Name: ラットにおけるモノヨードアセテートの関節内注射により誘発される変形性関節症疼痛モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶラットの膝関節内モノヨードアセテート注射法による変形性関節症疼痛モデルの構築と評価。疼痛関連行動と組織病理学的変化を測定し、鎮痛薬開発の再現性ある基盤を提供する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、中国浙江省自然科学財団(助成金番号:LY17H270016)、中国国家自然科学財団(助成金番号:81774331、81873049、および81673997)、および浙江省中国伝統中国医学科学技術プロジェクト(助成金番号:2013ZQ007および2016ZZ011)から資金提供を受けました。

動物を対象とする手順は、浙江中国医科大学の医療規範および倫理委員会によって承認されており、実験動物の使用と世話に関する中国の法律に準拠しています。
1.膝へのモノヨードアセテートの関節内注射
<ol><li>1週間の順応後、体重180〜200 g(4〜5週齢)の雄のSprague-Dawleyラット40匹をランダムかつ均等に4つのグループ(n = 10匹/グループ)に分けます。. 注:対照群のラットは関節内注射されます 50μLの生理食塩水、実験群のラットは0.5、1.5、または3mgのMIAで治療されます それぞれ50μLの生理食塩水に溶解しました。</li>
	<li>注射当日、15、30、60 mg / mL濃度の滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)中のMIA溶液と、滅菌生理食塩水(0.9%NaCl)中の10%ペントバルビタール溶液を新たに調製します。 注意:MIAは、粘膜、上気道、眼、皮膚、その他の組織に非常に破壊的な影響を及ぼします。したがって、溶液を調製するときはマスクと手袋をお勧めします。</li>
	<li>60 mg / kgのケタミンと5 mg / kgのキシラジン(どちらも生理食塩水で調製)の腹腔内注射によってラットを麻酔します。.ラットのつま先をピンセットでそっと固定して麻酔を確認します。</li>
	<li>ラットを背中を下に向けて置きます。膝を剃り、膝関節の周囲をアルコールで拭きます。</li>
	<li>膝を90°の角度に保ち、膝蓋骨の下の白い膝蓋骨腱を明らかにします。膝蓋骨腱を指先で押して、膝蓋骨の下の隙間を見つけます。</li>
	<li>注入部位としてギャップと外側膝蓋腱の接合部を選択します。次に、26Gの針を約5mmの部位に垂直に挿入します。針が関節腔にあるときは抵抗を感じないでください。 注意: 針を注射部位に対して垂直に保つことが重要です。</li>
	<li>50 μLの生理食塩水またはMIA溶液を関節腔に注入します。ゆっくりと針を引き出し、逆流と漏れを最小限に抑えるために注射部位にガーゼを巻き付けます。麻酔が回復したら、ガーゼを外します。</li>
	<li>セクション2で説明されているように、注射後1、7、14、21、28、および35日目に痛みに関連する行動をテストします。</li>
</ol>2.行動評価
<ol><li>機械的引き出ししきい値(MWT) 注:MWTはフォンフライテスト13 によって測定され、観察者は動物が受けた注射を知らされていませんでした。<ol><li>ラットを、テーブルから50 cm上に吊り下げられた金網のベースを備えた高架プラスチックケージ(17 cm x 11 cm x 13 cm)に入れます。テスト環境が静かであることを確認し、ラットに環境に適応するために30分を与えます。</li>
		<li>フォンフレイ針を各ラットの後足の足底面に垂直に押します。足の持ち上げまたは足の舐めが発生するまで、圧力を徐々に(約20 g / s)直線的に上げます。</li>
		<li>前のしきい値よりも低い力を使用して、しきい値が最小の撤退力であることを確認します。各ラットを少なくとも3〜5分間隔で3回以上テストします。</li>
		<li>足の離脱反射を誘発する最小の力を記録します。ラットのMWTとしてデータを平均します。</li>
	</ol></li>
	<li>熱離脱遅延 (TWL) 注:TWLは足底試験装置(材料表)を使用して測定され、観察者は動物が受けた注射を知らされていませんでした。<ol><li>プレキシガラスの箱(60 cm x 20 cm x 14 cm、6つのコンパートメントに分けて)を厚さ3 mmのガラス板に置き、ラットを箱に入れます(各コンパートメントに1つずつ)。環境が静かで、室温が一定であることを確認してください。</li>
		<li>テスト環境に適応するためにラットに30分を与えます。</li>
		<li>赤外線放射計を介して熱刺激を校正します。希望の赤外線強度を70単位に設定します。</li>
		<li>赤外線エミッター/検出器を、テストする足の中央の真下の容器に置きます。</li>
		<li>スタートボタンを押します。タイマーが自動的に開始されます。コントローラーは、足の動きが発生するとすぐに赤外線を自動的にオフにし、タイマーを完全に停止します。</li>
		<li>足の撤退と足の舐めの出現時の反応時間を記録します。 注:テストの肯定的な反応は、足の撤退と足の舐めと見なされます。足の離脱のみが起こる場合、それは肯定的な反応ではなくラットの随意運動と見なされるべきです。</li>
		<li>テストを3回以上繰り返します。ラットのTWLとしてデータを平均します。 注意: 輻射熱の各暴露は20秒を超えてはなりません。同じ後足での赤外線刺激は、少なくとも3〜5分離れている必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>歩行パターン分析 注:歩行パターン分析はイメージングシステム(材料表)を使用して測定され、観察者は動物が受けた注射を知らされていませんでした。<ol><li>歩行コンパートメントの両端にあるノブを使用して、ウォーキングコンパートメントの長さをラットに適した長さ(61 cmなど)に調整します。</li>
		<li>ラットを歩行コンパートメントに入れ、正式な実験の前に、18 cm / sの速度で少なくとも5ステップサイクル中断することなく走るようにラットを訓練します。 注:ラットを最初に歩行コンパートメントに配置すると、速度は約20 cm / sに設定され、約2秒走るときに停止できます。次に、速度を18 cm / sに設定します。ラットが歩行中に一時停止または後退する場合は、パーティションでラットの背中をそっとタップします。速度を18 cm / sから10 cm / sに徐々に下げてみてください。ラットが最終的にテストを実行できない場合は、テスト用に別のラットを選択することが許容されます。</li>
		<li>トレッドミルが目標速度(18 cm / s)に達するまで、トレッドミルの速度をゆっくりと上げます。透明なトレッドミルベルトの下に取り付けられた高速デジタルビデオカメラを使用して、ラットの連続的な動きの少なくとも5秒のビデオをキャプチャします。</li>
		<li>各ラットを少なくとも5分間隔でテストして、少なくとも3回の中断のない実行を取得します。</li>
		<li>「バウンディングボックス」を描画して、イメージングソフトウェアで動物の散歩画像の境界を定義し、各ビデオの実行速度を入力します。ビデオをグループとして選択し、ソフトウェアによってビデオを自動的に処理します。ビデオを処理した後、ソフトウェアはいくつかのスプレッドシートを出力して、スタンス、スイング、ブレーキ、推進力、ケイデンス、ステップシーケンスなどの歩行インデックスを報告します。</li>
		<li>総足面積(cm2)、平均歩幅(cm)、および歩幅を結合します。 注:総足面積は、ラットの各グループの4つの足の総面積の平均であり、足面積は、ステップサイクルのスタンスフェーズ中にトレッドミルと接触する最大足面積として定義されます。ストライドの長さは、1つの完全なストライドにおける同じ足の最初の接触間の距離です。単位歩幅=平均歩幅(cm)/体長(cm)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 病理組織学的・免疫組織化学的解析
<ol><li>ペントバルビタールナトリウムを150 mg / kg(生理食塩水で調製)で腹腔内注射することにより、ラットを安楽死させます。.組織学的分析のためにすぐに膝関節を切除します。</li>
	<li>関節を10%ホルマリンで24時間固定し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の10%EDTAで8週間脱灰してから、関節をパラフィンに埋め込みます。 注意: ホルマリンは、目、皮膚、気道の炎症を引き起こす可能性があります。.フードで取り扱う必要があります。</li>
	<li>パラフィン包埋接合部をミクロトームで厚さ3 mmで切片化し、蒸留水を入れた40°Cの水浴に浮かべます。</li>
	<li>セクションをスライドガラスに移します。スライドを一晩乾燥させ、スライドを室温(RT)で保存して、次の染色を継続します。</li>
	<li>スライドを60°Cのオーブンに4時間入れて脱パラフィンします。</li>
	<li>スライドをキシレン、キシレン、100%エタノール、100%エタノール、95%エタノール、80%エタノール、75%エタノールにそれぞれRTで5分間連続して浸します。</li>
	<li>ステップ3.8−3.12に記載されているように、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)、サフラニン-O(SO)およびアルシアンブルーヘマトキシリン(ABH)、ならびにラットII型コラーゲン(Col2)、X型コラーゲン(Col10)およびマトリックスメタロプロテイナーゼ13(MMP13)に対する抗体で切片を染色する。</li>
	<li>H&E染色<ol><li>スライドを脱イオンH2Oで3分間すすぎます。スライドをヘマトキシリンで3〜5分間染色します。</li>
		<li>ヘマトキシリンが表面に残らなくなるまで、脱イオンH2O 3xでそれぞれ1分間すすぎます。</li>
		<li>スライドをエオジンで30秒間染色します。次に、表面にエオジンが残らなくなるまで、脱イオンH2O 3xでそれぞれ1分間スライドします。</li>
		<li>スライドを0.1%アンモニアに10〜20秒間浸します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。</li>
		<li>スライドを95%エタノール、100%エタノール、キシレン、キシレン、キシレンにそれぞれ1分間連続して浸します。</li>
		<li>スライドを中性樹脂で覆います。</li>
	</ol></li>
	<li>SO染色<ol><li>スライドを脱イオンH2Oで3分間すすぎます。スライドをヘマトキシリンで3〜5分間染色します。</li>
		<li>1%酸性アルコール(約3秒)ですばやく区別します。次に、ヘマトキシリンが表面に残らなくなるまで、脱イオンH2O 3xでそれぞれ1分間スライドします。</li>
		<li>スライドをファストグリーン(FCF)溶液で5分間染色します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。</li>
		<li>スライドをSOで1〜2分間染色します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。</li>
		<li>スライドを1%酢酸で1〜2分間すすぎ、残留FCFを除去します。スライドを脱イオンH2Oで1分間すすぎます。</li>
		<li>スライドを95%エタノール、100%エタノール、キシレン、キシレン、キシレンにそれぞれ1分間連続して浸します。</li>
		<li>スライドを中性樹脂で覆います。</li>
	</ol></li>
	<li>ABH染色<ol><li>スライドを脱イオンH2Oで3分間すすぎます。スライドを1%酸性アルコールに30秒間浸し、ペーパータオルで簡単に水気を切ります(すすがないでください)。</li>
		<li>スライドをABHに1時間浸します。次に、ABHが表面に残らなくなるまで、脱イオンH2O3xでスライドをそれぞれ1分間すすぎます。</li>
		<li>1%酸性アルコール(約3秒)ですばやく区別します。スライドを脱イオンH2O 3x、それぞれ1分間すすぎます。</li>
		<li>スライドを0.5%アンモニウム水に15秒間浸します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。</li>
		<li>スライドを95%エタノールに1分間浸します。スライドをエオシン/オレンジG溶液に1.5分間浸します。</li>
		<li>スライドを95%エタノール、100%エタノール、キシレン、キシレン、キシレンにそれぞれ1分間連続して浸します。</li>
		<li>スライドを中性樹脂で覆います。</li>
	</ol></li>
	<li>すべてのスライドを顕微鏡で調べ、マンキンのスコアリングシステム14に従って、二重盲検観察によって0〜13のスケールで統計的に等級付けします。</li>
	<li>免疫組織化学<ol><li>スライドを脱イオンH2Oで3分間すすぎます。</li>
		<li>スライドを0.1 Mクエン酸ナトリウムに浸し、スライドを60°Cのオーブンに4時間入れて抗原を回収します。</li>
		<li>スライドをPBSの0.3%トリトンX-100に10分間浸します。次に、スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。</li>
		<li>RTのメタノール中の3%H2 O2溶液中で切片を10分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断します。スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。</li>
		<li>切片をPBS中の5%ヤギ血清でRTで30分間インキュベートし、非特異的結合をブロックします。スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。</li>
		<li>ラットII型コラーゲン(Col2)、X型コラーゲン(Col10)、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ13(MMP13)に対する100 μLのPBS希釈(1:1,000)一次抗体を用いて、切片を4°Cで一晩インキュベートします。スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。</li>
		<li>100 μLのPBS希釈(1:1,000)二次抗体(ヤギ抗マウス二次抗体またはヤギ抗マウス二次抗体)で切片をRTで20分間インキュベートします。 スライドをPBSで2回、それぞれ3分間すすぎます。</li>
		<li>切片を100 μLの3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)作業溶液でインキュベートします。発色反応がエピトープ部位を茶色に変えるので、反応を監視します。 注意:DABは発がん性物質です。DABを使用するときは、常に手袋を着用し、フードをかぶって作業してください。 注意: 発色の時間は数秒から10分までさまざまです。</li>
		<li>切片に茶色が発達したらすぐに、脱イオンH2O 2x、それぞれ3分でスライドをすすぎます。</li>
		<li>スライドをヘマトキシリンに1〜2分間浸して、スライドを対比染色します。次に、スライドを脱イオンH2O3xでそれぞれ1分間すすぎます。</li>
		<li>スライドを95%エタノール、100%エタノール、キシレン、キシレン、キシレンにそれぞれ1分間連続して浸します。</li>
		<li>スライドを中性樹脂で覆います。</li>
		<li>切片の抗体染色の色を顕微鏡で観察します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+individual+and+socioeconomic+impact+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 437-441 (2014).</li>
<li>Neogi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+and+impact+of+pain+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The epidemiology and impact of pain in osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 21 (9), 1145-1153 (2013).</li>
<li>Teeple, E., Jay, G. D., Elsaid, K. A., Fleming, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+osteoarthritis%3A+challenges+of+model+selection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Animal models of osteoarthritis: challenges of model selection and analysis.</a> AAPS Journal. 15 (2), 438-446 (2013).</li>
<li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+major+musculoskeletal+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bulletin of the World Health Organization. 81 (9), 646-656 (2003).</li>
<li>Bijlsma, J. W., Berenbaum, F., Lafeber, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+an+update+with+relevance+for+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: an update with relevance for clinical practice.</a> Lancet. 377 (9783), 2115-2126 (2011).</li>
<li>McCoy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Osteoarthritis%3A+Comparisons+and+Key+Considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Osteoarthritis: Comparisons and Key Considerations.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 803-818 (2015).</li>
<li>O'Neill, T. W., Felson, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Osteoarthritis+%28OA%29+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Osteoarthritis (OA) Pain.</a> Current Osteoporosis Reports. 16 (5), 611-616 (2018).</li>
<li>Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+osteoarthritis%3A+classification%2C+update%2C+and+measurement+of+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of osteoarthritis: classification, update, and measurement of outcomes.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, 19(2016).</li>
<li>Takahashi, I., Matsuzaki, T., Hoso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+histopathological+developments+in+knee-joint+components+in+a+rat+model+of+osteoarthritis+induced+by+monosodium+iodoacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Therapy+Science%22%5BJournal%5D)">Long-term histopathological developments in knee-joint components in a rat model of osteoarthritis induced by monosodium iodoacetate.</a> Journal of Physical Therapy Science. 29 (4), 590-597 (2017).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+pain+in+the+MIA+model+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Ongoing pain in the MIA model of osteoarthritis.</a> Neuroscience Letters. 493 (3), 72-75 (2011).</li>
<li>Combe, R., Bramwell, S., Field, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monosodium+iodoacetate+model+of+osteoarthritis%3A+a+model+of+chronic+nociceptive+pain+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">The monosodium iodoacetate model of osteoarthritis: a model of chronic nociceptive pain in rats.</a> Neuroscience Letters. 370 (2-3), 236-240 (2004).</li>
<li>Pomonis, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+pharmacological+characterization+of+a+rat+model+of+osteoarthritis+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Development and pharmacological characterization of a rat model of osteoarthritis pain.</a> Pain. 114 (3), 339-346 (2005).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Mankin, H. J., Dorfman, H., Lippiello, L., Zarins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+metabolic+abnormalities+in+articular+cartilage+from+osteo-arthritic+human+hips.+II.+Correlation+of+morphology+with+biochemical+and+metabolic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery%22%5BJournal%5D)">Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data.</a> Journal of Bone and Joint Surgery. 53 (3), 523-537 (1971).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroprotective+effects+of+platelet+lysate+towards+monoiodoacetate-induced+arthritis+by+suppression+of+TNF-%CE%B1-induced+activation+of+NF-%C4%B8B+pathway+in+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Chondroprotective effects of platelet lysate towards monoiodoacetate-induced arthritis by suppression of TNF-α-induced activation of NF-ĸB pathway in chondrocytes.</a> Aging. 11 (9), 2797-2811 (2019).</li>
<li>Yan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-Articular+Injection+of+Extract+Attenuates+Pain+Behavior+and+Cartilage+Degeneration+in+Mono-Iodoacetate+Induced+Osteoarthritic+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intra-Articular Injection of Extract Attenuates Pain Behavior and Cartilage Degeneration in Mono-Iodoacetate Induced Osteoarthritic Rats.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 1360(2018).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agkistrodon+ameliorates+pain+response+and+prevents+cartilage+degradation+in+monosodium+iodoacetate-induced+osteoarthritic+rats+by+inhibiting+chondrocyte+hypertrophy+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Agkistrodon ameliorates pain response and prevents cartilage degradation in monosodium iodoacetate-induced osteoarthritic rats by inhibiting chondrocyte hypertrophy and apoptosis.</a> Journal of Ethnopharmacology. 231, 545-554 (2019).</li>
<li>Yamada, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+monosodium+iodoacetate+dosage+to+induce+knee+osteoarthritis%3A+Relation+with+oxidative+stress+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of monosodium iodoacetate dosage to induce knee osteoarthritis: Relation with oxidative stress and pain.</a> International Journal of Rheumatic Diseases. 22 (3), 399-410 (2019).</li>
<li>Schuelert, N., McDougall, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+evidence+that+the+vasoactive+intestinal+peptide+receptor+antagonist+VIP6-28+reduces+nociception+in+an+animal+model+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological evidence that the vasoactive intestinal peptide receptor antagonist VIP6-28 reduces nociception in an animal model of osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14 (11), 1155-1162 (2006).</li>
<li>Lee, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choline%2C+an+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+agonist%2C+alleviates+hyperalgesia+in+a+rat+osteoarthritis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Choline, an alpha7 nicotinic acetylcholine receptor agonist, alleviates hyperalgesia in a rat osteoarthritis model.</a> Neuroscience Letters. 548, 291-295 (2013).</li>
<li>Piesla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+gait%2C+due+to+inflammation+but+not+nerve+injury%2C+reflects+enhanced+nociception+in+preclinical+pain+models%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal gait, due to inflammation but not nerve injury, reflects enhanced nociception in preclinical pain models.</a> Brain Research. 1295, 89-98 (2009).</li>
<li>Udo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoiodoacetic+acid+induces+arthritis+and+synovitis+in+rats+in+a+dose-+and+time-dependent+manner%3A+proposed+model-specific+scoring+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Monoiodoacetic acid induces arthritis and synovitis in rats in a dose- and time-dependent manner: proposed model-specific scoring systems.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1284-1291 (2016).</li>
<li>Guingamp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-iodoacetate-induced+experimental+osteoarthritis%3A+a+dose-response+study+of+loss+of+mobility%2C+morphology%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Mono-iodoacetate-induced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry.</a> Arthritis & Rheumatism. 40 (9), 1670-1679 (1997).</li>
<li>Jeong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eupatilin+Exerts+Antinociceptive+and+Chondroprotective+Properties+in+a+Rat+Model+of+Osteoarthritis+by+Downregulating+Oxidative+Damage+and+Catabolic+Activity+in+Chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0130882(2015).</li>
<li>Cook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+%26+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of cartilage repair.</a> Bone & Joint Research. 3 (4), 89-94 (2014).</li>
<li>Little, C. B., Zaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+constitutes+an+%22animal+model+of+osteoarthritis%22--the+need+for+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

MIAによって誘発されるOAのラットモデルは、十分に確立され、広く使用されているモデルです。MIAの関節内注射は、最初に重度で急性の炎症を引き起こし、OA17,18のより長く変性段階を引き起こします。本研究では、MWTとTWLによる侵害受容感度を測定し、イメージングシステムで歩行変化を評価しました。以前の報告では、MIAの注射が求心性膝関節線維の感受性を高め、侵害受容につながる可能性があり、これは熱痛覚過敏と機械的閾値の低下に反映されています19,20。歩行の変化が侵害受容の増強に関連していることが証明されており、歩行パターンを使用して疼痛モデルを評価することができることが示唆されています21。したがって、MIA誘発モデルは、主にOA関連の痛みを評価し、経口薬と関節注射薬をスクリーニングするために使用されます<...

変形性関節症(OA)は世界で最も一般的な関節疾患であり、成人の推定10〜12%の人口に影響を及ぼします1。最も一般的に関与する関節は膝であり、OAは高齢者、特に女性の発生率が高くなっています2。慢性疾患として、OAは数十年にわたって徐々に進行し、軟骨喪失、滑膜炎症、骨植物症、機能低下、慢性疼痛などの症状を伴う関節不全に発展します3。世界保健機関(WHO)によると、OAは女性で4番目に蔓延している病気であり、男性で8番目に蔓延している病気です。2020年までに、OAはヒトで4番目に障害のある病気になる可能性があります4。しかし、現在利用可能なOA療法は症状のみに対処し、関節置換術までの時間を延長します5。
ヒト患者の自発的OAは、関節関連疼痛などの臨床症状を引き起こすのに長い時間がかかることが多い6。OAの初期段階では、痛みは通常断続的であり、病気が進行するにつれてより頻繁かつ重篤になり、患者の主な不満になります7。そのため、疼痛緩和療法を促進するために、過去半世紀にわたってOA疼痛の広範な動物モデルが開発されてきました。OAモデルは、古典的に自発モデルと誘発モデルに分けられてきた。自発的モデルには、自然発生モデルと遺伝子組み換えモデルが含まれ、ヒトの一次OAの経過をより厳密にシミュレートできます8。誘発モデルは、一般に2つのカテゴリーに分けることができる:1)手術または他の外傷によって誘発される心的外傷後OA;または2)軟骨毒性または炎症誘発性物質の関節内注射3。これらのモデルはOAの病態生理学的研究の基礎を築き、疼痛軽減や機能向上のための薬剤開発に大きく貢献しています。
最近、OAモデリングに最も広く使用されている誘導物質はモノヨードアセテート(MIA)です。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であるMIAは、軟骨基質の変化、分解、軟骨の喪失、滑膜炎、およびヒト変形性関節症の病理学的変化と同様のその他の変化を引き起こす可能性があります9。MIAの関節内注射は、MIA投与後28日目に継続的な疼痛を誘発したことが注目されており、MIAモデルが慢性侵害受容性疼痛の調査に有用である可能性があることを示している10、11、12。この研究では、雄のSprague-Dawleyラットは、膝関節に0.5、1.5、または3 mgのMIAを含む関節内注射を受けました。MIA誘発性関節痛の重症度は、注射後1、7、14、21、28、および35日目の機械的および熱的感受性の評価によって測定されました。これに基づいて、注射後28日目の歩行パターンと組織学的変化を評価するための最終濃度として1.5 mgのMIAが選択されました。

<table><tbody><tr><td>抗コラーゲンII抗体</td><td>アブカム(英国)</td><td>34712</td><td>免疫組織化学(IHC)用一次抗体</td></tr>抗<tr><td>コラーゲンX(Col10)抗体</td><td>アブカム(英国)</td><td>49945</td><td>IHC</td></tr><tr><td>DigiGait Imaging System</td><td>Mouse Specifics(米国マサチューセッツ州ボストン)</td><td></td><td>歩行パターン分析用機器</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861006</td><td>HE用色素染色</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>SO染色用色素</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス抗体</td><td>ZSGQ-BIO (中国・北京)</td><td>PV-9002</td><td>IHC</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ抗体</td><td>ZSGQ-BIO (中国・北京)</td><td>PV-9001</td><td>IHC</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3163</td><td>HE染色</td></tr><tr>用色素<td>MIA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>粉末</td></tr><tr><td>MMP13</td><td>Cell Signaling Technology, Inc. (米国マサチューセッツ州ダンバース)</td><td>69926</td><td>IHC 用一次抗体</td></tr><tr><td>モジュール式組織包埋センター</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>EC 350</td><td>パラフィンブロックを作製します。</td></tr><tr><td>足底検査装置</td><td>UgoBasile(イタリア)</td><td>37370</td><td>TWLアッセイ用機器</td></tr><tr><td>PrimeScript RT試薬キット(パーフェクトリアルタイム)</td><td>TaKaRa Biotechnology Co. Ltd.(大連、中国)</td><td>RR037A</td><td>培養細胞から全RNAを抽出</td></tr><tr><td>ロータリーおよびスライディングミクロトーム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国)</td><td>HM325</td><td>精密なパラフィン切片。</td></tr><tr><td>Safranin-O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2255</td><td>SO染色用色素</td></tr><tr><td>-Tek VIP 5 Jr</td><td>Sakura (Japan)</td><td></td><td>真空浸透プロセッサ</td></tr></tbody></table>

ラットにおけるモノヨードアセテートの関節内注射により誘発される変形性関節症疼痛モデル

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

変形性関節症(OA)の現在の動物モデルは、自発モデルと誘発モデルに分けることができ、どちらもヒトOAの病態生理学的変化をシミュレートすることを目的としています。しかし、OA後期の主な症状として、痛みは患者の日常生活に影響を与え、利用可能なモデルは多くありません。モノヨードアセテート(MIA)誘発モデルは、最も広く使用されているOA疼痛モデルであり、主にげっ歯類で使用されます。MIAはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤であり、軟骨細胞死、軟骨変性、骨棘、および動物の行動の測定可能な変化を引き起こします。さらに、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)および炎症誘発性サイトカイン(IL1 βおよびTNF α)の発現変化は、MIA誘発モデルで検出できます。これらの変化は、ヒトにおけるOA病態生理学的状態と一致しており、MIAが測定可能で成功したOA疼痛モデルを誘発し得ることを示している。この研究は、ラットにおけるMIAの関節内注射の方法論を説明し、結果として生じる痛みに関連する行動と組織病理学的変化について議論することを目的としています。

この方法論を用いて、ラットのOA疼痛モデルを確立し、結果として生じる変化を検出した。MWTおよびTWLは、それぞれ機械的異痛症および熱痛覚過敏を反映した。 図1に示されるように、MIAは、用量依存的に存在する機械的異痛症および熱痛覚過敏を誘発する。驚くべきことに、MWTの減少は21日から28日にかけてピークに達し、その後リバウンドし、この段階で関節修復が起こる可能性があることが示唆されましたが、3 mg MIAグループのMWTはまだ低レベルでした。TWLの変化はMWTとほぼ一致していました(図2)。
これに基づいて、最終用量として1.5 mgのMIAを選択し、注射後28日目の歩行パターンと組織学的変化を評価しました。歩行パラメータ(総足面積と単位歩幅)は、痛みに関連する行動を反映していました。総足面積(図3A)および単位歩幅(図3B)を含む歩行パラメータのレベルは、28日後にMIA群で有意に減少し、<st...

本研究では、ラットにおけるモノヨード酢酸の関節内注射法について述べ、結果として生じる疼痛関連行動および組織病理学的変化について議論し、将来の応用の参考となる。

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

関節内心筋梗塞注射は、痛みに関連する行動に測定可能な変化を引き起こし、モデリングの成功を評価する上で重要な役割を果たします 手順の再現性と時間効率が良い。さらに、加速される用量は、軽い哺乳類と同様に小さく落ちるcontraラベルです。そして、その手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるZuxiang Chenです。麻酔をかけたラットを仰臥位に置き、片方の膝から毛皮を取り除きます。露出した皮膚をアルコールで消毒し、膝を90度の角度で配置して、膝蓋骨の下の白い膝蓋腱を露出させます。膝蓋腱を指先で圧迫し、膝蓋骨の下の隙間を見つけます。そして、針を関節に対して垂直に保持し、ギャップと外側膝蓋腱の接合部に26ゲージの針を挿入します。針が所定の位置にあるとき、針をゆっくりと引っ込める前に、50マイクロリットルのMIA溶液を関節腔に注入します。次に、注入部位にガーゼを巻き付けて、逆流と漏れを最小限に抑えます。注射の1、7、14、21、28、および35日後に、静かな環境で、テーブルの上に50センチメートルの金網のベースを吊り下げた17 x 11 x 13センチメートルのプラスチックに1匹のラットを注射しました。足が持ち上がるか、足を舐めるまで、圧力を徐々に直線的に上げます。足の引き抜きが発生した場合は、前の閾値よりも低い力を使用して、閾値が最小の引き抜き力になるようにします。各ラットが少なくとも4回、少なくとも3〜5分間隔でテストされた場合、足の離脱反射を誘発する最小の力を記録し、データをラットのMWTとして平均化します。TWLをテストするには、60 x 20 x 14センチメートルのプレキシガラスボックスの各コンパートメントに1匹のラットを注射します。温度が一定の静かな部屋に厚さ3mmのガラス板を置き、ラットが試験環境に適応するまで30分間待ちます。オリエンテーション期間の終わりに、赤外線放射計を介して熱刺激を校正し、目的の赤外線強度を70単位に設定します。赤外線エミッター検出器を、テストする足の中央の真下にあるコンテナに置き、スタートを押します。タイマーが自動的に開始されます。足の動きが発生するとすぐに、コントローラーは自動的に赤外線をオフにし、タイマーを停止します。足の引き抜きや足舐めが観察されたときの反応時間を記録します。各ラットについて少なくとも4回テストを繰り返した後、ラットのTWLとしてデータを平均化します。MIA処理ラットのゲートパターンを評価するには、まず歩行コンパートメントの両端にあるノブを使用して、コンパートメントの長さを61センチメートルに調整します。次に、ラットを歩行コンパートメントに入れ、ラットが毎秒18センチメートルの速度で少なくとも5ステップサイクル中断することなく走るように訓練します。ラットが訓練されたら、透明なトレッドミルベルトの下に取り付けられた高速デジタルビデオカメラを使用して、各ラットの連続的な動きの少なくとも5秒間のビデオをキャプチャします。5分間隔で少なくとも3回の中断のないランをキャプチャした後、イメージングソフトウェアで動物の歩行画像の境界を定義するためのバウンディングボックスを描画し、各ビデオのランニング速度を入力します。その後、ソフトウェアによる自動解析を開始します。処理後、ソフトウェアは、スタンス、スイング、ブレーク、推進、ケイデンス、ステップシーケンスなどのゲートインデックスを報告するいくつかのスプレッドシートを出力します。MIAは、用量依存的に機械的異痛症と熱痛覚過敏を誘発します。.驚くべきことに、MWTの減少はリバウンドの21日前から28日前にピークに達し、この段階で関節修復が起こる可能性があることを示唆しています。なお、3ミリグラムMIA群のMWTは、これらの時点ではまだ低い水準にあります。TWLの変化は、MWTで観測された変化とほぼ一致しています。MIAが1.5ミリグラムになると、MIAグループでは、足の総面積や単位歩幅などの歩行パラメータのレベルが大幅に減少します。28日後、MIAがラットの変形性関節症関連の関節痛を誘発することを示唆しています。Makin Sringingによる組織病理学的解析により、MIAグループにおける軟骨変性コラーゲン破壊とマトリックスの混乱が明らかになりました。さらに、1.5ミリグラムのMIAによる治療は、MMP 13とコラーゲン10型の大幅なアップレギュレーションと2型コラーゲンの大幅なダウンレギュレーションを誘発します。正しいジャンクションを見つけることが重要です。針が房腔に達したときに抵抗を充填しないでください。この技術は、安定して再現性のあるOA疼痛モデルの作成として促進され、疼痛を軽減し、機能を向上させるための薬剤の開発に重要な貢献をしました。MIの別の側面は、雹膜とマスクに非常に客観的な影響を及ぼし、この溶液を調製するときは常に手袋を着用する必要があります。

osteoarthritis-pain-model-induced-intra-articular-injection-mono

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

変形性関節症（OA）、または変性関節疾患、部分的にしか利用でき鎮痛剤によって制御されたまま痛みを伴う衰弱状態です。動物モデルは、OAに関連する疼痛の機序の我々の理解を改善するために開発されています。ここでは、マウスでのOA痛みのmonoiodoacetateモデルのための方法論について説明します。...

マウスにおける変形性関節症の痛みのMonoiodoacetateモデル

関節炎の痛みの誘発尺度を開発し、異なる化学物質誘発関節炎モデルマウスにおける自発痛を測定するための標準化された方法と相まっています。これらの措置は敏感で、関節痛の種類ごとに再現です。...

自発および誘発単膝痛症マウスモデルでの痛み対策

このプロトコルでは、変形性膝関節症モデルが修正された Videman...

ウサギの変形性膝関節症モデルにおける鍼切開術の適用

このプロトコルはKOAの動物モデルでTuinaの適用に参照を提供する膝の変形性関節症(KOA)のナトリウムのmonoiodoacetateの注入誘導されたラットモデルにおけるTuinaの介在の方法を記述する。このプロトコルは、KOAに対するTuinaの効果的なメカニズムも研究しており、その結果はその応用を促進するのに役立ちます。...

変形性膝関節症のモノヨード酢酸ナトリウム注射誘発ラットモデルにおける推拿介入

このプロトコルは、咬合力と頭部離脱閾値を測定することで、コンプリートフロイントのアジュバント(CFA)誘発性炎症性顎関節(TMJ)の痛みの行動をどのように捉えることができるかを説明しています。...

マウスにおける咬合力とフォン・フレイ・フィラメント・アッセイによる顎関節痛測定

このプロトコルでは、マウスの膝の痛覚過敏を測定する方法が説明されています。急性膝痛のマウスモデルと変形性関節症(OA)のモデルで例を示しています。...

Pressure Application Measurementを用いたマウスの膝痛覚過敏の評価

手術のシンプルかつ堅牢な行動の結果により、坐骨神経の慢性収縮は、神経因性疼痛の卓越した動物モデルの一つです。手術後24時間以内に、疼痛過敏症は、von...

ラットの坐骨神経と疼痛過敏テストの慢性的なくびれ

剥離の再現性があり、持続的な高さが実験的網膜剥離を作成し、網膜下出血せずに、網膜疾患における光受容体細胞損失の病態生理を研究し、潜在的な治療的介入を評価するために重要である。ここでは詳細にこのような方法を報告している。...

ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入によるげっ歯類における網膜剥離モデル

私たちは、緑内障をモデル化するために、ラットの眼に磁気マイクロスフィアを注入することにより、眼圧(IOP)の上昇を誘発する方法を提示します。これにより、強い圧力が上昇し、広範なニューロン死につながります。このプロトコルは、実施が簡単で、繰り返しの注入を必要とせず、安定した長時間の眼圧上昇を実現します。...

磁気マイクロスフェアの眼注射によって誘発実験緑内障

慢性的な高眼圧症は、ラットおよびマウス、緑内障と網膜神経節細胞の構造と機能の劣化につながる circumlimbal...

ラットおよびマウスの Circumlimbal 縫合による緑内障のモデル

学ぶラットの膝関節内モノヨードアセテート注射法による変形性関節症疼痛モデルの構築と評価。疼痛関連行動と組織病理学的変化を測定し、鎮痛薬開発の再現性ある基盤を提供する。

ラットにおけるモノヨードアセテートの関節内注射により誘発される変形性関節症疼痛モデル

さらに動画を探す