生体内における鶏絨毛性膜モデルを用いて婦人科癌と泌尿器科癌を研究する

鶏絨毛膜(CAM)上への腫瘍の生着は、腫瘍原性、治療効果または細胞クロストークの研究に使用することができる。この方法は、生体内での免疫寛容における費用対効果の高い急速な腫瘍増殖を可能にする。CAMモデルを用いて、新しい治療アプローチは、細胞株または患者腫瘍標本を用いて迅速に試験することができる。

このプロトコルの最も重要な側面は、適切なCAM形成を確保し、卵を開いている間にCAMまたは血管系を破壊しないことです。CAMが完全に発達した7または8日目に、卵回転子をオフにし、バイオセーフティキャビネットの卵ラックに約1〜3個の卵を入れます。ライトを消した状態で、卵殻に卵のろうそくを置いて1つの卵の空気細胞の位置を識別してマークし、卵のろうそくをシェルの上に移動して大きな血管ネットワークを見つけ、必要に応じて卵を回転させます。

理想的な血管系は卵の真ん中付近に分岐します。マーカーを使用して、移植に使用する血管系を追跡します。ボンネットのライトを元に戻した後、シリコンカーバイド砥石を取り付けたコードレスロータリーツールを使用して、シェルの小さな穴をエアセルの中央に直接掘削します。

シェルの大部分が除去されたが、白い内膜がそのままである場合は、ちょうど実証したように、血管窓が開く別の小さな穴を開けます。2つ目の穴が開いたら、18ゲージの針を使用して白い内膜を空気細胞の上に優しく突き刺し、血管構造は掘削領域全体全体で白い内膜ではなく、CAMが破壊されることを注意してください。フードライトを再び消灯したら、卵のろうそくを使って、空気細胞が卵の端から脈管構造上の領域に移されたことを確認します。

必要に応じて、元の空気セルの穴の周りにピペットコントローラに挿入された真空チューブを配置し、穏やかに空気セルを移動するために短いバーストで吸引を適用します。空気CAM境界内の約0.5センチメートルの空気セルの新しい位置の輪郭をマークし、新しい空気セルの上に穴を覆うのに十分な大きさの梱包テープを固定します。ちょうど実証したように他の2つの卵を準備した後、卵をインキュベーターに戻し、実証したように1〜3のグループで実験のための追加の卵を開きます。

すべての卵が開いたら、バイオセーフティキャビネットの卵ラックに空気細胞を再配置した卵を1〜3個の卵に移し、円形の切断ホイールを取り付けたコードレスロータリーツールを使用して、CAMまたは血管構造を破壊することなく、空気細胞の境界を完全に切断します。湾曲したはさみを使用して、残りの空気セルの周りを切り取ってシェルに窓を作成し、胚の生存率を確認する。生存可能な胚は、広範な血管系、明確なアルブミン、胚の動き、および/または目に見える心拍を表示します。

非生存性の胚では、CAMは、存在する血管が少なく、胚が動きや心拍なしに小さくても存在しない場合でも不透明に見える。Semkin鉗子を使用して、無菌綿ボールから綿の小片を引っ張り、生き残った胚のCAM表面を穏やかにブロットしてシェルのほこりや破片を取り除き、CAMに触れることなく6%から7センチメートルの透明フィルムドレッシングでシェル開口部を覆い、開いた窓を上に向けたインキュベーターに卵を返します。卵ラック、卵回転子の縁、または転がり続ける卵を支えるために別の適切なアイテムを使用してください。

移植のための癌細胞懸濁液を調製するために、遠心分離によって目的の癌細胞培養物から細胞を収穫し、細胞を沈下する。上清を吸引し、残留培地中の細胞を機械的に再懸濁する。細胞懸濁液を氷の上に置き、ピペットを使用して培地中の細胞の体積を測定します。

その後、20〜100マイクロリットルの培地中の10〜200万マイクロリットルの濃度で細胞を再懸濁し、1ミリリットル細胞外マトリックスおよび任意の成長因子または他の目的の添加物を添加する。がん細胞移植の場合、ノンスティックリングを使用して、卵ラックに埋め込まれる卵を最大6個置き、透明なフィルムドレッシングの端を開いた窓に向かって転がして、皮からフィルムを取り除きます。卵が実行可能で健康であるかどうかを確認してください。

理想的な卵は開いた区域の中心の小さい分岐容器を持つ大きい容器を持つ。湾曲した虹彩鉗子を使用して、理想的には分岐点の上に容器の上にCAMに無菌非粘着性リングを置く。滅菌ガラス攪拌棒を使用してCAMを優しくブラドし、癌細胞懸濁液をリングの中央にピペットします。

すべての細胞が送達されたら、6%の4分の1から7センチメートルの透明なフィルムドレッシングで開口部を密封し、卵に適切なインプラント指定でラベルを付けます。その後、卵をインキュベーターにしっかりと入れ、殻の開口部を直立させます。非スティックリングを使用せずに癌細胞を移植するには、細胞懸濁液を適切なサイズのピペットチップに吸引し、先端の上部を慎重に取り出し、先端を無菌10センチメートルの組織培養皿に水平に置く。

チップを積んだ後、皿を摂氏37度のインキュベーターに15〜30分間入れ、15分後に重合を確認します。少量の液体は、通常、各チップが皿に入れられると漏れ出します。この液体を使用して、先端内の重合の程度を推定する。

マトリックスの準備ができたら、適切なサイズのピペットに1つのチップを置き、プランジャーを押し下げ、部分的に重合した細胞懸濁液をCAM上に押し付けます。これらの方法を用いて、ヒトおよびマウスの卵巣癌細胞株および原発性腫瘍片の両方が、他のin vivoモデルで観察されたものと一致する形態を有する腫瘍の生着に成功した。試験された腫瘍タイプのうち、卵巣癌の増殖ははるかに顕著ではなく、典型的には生物発光イメージングの助けを借りずに見えない。

移植時に成長因子またはホルモンを加える効果もこれらの方法を使用してテストすることができます。.腎臓癌の場合、確立された細胞株または原発性ヒト腎腫瘍からの断片からの明確な細胞腎細胞癌細胞の移植は、迅速で堅牢な腫瘍形成を生じる。また、複数のヒトおよびマウス前立腺癌細胞株およびヒト膀胱癌細胞株および原発性腫瘍片を用いて、このモデルを用いて腫瘍を確立した。

CAM と血管構造を破壊しないようにし、ウィンドウを開いている間に CAM がシェルに付着しないようにすることが重要です。生着が成功した後、CAMモデルは、腫瘍内の異なる細胞タイプ間の目的または相互作用の治療効果を評価するために使用することができる。