルに希釈し、2、10、および100マイクロモルを与える。各希釈について、適切な混合のための化合物溶液を渦液。その後、化合物の発散を確認し、マルチチャネルピペットを使用して、反応混合物の75マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに分配します。各化合物と水の75マイクロリットルを三重でコントロールし、上下に5回ピペットで混ぜます。マイクロプレートのネフェロメーターを使用して、300ボルトで各ウェルを測定します。クエン酸アルセイン酸溶液を調製するために、アルセイン酸ナトリウム5グラムとクエン酸二水酸三ナトリウム5グラムを重み、両方の化合物を100ミリリットルの水に溶解する。次に、5ミリリットルの氷酢酸を加えます。混合し、250ミリリットルに水を追加し、光から保護された室温で保存します。次に、氷冷0.5モル塩酸を0.3グラムのアスコルビン酸に10ミリリットル加えて溶液Aを調製し、アスコルビン酸をボルテックスで溶解する。テトラヒドレートアンモニウム四元水性化物の70ミリグラムに氷冷水1ミリリットルを加えて溶液Bを調製し、渦を溶解させる。溶液AとBを氷の上に保管してください。濃度0、62.5、250、500マイクロモルをキャリブレーション用にリン酸標準を調製した。反応混合物の370マイクロリットルを含む4つのマイクロチューブに、ゼロマイクロリットル、12.5マイクロリットル、50マイクロリットル、および5ミリモルリン酸二ナトリウム二水和物の100マイクロリットルを加えます。水で1ミリリットルまで上げる。次に、溶液Bの1ミリリットルを10ミリリットルの溶液Aに加え、手で混ぜて氷の上に保存します。マルチチャンネルパイプを使用して、40マイクロリットルのゼロ、62.5、250、500マイクロモルリン酸塩規格を3重のチューブスクリプトに追加します。次に、化合物溶液25マイクロリットルと各チューブのM-P-P-A溶液混合物15マイクロリットルを加えます。リン酸塩標準を含む管を除く。粘着シールシートでチューブストリップを密封します。各チューブストリップを分離するためにシールシートをカットします。次に、サンプルを摂氏71度で5分間事前にインキュベートします。各ストリップ間の20秒間隔で加熱ブロックにサンプルを置きます。各ストリップに対して、接着剤シールを開きます。マルチチャネルピペレットを使用して、ピロリン酸二塩基ナトリウム2モルの100マイクロリットルを加えます。そして、5回上下にピペットで混ぜます。同じシールを使用して、チューブストリップを再び密封します。摂氏71度で再び5分間インキュベートします。その後、各ストリップ間の間隔20秒で冷却装置上にサンプルを置く。5分間冷ましてから、各ストリップを遠心分離して、シーリングシートの下に滴を落とします。ストリップを冷却装置に戻し、シールを取り外し、さらに5分間冷却します。その後、60マイクロリットルの溶液AとBを加え、上下にピペットして5回混合し、チューブストリップを冷却装置に10分間保持します。ヒュームフードに、90マイクロリットルのアルセインクエン酸溶液を加え、室温で最低30分間保ちます。安定した青の色を作り出す。各反応混合物の180マイクロリットルを透明な96ウェルポリスチレンマイクロプレートに分配する。マイクロプレート分光光度計を使用して、各ウェルの吸光度を860ナノメートルで測定します。このプロトコルでは、8つの化合物を、ピロホスファターゼの一般的な阻害剤であるI-D-Pと共に陽性対照として試験した。溶液A及びBを添加した後、クエン酸のアルセイン酸塩と、室温で30分間のインキュベーションで青色を示す。非阻害化合物の3つの濃度すべて、同じ青色の色強度を示した。阻害剤を含まずにE-1からE-3に対しても。試験した各化合物の濃度に対する酵素活性のプロットは、阻害活性を有する化合物が非線形曲線フィッティングを形成したことを示す。正の対照としてのI-D-Pのプロットは、より高い濃度での活性の低下を明らかに示す。化合物1、5、6、7、および8の阻害曲線。1.7マイクロモル、21.4マイクロモル、58.8マイクロモル、239.0マイクロモル、および500マイクロモルを超える200マイクロモルで、半分の最大阻害濃度を示す。M-P-P-Aソリューションを準備することを忘れないでください。アッセイの始まり直前。

screening-for-thermotoga-maritima-membrane-bound-pyrophosphatase

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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本レポートは、リーシュマニア細胞抽出物を使用してホスファチジルエタノールアミンメチルトランスフェラーゼ活性を測定するためのin vitro酵素アッセイについて説明しています。このアッセイは、S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionineから内因性ホスファチジルエタノールアミンへの放射性メチル基の移動に基づいています。...

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

この研究は、理論的には200以上の酵素に適用できる普遍的な遺伝的酵素スクリーニングシステムを使用したハイスループットスクリーニングの方法を提示しています。ここでは、シングルスクリーニングシステムで、使用する基質(p-ニトロフェニルアセテート、p-ニトロフェニル-β-D-セロビオシド、およびフェニルリン酸)を変更するだけで、3つの異なる酵素(リパーゼ、セルラーゼ、アルカリホスファターゼ)を同定します。...

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

転写因子(TF)DNA結合に影響を与える非コード遺伝的変異を特定するための戦略的な計画とプロトコルを提示します。遺伝子型依存性TF...

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

Toll様受容体（TLR）シグナル伝達は、多くのヒト炎症性疾患の病態生理学において重要な役割を果たし、生物活性ナノ粒子によるTLR応答の調節は、多くの炎症状態において有益であると予想される。 THP-1細胞ベースのレポーター細胞は、TLRシグナル伝達の新規インヒビターを同定するための多目的で堅牢なスクリーニングプラットフォームを提供する。...

トール様受容体シグナル伝達の阻害剤に対する食作用性免疫細胞における生物活性ナノ粒子のスクリーニング

このプロトコルは、構造レベルでTmPep1050、M42アミノペプチダーゼのダイマー-ドデカマー転移を研究するために開発されました。タンパク質精製からX線データ処理まで、簡単なパイプラインです。結晶生成、データセットインデックス化、および分子置換は、研究の場合、TmPep1050H60A H307A...

X線結晶学は 、熱利子マリティマ M42アミノペプチダーゼTmPepT050のオリゴマー状態推移を研究する

無傷の細胞における候補阻害剤による標的関与を評価する能力は、創薬にとって極めて重要である。このプロトコルは、野生型SHP2またはその発癌性変異体を標的とする阻害剤の細胞標的関与を確実に検出する384ウェルフォーマットの細胞熱シフトアッセイについて説明する。...

SHP2(PTPN11)ホスファターゼ阻害剤による細胞標的関与の評価

DNAメチルトランスフェラーゼは、潜在的な抗がん剤標的です。ここでは、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害について低分子を評価するためのプロトコルが提示されています。このアッセイでは、エンドヌクレアーゼを利用してDNAメチル化と蛍光生成を結合させ、酵素活性をリアルタイムでモニタリングすることができます。...

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

このプロトコルは、タンパク質合成における天然産物/小分子阻害剤の特定に最適化されたフルオロメトリックスクリーニング手法を導入します。その実用性から、学部生向けの創薬技術教育や医薬品化学キャンペーンへの応用に適しています。...

天然由来のタンパク質合成阻害剤の予備スクリーニングのための蛍光ベースのプロトコル

学ぶサーモトガ・マリティマの膜結合ピロホスファターゼ阻害剤スクリーニング法。モリブデンブルー反応を用いた安価で安定した96ウェルプレート形式の手法により、寄生虫病治療薬の発見に貢献します。

サーモトガ・マリティマ・メンブレン結合ピロホスファターゼ阻害剤のスクリーニング

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