スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いたHBx-DDB1相互作用の同定阻害剤
2019年12月21日
ここでは、スプリットルシフェラーゼアッセイ系を用いてHBx-DDB1相互作用を阻害する抗肝炎ウイルス剤をスクリーニングする方法を提示する。このシステムはタンパク質間相互作用の容易な検出を可能にし、そのような相互作用の阻害剤を同定するのに適している。
HBX-DDB1相互作用はcccDNAからのHPV転写を促進するための重要なステップであるため、このプロトコルはHPV機能治癒のための新しい治療薬を発見するための重要な資産になる可能性があります。私たちの手順は簡単で、画面に短い時間を必要とします。私が混ぜ合わせる相互作用は、細胞のライシスを必要とせずにリアルタイムで検出することができます。
また、スクリーニング品質はZ素数が高いと満足できる。HBX-DDB1相互作用の阻害は、HPV転写、タンパク質発現およびcccDNA産生の抑制をもたらすSmc5/6の回復をもたらす。抗ウイルス作用のこの新しいメカニズムは、現在のHPV療法の不十分さを克服することができる。
タンパク質とタンパク質の相互作用は、薬物標的の重要なクラスです。ウイルスとhasSタンパク質の相互作用を対象とする、ここで説明する分割ルシファーゼベースの酸は、他の感染症の治療法を開発するための新しい戦略を提供するかもしれない。プロトコルはシンプルで理解しやすいものですが、視覚的なデモンストレーションを行わなければ再現が難しい手順もあります。
したがって、視覚的なデモンストレーションは、私たちのプロトコルを理解するのに大きな助けになります。5回10〜5番目のHEK293T細胞を100ミリメートル皿に100ミリメートルのDMEMで播種し、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、300マイクロリットルの総容量に対して、DNAプラスミドとDNA凝縮バッファーを発現するHBx-LgBitとSmBit-DDB1のそれぞれ1マイクログラムを希釈します。
16マイクロリットルのエンハンサー溶液を加え、1秒間ボルテックスでチューブを混合します。試料を室温で3分間インキュベートし、60マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加える。チューブを10秒間ボルテックスし、サンプルをさらに8分間インキュベートする。
一方、細胞と皿から培地を吸引し、5ミリリットルのPVSで洗浄する。PVSを吸引し、7ミリリットルのDMEMを加えます。トランスフェクション複合体でチューブに3ミリリットルのDMEMを加え、ピペットを上下に混ぜ合わせ、混合物を細胞に加えます。
その後、セルを摂氏37度、炭酸ガス5%で10時間インキュベートします。インキュベーション後、使用済み培養培地を取り出し、5ミリリットルのPVSで細胞を洗浄する。0.25%トリプシンEDTAの1ミリリットルでPVSを取り出し、37°Cで細胞をインキュベートして取り外します。
次に、4ミリリットルのDMEMを加え、それを細胞層の表面にピペット化して培地を数回分散させ、懸濁液をチューブに移した。500倍Gで細胞を5分間遠心し、その上清を捨て、PVSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。セチフィケーションを繰り返し、上清を捨てます。
次いで、1ミリリットル当たり100万個の細胞の播種密度に10%FBSを添加した緩衝細胞培養培地で細胞ペレットを再懸濁する。ピペット50マイクロリットルの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、細胞を37°Cインキュベーターに10時間戻す。細胞がインキュベートしている間、スクリーニング化合物と溶媒を13.5倍の濃度に希釈する。
各ウェルに12.5マイクロリットルの発光基板を加え、室温で5分間プレートをインキュベートします。ルミノメーターでベースラインルミネッセンスを測定し、5マイクロリットルの化合物を加え、DMSOを制御した直後に各ウェルに加えます。30分毎に2時間発光を測定し、次いでDMSO処理と比較して化合物の阻害効果を計算する。
ベースライン発光信号を測定し、信号対バックグラウンド比を80以上と計算した。Z素数が0.5より大きかったことは、このアッセイシステムがハイスループットスクリーニングに許容されることを示す。DMSOのみのコントロールと比較して40%以上の阻害に閾値を設定することにより、ニタゾキサニドが候補薬物として同定された。
我々は、この方法で反応性小規模化合物ライブラリーをスクリーニングすることにより、HBX-DDB1相互作用の阻害剤としてニタゾキサニドを同定した。ニタゾキサニドを用いて、HBX-DDB1相互作用の阻害、ウイルス転写の減少、およびその後のウイルス産物レベルを確認する。標的タンパク質に融合した分割ルシファーゼの最適部分は、あらかじめ決定する必要があります。
この場合、HPXはHpXのC末端で大ビットに融合し、DDB1の終末でスモールビットに融合して最良の結果を得た。
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概要
この研究では、分割ルシフェラーゼアッセイシステムを用いてHBx-DDB1相互作用を阻害する抗B型肝炎ウイルス薬のスクリーニング方法を提示します。このプロトコルにより、細胞溶解なしでタンパク質-タンパク質相互作用のリアルタイム検出が可能となり、HPV機能的治療のための新しい治療薬の発見が容易になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- ウイルス学
- 薬理学
背景
- HBX-DDB1相互作用は、cccDNAからのHPV転写に不可欠です。
- 現在のHPV治療法には不足点があり、この方法はそれらに対処することを目指しています。
- HBX-DDB1の阻害によるSmc5/6の回復は、HPV転写を抑制することができます。
- 分割ルシフェラーゼアッセイシステムは、スクリーニング品質に高いZプライムスコアを提供します。
研究目的
- HBX-DDB1相互作用の阻害剤を識別する方法を開発すること。
- HPVの新しい治療薬の発見を促進すること。
- 抗ウイルス研究におけるスクリーニングの効率性と品質を向上させること。
使用した方法
- タンパク質-タンパク質相互作用を検出するための分割ルシフェラーゼアッセイシステム。
- 細胞溶解なしでの相互作用のリアルタイムモニタリング。
- Zプライムスコアを用いたスクリーニング品質の評価。
- HBX-DDB1を標的とする抗ウイルスメカニズムの評価。
主要な結果
- この方法は、HBX-DDB1相互作用をリアルタイムで成功裏に検出します。
- HBX-DDB1の阻害はSmc5/6の回復につながります。
- HPV転写とcccDNA生産の抑制が観察されました。
- このアプローチは、抗ウイルス作用の新しいメカニズムを提供する可能性があります。
結論
- この方法は、新しいHPV治療法を発見するための有望な手段を提供します。
- HBX-DDB1を標的とすることで、既存の治療法の限界に対処します。
- 分割ルシフェラーゼアッセイは、将来の抗ウイルス研究のための貴重なツールです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Targeting the HBx-DDB1 interaction addresses a critical mechanistic bottleneck in hepatitis B virus (HBV) drug discovery, enabling direct intervention at the level of viral protein expression. The split luciferase assay system provides real-time, quantitative readouts for inhibitor screening, supporting predictive confidence in early-stage target validation. This platform strengthens portfolio triage by enabling high-throughput identification of compounds with novel antiviral mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of the HBx-DDB1 protein-protein interaction central to HBV pathogenesis.
- Supports biological de-risking by linking inhibition to restoration of Smc5/6 and suppression of viral transcription.
- Facilitates predictive confidence in target engagement through real-time, live-cell measurement.
Screening & Assay Development
- Delivers a validated, high Z prime assay suitable for high-throughput compound screening.
- Provides robust, quantitative luminescence outputs for reliable compound ranking.
- Enables reproducible, scalable workflows for screening libraries against protein-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms by targeting viral protein expression from cccDNA.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by linking molecular inhibition to functional outcomes.
- Reduces translational risk by focusing on a mechanistically validated antiviral target.
Pipeline & Workflow Integration
This split luciferase assay system integrates at the early discovery and lead identification stages, bridging target validation and high-throughput screening for HBV and potentially other viral targets.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing of protein-protein interaction inhibitors in live cells.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility with high signal-to-background and Z prime metrics.
- Analytics: Generates quantitative inhibition data to compare compound efficacy and selectivity.
- Translational Research: Connects molecular inhibition to restoration of host restriction factors and suppression of viral transcription.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other protein-protein interaction targets in infectious disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for HBV drug discovery.
- Operational Value: Standardizes and accelerates screening workflows with robust, reproducible outputs.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of novel antiviral candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds with unique mechanisms of action.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein-protein interaction assays and live-cell luminescence measurements.
- Needs access to cell culture, transfection reagents, and plate-based luminometry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay setup and data analysis for reproducibility.
- May require optimization of fusion protein constructs for different target pairs.
- Visual protocol demonstration aids reproducibility for complex assay steps.
