Name: 腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3D腫瘍球状モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学ぶ 3D腫瘍球状モデルによる腫瘍間質相互作用の研究法。線維芽細胞と共培養し創薬スクリーニングに応用可能な革新的ながん研究プラットフォームを構築する手法です。

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私たちは、オマイダ・C・ベラスケス博士(マイアミ大学)の協力、相談、議論に感謝します。MeWo細胞を提供するためのジエ・リー博士(マイアミ大学)そして他のすべての黒色腫細胞を提供するためのミーンハルト・ハーリン博士(ウィスター研究所)。また、マイアミ大学分析イメージングコア施設ディレクターのマルシア・ブーリーナ博士に対し、イメージング分析に感謝します。趙潤劉は、バンクヘッドコーリーがん研究プログラム(アワード#09BN-11)、女性がん協会(第53回年次助成金)、マイアミ大学からの内部資金からの助成金によって支えられていました。

1. 黒色腫細胞と皮膚線維芽細胞の培養
<ol><li>ヒト黒色腫細胞の培養<ol>
<li>培養ヒト黒色腫細胞は、C816131を完全なW489培地で従来の接着細胞培養条件下で(ステップ1.2参照)、前述の32に記載された5%CO2を供給した37°Cインキュベーターで供給した。細胞が90%の合流率に達したら、1:5の割合で細胞を分割します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>黒色腫細胞培養培地(W489)<ol>
<li>完全なW489培地については、80%MCDB153培地、20%L-15培地(材料表参照)、2%ウシ胎児血清(FBS)、5μg/mLインスリン、1.68mM CaCl2、および0.11%重炭酸ナトリウムを使用してください。コカルチャーの場合は、FBS、インスリン、CaCl2を追加しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウス皮膚線維芽細胞分離<ol>
<li>動物のケアと使用委員会(IACUC)の関連するガイドラインと規制に従って、マウスから1cm×1cmの皮膚片を切断します。</li>
		<li>一晩4°Cでディスパーゼ(材料の表を参照)によって皮膚を消化します。表皮から真皮を取り除き、コラゲターゼ(DMEMで1mg/mL、材料表参照)を室温(RT)で一晩で消化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウス皮膚線維芽細胞培養<ol>
<li>PBSで組織ペレットを洗浄し、37°C/5%CO2で10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンでDMEMでそれらを培養します。細胞が90%の合流率に達したら、1:2の割合で細胞を分割します。</li>
		<li>コカルチャーの前に標準的な方法を用いてGFP/レンチウイルスで皮膚線維芽細胞をトランスデュースする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>免疫染色によるマウス皮膚線維芽細胞の特徴付け<ol>
<li>染色のための細胞製剤<ol>
<li>2 x 104細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに皮膚線維芽細胞を播種します。2日目にPBS2xで細胞を洗浄し、10分間2%中性緩衝ホルマリンで固定します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>免疫染色<ol>
<li>各ウェルに200μLのブロッキング溶液を加え、RTでプレートを30分間インキュベートし、1:200に希釈したマウス抗α-SMAを加え、37°Cで1時間インキュベートします。</li>
			<li>1:400希釈でAlex Fluor 488ヤギ抗マウスIgGを添加し、RTで1時間インキュベートし、抗体3xをPBSで洗い流し、それぞれ5分間。</li>
			<li>1 μg/mL DAPI を追加し、RT で 2 分間インキュベートします。</li>
			<li>細胞を観察し、蛍光顕微鏡を用いて画像を撮影します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>線維芽細胞および黒色腫細胞の事前標識<ol>
<li>1日目に100mmの皿に線維芽細胞を播種し、翌日に細胞の合流率が60%に達するようにする。2日目に培養液を取り出し、GFP/レンチウイルス(ストックから希釈した1:3~1:5)を4μg/mLのポリブレンを用いて通常の培地に添加します。細胞を37°Cのインキュベーターで6時間インキュベートし、培地を除去し、新鮮な常培養培地に置換する。2日後、蛍光顕微鏡を用いて細胞からのGFPシグナルを観察した。同様の条件下でDsRed/レンチウイルスを有するC8161細胞をトランスデュースする。GFP/レンチウイルスおよびDsRed/レンチウイルスの調製のためのプロトコルは、14、34を既に説明しました。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞コカルチャー
<ol><li>C8161-線維芽細胞共培養を種付けする。<ol>
<li>回転楕円体形成アッセイの0日目に、0.25%トリプシン-EDTAを用いてC8161と皮膚線維芽細胞の両方を剥離する。RTで5分間250gで細胞をスピンダウンし、PBSで1回洗浄します。</li>
		<li>細胞コ培養培地(血清フリー、インスリンフリー、およびカルシウムフリーW489培地を1:1の割合で混合した)で細胞を再懸濁した。細胞濃度を2 x 104セル/mLに調整します。</li>
		<li>C8161細胞と線維芽細胞を1:1の比率で混合し、24ウェルプレートの各ウェルに2 mLの細胞混合物を加えます。各ウェルには、各タイプのセルの2 x 104が含まれている必要があります。各条件は三重で行う必要があります。 注: 非組織培養処理プレートを使用することが重要です(材料表を参照)。さもなければ、細胞は強く版に付着し、回転楕円体を懸濁させることはできない。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞がプレートに付着するまで37°Cで4時間の細胞をインキュベートし、次いで各アッセイの指示された時点でタイムラプス画像または共焦点スキャンを行う。</li>
</ol>3. ライブセルタイムラプスイメージング
<ol><li>コカルチャーの前に、メーカーの指示に従ってタイムラプスイメージングシステム(資料表を参照)をオンにし、インキュベーターを37°Cおよび5%CO2に達させます。通常、システムが平衡状態に達するまでに1時間かかります。培養器内の顕微鏡のステージに慎重に培養プレートを置き、ドアをしっかりとロックします。</li>
	<li>タイムラプスイメージングシステムのソフトウェアを開き(材料の表を参照)、顕微鏡が正確に走査領域を見つけることができるように、プレートタイプとメーカーを選択します。興味のある井戸と10倍の対物レンズを選択してください。スキャン領域の設定、スキャン間の間隔、開始時刻、終了時刻を選択します。このプロトコルでは、1 ウェルのスキャンエリアの最大フォーマット番号は 36 で、間隔時間は 1 h です。</li>
	<li>4~52時間の記録タイムラプス画像 注: 開始時刻、終了時刻、および期間は、セルの種類と実験の目的によって最適化する必要があります。</li>
	<li>画像の記録を完了したら、タイムラプスイメージングシステムソフトウェアを使用してデータを取得し、ビデオまたは画像セットをエクスポートします。</li>
</ol>4. 共焦点顕微鏡と3Dムービー
<ol><li>細胞コカルチャープレートを転向蛍光顕微鏡のステージに置き(材料表を参照)、赤と緑のレーザービームを使用します。5xまたは10xの対物レンズの下の細胞を観察し、スキャンを開始する回転楕円体を選択します。</li>
	<li>1 μm z ステップを使用して、回転楕円体の下から上までスキャンします。画像処理ソフトウェア(「マテリアルの表」を参照)を使用してデータを処理し、3D ムービーとしてさらに回転して保存できる 3D イメージを再構築します。</li>
</ol>黒色腫細胞の単独培養と2Dクラスター/凝集体の形成
<ol><li>第2章第2.1項に記載されているように、種子2 x 104 C8161黒色腫細胞を24ウェルプレートの各ウェルに入れた。細胞を7~10日間培養し、反転蛍光顕微鏡を用いてそれらを撮影する。</li>
</ol>6. 3D球体および2Dセルクラスタ/凝集体が中で中断されているか、プレートに取り付けられているか確認する
<ol><li>細胞コカルチャーの場合は、7日目に形成された3D回転楕円体を確認してください。単一セルの培養では、10日目に形成された2Dクラスター/凝集体を確認します。</li>
	<li>転向蛍光顕微鏡のプラットフォーム上に細胞培養プレートをセットする。糸状注射器で曲がった針をウェルに入れ、培養液を出入りして穏やかに吸引し、井戸内の培養液を乱す。ムービーソフトウェアのムービーモードを使用してこのプロセスを記録します(資料の表を参照)。3D回転楕円体は移動可能ですが、2D セルのクラスタ/凝集体は不動のままです。</li>
</ol>7. 3D回転楕円体の共焦点画像
注:コカルチャー細胞は、使用される線維芽細胞の種類に応じて48〜72時間から回転楕円体を形成し始めます。一般的に、回転楕円体は時間とともに徐々に拡大する。小さな回転楕円体は7日目まで大きな回転楕円体を形成するために融合することができる。回転楕円体のサイズが安定した後、10日以上持続することができます。その後、回転楕円体はしばしば培養プレートの底から取り外し、井戸の中央に集まる。回転楕円体の拡大中、中央の細胞は通常、栄養不足および/または有毒な微小環境のために死ぬ。したがって、3Dスフェロイド形成のピークと成熟した回転楕円体の画像化のタイミングは、パイロット実験を使用して最適化する必要があります。このプロトコルに関しては、回転楕円体が成熟し、回転楕円体の中心にある細胞が、中心にある細胞の蛍光および形態に従ってまだ生きていた7日目頃に共焦点顕微鏡検査を行った。
<ol><li>共焦点顕微鏡を行うには、緑と赤色のレーザーを使用して回転楕円体をスキャンします。10倍の目的のスキャン領域を特定し、1μm zステップで回転楕円体の下から上に移動します。</li>
	<li>画像処理ソフトウェアの3D投影機能(ImageJなど)を使用して、3D回転ビデオを生成します。</li>
</ol>8. 細胞内のノッチ1 癌幹細胞の間質調節を決定する際のシグナル伝達経路活性
<ol><li>機能低下性Notch1マウスからの皮膚線維芽細胞の分離と特徴付け<ol>
<li>遺伝子組み換えマウスの2組から皮膚線維芽細胞を単離する:機能性の向上(GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-;ROSALSL-N1IC+/+) マウスと対応する対照 (GOFctrl : FSP1.クレ-/-;ROSALSL-N1IC+/+) マウスおよび機能喪失ノッチ1 (LOFノッチ1: Fsp1.Cre+/-;Notch1LoxP/LoxP+/+) マウスと対応するマウスの対照 (LOFctrl : FSP1.クレ-/-;Notch1LoxP/LoxP+/+) マウス31, それぞれ.セクション1.3-1.5に記載されているプロトコルを使用して皮膚線維芽細胞を分離し、特徴付けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウスの皮膚線維芽細胞をGFP/レンチウイルスでトランスデュースする。<ol>
<li>レンチウイルスベクターで細胞を変換する方法については、セクション1を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>線維芽細胞と黒色腫細胞のコカルチャー<ol>
<li>セクション2に記載されているように細胞コカルチャー実験を行う。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3Dスフェロイドのサイズを測定することにより、線維芽細胞における細胞内のNotch1経路活性が癌の幹細胞/発芽細胞の間質調節に及ぼす影響を評価する<ol>
<li>スフェロイドが成熟した時点での回転楕円体の撮影により、各条件下で回転楕円体の定量化を行います(線維芽細胞の種類に応じて5-7日目頃の成長停止によって示されます)。画像処理ソフトウェアを使用して、3D回転楕円体のサイズを測定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3Dスフェロイドアッセイを用いたがん幹細胞/発芽細胞の薬剤応答の検査
注:CAFは癌の異種原性を調節し、癌の幹細胞/発起細胞の表現型を誘発することができる。CAFはまた臨床処置に耐えるために癌の茎/起発細胞を支える。がん幹細胞は薬剤耐性の原因であることが示されている。そこで、この3D回転楕円体モデルを用い、がん幹細胞/発芽細胞の薬剤応答を評価しました。結果は、抗癌薬の潜在的な臨床的有効性を十分に評価することができます。
<ol><li>薬物投与<ol>
<li>24ウェルプレートで細胞を培養した直後に、試験実験に基づいて所望の濃度範囲(すなわち、1nM、2.5nM、5nM、10nM、および25nM)に達するように培地中の連続希釈液中で薬物を調製する。 コカルチャー細胞の各ウェルに0.5 mLの薬剤溶液を加える。上記のように、コントロール・グループを通常のコカルチャー・メディアで扱います。</li>
		<li>注:MEK阻害剤は、細胞培養培地に可溶性である。したがって、ブランクコントロールは、細胞培養培地の2.5mLである。しかし、薬物が水溶液に溶解せず、DMSOなどの溶媒を必要とする場合は、同じ濃度のDMSOを有する細胞培養培地を対照群に適用する必要がある。</li>
	</ol>
</li>
	<li>回転楕円体を数える薬物応答の定量化<ol>
<li>蛍光顕微鏡を用いて処理した細胞と未処理細胞を観察し、毎日細胞を撮影する。異なる実験群における回転楕円体形成を定量化し、異なる薬物濃度下での細胞培養の回転楕円体形成能を比較する。 注:回転楕円体は、コカルチャーの5〜7日後に現れる傾向があります。薬物の効果は、その時点で顕著になります.</li>
		<li>蛍光顕微鏡を使用して、ウェル内の回転楕円体および細胞を画像/撮影し、画像ソフトウェアを使用して、回転楕円体の平均サイズと、各処理群の低電力場(LPF x 4)ごとに形成された回転楕円体の数を時間の経過とともに計算します。 注: 効果的な薬物治療を受ける細胞は、コントロール群と比較して、より少ないまたは全く回転楕円体を形成しないべきである。これは、がん幹細胞を抑制する上での試験薬の有効性を示す指標です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者らは、彼らが競合する財政的利益を持っていないと宣言します。

In vitro 3D細胞培養技術は、がん研究において何十年も広く採用されてきました。従来の2D細胞培養システムと比較して、3Dマイクロ環境は細胞および/または細胞マトリックス相互作用を再吸収し、腫瘍組織で観察される真の条件を模倣することを可能にする。しかし、がん細胞とホモタイピック細胞相互作用によってのみ形成される3Dシステムは、異種クロストークの重要性を考慮に入れておらず、研究において不正確な結果を提供する可能性があります。我々は最近、癌細胞とCAFを組み合わせた新しい3Dシステムを開発し、生体外の異種腫瘍微小環境およびその天然および硬質デスモプラスチック反応をよりよく模倣した。
線維芽細胞は、腫瘍間質の主要な構成要素である。CAFは、可溶性因子、ECM/リモデリング酵素10、11、およびエキソソームを引き出すことによって腫瘍の進行を調節することに関与している。さらに、CAFは薬剤耐性および腫瘍再発16、17の一部を果たす。当社の多細胞3Dスフェロイドシステムを利用して、腫瘍間質相互作用の分子機構を探索し、薬剤耐性と腫瘍再発に対処することができます。CAFは、主に活性化された局所静止線維芽細胞に由来し、腫瘍組織37、38、39においてCAFへのその中で分化を受ける循環骨髄MSCを募集した。今回の研究では、皮膚線維芽細胞を用いて多細胞3D回転楕円モデルを作成しました。しかしながら、他のタイプの線維芽細胞(例えば、MSC−DF)は、腫瘍細胞3Dスフェロイド形成34を調節する皮膚線維芽細胞と非常によく似た方法で働く。MSC-DFは、3日ごとに周期的培地が変化するMSC細胞培養培地中で骨髄単核細胞を培養することにより濃縮されるマウス骨髄から生成することができる。これらの MSC は、CD73+/CD105+/Lin-として特徴付けられています。MSCを線維芽細胞に分化するために、MSCは、その後、さらに2週間完全なDMEMで培養される。MSC-DFは、α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+細胞36として特徴付けられる。MSC-DFは重要な腫瘍調節因子である可能性がある。多くの種類の固形腫瘍におけるCAFの一部は骨髄36から放出される募集循環MSCとは区別されるため、MSC−DFは有望な治療標的になり得る。彼らはまた、腫瘍組織にリクルートされ、CAFに分化される前に、はるかに簡単に治療的に操作または標的化されます。したがって、私たちの3Dモデルは、がん細胞だけでなく、CAFの異なる画分や亜集団を研究し、テストするのに理想的なシステムを提供します。3D回転楕円体形成の方法は簡単です。重要なステップには、コカルチャーのための血清フリー培地の使用、腫瘍細胞に線維芽細胞の正しい比率を適用すること、およびコカルチャーのための適切な培養プレートを使用することが含まれる。我々の方法の潜在的な限界は、3Dスフェロイドの形成が主に癌細胞株依存性であるということである。私たちの回転楕円体形成プロトコルは、異なる癌細胞株を採用する場合、線維芽細胞と癌細胞の比率の最適化を必要とするかもしれません。3Dスフェロイドの形成にはヒト黒色腫細胞およびマウス線維芽細胞共培養モデルを用い、マウス線維芽細胞におけるGOFまたはLOF細胞の作成がはるかに容易であるため、腫瘍スフェロイド形成を調節する際の分子またはシグナル伝達経路の役割の研究に用いられていることに留意すべきである。ヒト黒色腫細胞およびマウス線維芽細胞が球状体を形成する能力は、細胞間の通信に必要な分子が交差種で働くことを示している。我々は最近、ヒト黒色腫細胞を用いたヒト線維芽細胞の共培養を試験し、ヒト線維芽細胞がヒト黒色腫細胞を調節して3D回転楕円体を形成することもできることを発見した。
多細胞3D回転楕円モデルではヒト転移性黒色腫細胞C8161を採用しました。また、BRAFV600E変異を伴う1205Lu32や高レベルのCDK4/Kit(ATCC HTB-65)を発現するMeWoなどの他のヒト黒色腫細胞を試験し、コカルチャーで3Dスフェロイドを形成することもできることがわかりました。これは、腫瘍細胞による3Dスフェロイドの形成が発癌性変異の種類とは無関係であることを示している。他のタイプの非黒色腫腫瘍細胞が線維芽細胞を有する3Dスフェロイドを形成できるかどうかをテストしていないが、我々の知見は、3Dスフェロイドの形成が黒色腫細胞株に限定されず、特定の癌細胞株に依存しない可能性があることを示している。
3D回転楕円体モデルの実用化の例を2つ示した。一例は、癌幹細胞/開始細胞表現型および3Dスフェロイド形成を調節する際の細胞内ノッチシグナル伝達経路活性を解明することであった。CAFの細胞内ノッチシグナル伝達経路は、この3D回転楕円体モデルを用いて癌幹細胞/開始細胞の表現型を制御する分子スイッチであることを実証した。我々の知見は、がん幹細胞/開始細胞および癌異種原性の間質調節の根底にある分子メカニズムを明らかにするだけでなく、CAFのノッチ経路が黒色腫治療薬の重要な標的であることを強調している。この例は、我々の3Dスフェロイドモデルが癌細胞間質線維芽細胞相互作用のメカニズムを研究し、潜在的な治療標的を同定するのに非常に有用であることを示している。もう一つの例は、CAFの存在下で癌の幹細胞/発菌細胞の薬物応答を試験することであった。がん幹細胞の薬物反応は、がんの幹細胞/発菌細胞を含め、CAFの有無に応じて変化することはよく知られています。このインビトロシステムにCAFが存在すると、このモデルはより臨床的に関連性があり、生成されたテスト結果の信頼性が高くなります。さらに、私達の3Dの回転楕円のシステムは多目的である。様々な用途に使用できます。例えば、この3Dモデルでは薬剤耐性がん細胞を採用すれば、薬剤耐性や腫瘍再発に対応するように変更できます。また、主にがん治療のためにCAFを標的とする薬物を検査またはスクリーニングするように改変することもできる。CAFは最近、有望な治療標的となっています。CAFをターゲットにすることには利点があります。まず、異常(しばしば遺伝的変化を伴う)およびスマート(ケモおよび放射線療法に対する耐性を得やすい)である腫瘍細胞と比較して、腫瘍組織のCAFは正常な細胞であり、遺伝的に安定しているので、治療に対する耐性を発症する可能性が低い。第二に、CAFを標的とすることは、腫瘍細胞における発癌性突然変異の種類に依存しない。第3に、CAFを標的とすることは、線維芽細胞依存性抗腫瘍、抗血管新生、および/または調節癌免疫応答を通じて複数のヒット効果を達成し得る。当社の3Dスフェロイドモデルは、がん治療戦略の多様なセットを発見するための強力なツールです。

固形腫瘍は、新生細胞と多種多様な間質細胞1、2、3、4で構成される複雑な組織を表す。間質線維芽細胞、または癌関連線維芽細胞(CAF)は、ほとんどのタイプの固形腫瘍における顕著な間質細胞集団の1つである。彼らは腫瘍の成長を調節することに批判的に関与しています, 成長因子の産生による幹細胞、転移、血管新生、薬剤耐性、サイトカイン/ケモカイン、ECMおよびリモデリング酵素の合成(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、マトリックスメタロプロテアーゼ)、エキソソームの放出、および直接異種細胞細胞相互作用5、.CAFはまた、原変性腫瘍細胞集団から腫瘍クローンのサブセットを事前に選択することにより癌臓器特異的転移を決定し、選択されたクローン12の再植民地化に最適な微小環境を有する特定の遠隔器官への転移のために準備されるこれらの選択クローンを育成する。また、線維芽細胞及びそれらの分泌可溶性因子およびECMは、腫瘍血管新生13,14,抗腫瘍免疫応答15の変調に関与し、かつ、薬剤耐性及び腫瘍再発16、17にも関与している。
in vitro 3D腫瘍スフェロイドモデルは、インビトロ癌細胞培養とin vivo腫瘍モデル18、19、20、21との中間モデルとして癌研究において開発され、使用されている。3D腫瘍回転楕円体モデルは、従来の2D単層22に存在しない実際の腫瘍のいくつかの重要な特徴を再現するため、癌幹細胞研究、前臨床癌研究、および薬物スクリーニングにおいて人気を集めている。多くの既存の3D腫瘍回転楕円モデルは、腫瘍細胞のみで構成され、腫瘍間質細胞の参加を欠いている。これは、多くの場合、不十分なECM沈着およびヘテロチピック細胞間相互作用の欠如を有する腫瘍回転楕円体をもたらす。癌細胞およびホモタイピック細胞間接着によって排他的に形成される従来の3Dスフェロイドは、腫瘍組織の生体内条件を部分的に模倣するだけでよい。これらの制限のいくつかを克服するために、研究者は、3Dコカルチャーに複数のタイプの間質細胞を組み込むことを提案し、いくつかのヘテロタイプ3D腫瘍回転楕円モデル23、24、25、26、27を開発した。さらに、研究者は、天然ヒドロゲルやポリエチレングリコール、ポリ(ラクチド-コグリコリド)、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)などの合成ポリマーを含む外因性3Dマトリックスを採用して、単細胞および多細胞スフェロイドモデルを埋め込み、細胞支持環境を作り出し、細胞マトリックス相互作用28、29を作り直し、これらの生物学的システムをより関連するシステムにする。しかし、内皮細胞などの特定のタイプの間質細胞を3Dコカルチャーに組み込むことで、インビトロ系の複雑さが増し、がん細胞線維芽細胞相互作用などの2つの特定のタイプの細胞間の異種細胞相互作用を研究することが困難になります。さらに、内皮細胞が癌細胞や他の間質細胞と直接相互作用するのを防ぐ毛細血管の外側に包まれた下層膜があるため、実際の組織の内皮細胞は、常に癌細胞および他の間質細胞と直接相互作用する。これらの3D回転楕円モデルでは、組み込まれた内皮細胞は実際には血管を形成せず、しかも癌細胞や他の間質細胞と直接相互作用し、生体内ではめったに起こらない。同様に、一部の3D回転楕円モデルに採用される外因性マトリックスは、構造および組成の点で実際の腫瘍組織におけるECMと同一ではない。これらの人工的な条件はすべて、誤解を招くデータを引き起こす可能性があります。
最近、腫瘍細胞とCAFで構成される新しい多細胞3D回転楕円モデルを作成しました。我々のモデルでは、3D腫瘍回転楕円体の形成はCAFによって完全に決定される。CAFは腫瘍幹/発菌細胞の表現型を誘導し、調節する。CAFによって生成されたECMは自然であり、デスモプラスチック構造が生体内腫瘍微小環境をより良く模倣することを可能にする。この新しい3Dモデルは、がん治療薬のスクリーニングに役立つツールであり、腫瘍間質相互作用を研究し、CAFが癌幹細胞/発起細胞をどのように調節するかを解明し、癌薬物感受性と耐性における間質相互作用の関与を探るユニークなプラットフォームを提供する。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-253-CI</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>351147</td><td>非組織培養処理プレート、24ウェル、平底、低蒸発蓋付き</td></tr><tr><td>Alex Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1.5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ、1A 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2674</td><td>500 mg、DMEM中の1 mg / mL濃度。</td></tr><tr><td>DakoCytomation</td><td>Dako</td><td>x0909</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase Grade II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>165859</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VMR</td><td>97068-085</td><td>Premium Grade</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>以下のために 無料ダウンロード、ライセンスは必要ありません。</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom 2016A</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom System</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 倒立共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MCDB 153 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗 &α;-SMA (平滑筋アクチン)、モノクロン</td><td>Abcam</td><td>ab18640</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス IX51 倒立蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>オリン</td><td></td><td></td><td></td></tr>パス <tr><td>PD0325901</td><td>セレックケム ケミカル</td>ズ <td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン 溶液</td><td>コーニング</td><td>30-002- CI</td><td>100 X</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム 7.5%</td> <td>コーニング</td><td>25-035-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3d腫瘍球状モデル

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

腫瘍間質相互作用は、癌の進行に重要な役割を果たす。3次元(3D)腫瘍回転楕円体モデルは、がん幹細胞/発芽細胞、前臨床がん研究、薬物スクリーニングの研究において最も広く使用されているインビトロモデルです。3Dスフェロイドモデルは、従来の腫瘍細胞培養に優れ、実際の固形腫瘍のいくつかの重要な文字を再現します。しかし、従来の3D腫瘍スフェロイドは、腫瘍細胞のみで構成されています。それらは腫瘍間質細胞の参加を欠き、細胞外マトリックス(ECM)沈着が不十分であり、したがって腫瘍組織の生体内の状態を部分的に模倣しているに過ぎない。我々は、生体内不均一性腫瘍微小環境およびその天然デスモプラシアをより良く模倣する腫瘍細胞および間質線維芽細胞からなる新しい多細胞3Dスフェロイドモデルを確立した。スフェロイドの形成は、腫瘍間質線維芽細胞によって厳密に調節され、特定の重要な細胞内シグナル伝達経路(例えば、ノッチシグナル伝達)の活動によって決定されるストロマ線維芽細胞。本稿では、腫瘍細胞間質線維芽細胞の共培養、細胞と細胞間の相互作用を可視化するための経時画像化、および回転楕円体の3D建築的特徴を示す共焦点顕微鏡法の技術を紹介する。また、この3D回転楕円体モデルの実用化例を2つ紹介します。この新しい多細胞3Dスフェロイドモデルは、腫瘍間質相互作用を研究し、間質線維芽細胞が腫瘍の進行と攻撃性を決定する癌幹細胞がどのように癌幹細胞/発起細胞を調節するかを解明し、癌薬物感受性および耐性における間質反応の関与を探る方法を解明するための有用なプラットフォームを提供する。このプラットフォームは、創薬のための適切なインビトロモデルにもなります。

生体内腫瘍微小環境を模倣したインビトロヘテロチピック細胞コカルチャーシステムを用いて3D回転楕円体を生成する新しい方法を開発しました。線維芽細胞は、マウスの皮膚線維芽細胞に由来する。皮膚線維芽細胞は、上述のように生成し、α-SMA+/Vimentin+/FSP-1+細胞として特徴付けた。ヒト転移性黒色腫細胞(C8161)は、記載の32のようにW489培地で培養した。線維芽細胞を腫瘍細胞から可視化し、区別するために、線維芽細胞および黒色腫細胞をGFP/レンチウイルスおよびDsRed/レンチウイルスでそれぞれ34、36、細胞コカルチャーの前に前にトランス散した。
図1は、黒色腫細胞と線維芽細胞とのコキュリングによって形成された多細胞3Dスフェロイドの例を示す。線維芽細胞の非存在下で培養された黒色腫細胞は典型的な3D回転楕円体を形成しなかったが、いくつかの黒色腫細胞は拡張培養で2Dクラスター/凝集体を形成する。回転楕円体の平均サイズは、日 ~5-7 で直径約 170 ~ 360 μm (平均 = 275、SD = 37) でした。タイムラプスイメージングを用いて、線維芽細胞と腫瘍細胞がコカルチャーで相互作用し、ビデオ1に示すようにコカルチャーの約36時間で3Dスフェロイドを形成し始めたことを観察した。タイムラプスイメージングは、細胞間相互作用の動的過程と、約4~52時間の共培養におけるスフェロイド形成初期相を記録した。3D回転楕円体形成のピークは、約1日〜5-7日に発生した。形成された3Dスフェロイドは線維芽細胞および黒色腫細胞で構成され、その大部分(約80%)が腫瘍細胞であった。ビデオ2は、単一培養で〜4〜52時間から始まる細胞クラスター/凝集体の形成における単一培養黒色腫細胞(DsRed+/C8161)の動的プロセスを示す。2Dクラスター/凝集体の形成は、約7-10日頃にピークに達しました。ビデオ3とビデオ4は、共焦点顕微鏡で可視化された3D回転楕円体および2D腫瘍細胞クラスターの構造をそれぞれ示す。3Dスフェロイドおよび2D腫瘍細胞群を細胞共培養7日目に共焦点顕微鏡検査により検査した。ビデオ5は、3Dスフェロイドが培養培地および移動体に懸濁したことを示し、ビデオ6は2D腫瘍細胞クラスターが培養プレートおよび不動に取り付けられたことを示す。媒体の懸濁液は2Dのクラスタからそれらを区別する3D回転楕円の特徴である。培養皿内の培地が、培養培地を落としたりやさしくピペット化したりして邪魔されると、吊り下げられた3Dスフェロイドは移動し、一方、2D細胞クラスターは不動である。移動する単一の死細胞はごくわずかです。
図2Aは、腫瘍間質相互作用を研究し、CAFにおける細胞内Notch1シグナル伝達経路活性が癌幹細胞/開始細胞および回転楕円体形成をどのように調節するかを解明するためのユニークなプラットフォームとして機能するこの3Dモデルの例を示す。2組の線維芽細胞(Fb)は、機能の向上ノッチ1の皮膚から分離された(GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-;ROSALSL-N1IC+/+) マウスと対応する対照 (GOFctrl : FSP1.クレ-/-;ROSALSL-N1IC+/+) マウスおよび機能喪失ノッチ1 (LOFノッチ1: Fsp1.Cre+/-;Notch1LoxP/LoxP+/+) マウスと対応するマウスの対照 (LOFctrl : FSP1.クレ-/-;Notch1LoxP/LoxP+/+) マウス35それぞれ、すべての線維芽細胞をGFP/レンチウイルスによってトランスデュースし、DsRed/レンチウイルスを前回しにしたC8161黒色腫細胞でコ培養した。タイムラプスイメージングは、Fb-GOFNotch1がC8161黒色腫細胞が細胞コカルチャーの最初の〜4〜52時間の間にFb-GOFctrlと比較して3Dスフェロイドを形成するのを止めたことを示した。対照的に、Fb-LOFNotch1は、Fb-LOFctrlと比較してC8161黒色腫細胞による3Dスフェロイドの形成を促進した。図2Bは、上、様々なノッチ経路活動を行う異なる線維芽細胞を用いた細胞共培養の7日目に形成された3Dスフェロイドの代表的な画像を示す。図2Bは、下、様々なノッチ経路活動を担う異なる線維芽細胞を用いた細胞共培養の7日目に形成された3Dスフェロイドの平均サイズに関する定量的データを示す。
図3は、がん幹細胞/発起細胞の薬剤応答を試験するために使用されているこの3Dモデルの一例を示す。がんの幹/発起細胞は、薬剤耐性と癌の再発の原因であることが示されています。.したがって、この3Dモデルを用いて薬物反応を評価することは、がん治療に対する潜在的な薬物の臨床的有効性をよりよく明らかにすることができる。C8161黒色腫細胞は、細胞の増殖と浸潤のために活性MAPKシグナル伝達に依存しています。また、高レベルのCDK4/キットを発現していますが、BRAF変異は持っていません。この3Dモデルを用いて、癌幹細胞のMAPK阻害剤に対する薬物応答を試験するために、C8161黒色腫細胞と線維芽細胞を24のウェルプレートで共培養した。PD0325901 (資料表参照) MAPK阻害剤は、1 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM、および 25 nM からの濃度の範囲で連続希釈で調製しました。PD0325901を細胞混合物をメッキした時に細胞コカルチャーに添加した。未処理のコ養殖細胞をコントロールとして用いた。異なる薬物濃度下での細胞共培養の回転楕円体形成能を評価し、未治療の対照と比較した。図3Aは、異なる薬物濃度下での5日目の細胞共培養で形成された3D回転楕円体の代表的な画像を示す。図3Bは、異なる薬物濃度下での細胞コ培養の5日目に低電力場(LPFx4)で形成された回転楕円体当たりの平均サイズおよび3Dスフェロイドの数の定量データである。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig01.jpg"> 図1:3D回転楕円体と2次元クラスターの形成(A)ヒトC8161メラノーマ細胞とマウス皮膚線維芽細胞のコカルチャーにより形成された3Dスフェロイドの代表的な画像。黒色腫細胞と線維芽細胞の共培養7日目に3D回転楕円体を撮影した。回転楕円体の平均サイズは、日 ~5-7 で直径が約 170 ~ 360 μm (平均 = 275、SD = 37) でした。回転楕円体の平均数は、低電力場 (LPF x4) あたり 18 ~ 26 (20.5 ± 3.6) でした。(B) C8161黒色腫細胞の単一培養により形成された2D腫瘍細胞群の代表的な画像。黒色腫細胞の2D培養細胞群を7日目に撮影した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig02.jpg"> 図2:3Dスフェロイドモデルを用いた癌幹細胞/開始細胞の調節におけるCAFにおける細胞内Notch1シグナル伝達活性の役割の解明(A) CAFにおける細胞内Notch1シグナル伝達経路活性は、細胞共培養における黒色腫細胞によるスフェロイドの形成を決定した。タイムラプスビデオは、Fb-GOFNotch1がC8161黒色腫細胞による3Dスフェロイドの形成を停止し、Fb-LOFNotch1がC8161細胞コカルチャーの最初の4〜52時間の間にC8161黒色腫細胞によるより多くの3Dスフェロイドの形成を促進したことを示している。(B) 上: 様々なノッチ経路機能を担う異なる線維芽細胞を用いた細胞共培養の7日目に形成された3D回転楕円体の代表的な画像。下:様々なノッチ経路活動を担う異なる線維芽細胞を用いた細胞共培養の7日目に形成された3Dスフェロイドの平均サイズ(直径[μm]/スフェロイド)の定量データ。2尾の学生のt検定は、統計分析に使用されました。データは平均±標準偏差(SD)として表されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig03.jpg"> 図3:3D回転楕円モデルを用いた癌幹細胞/開始細胞の薬剤応答の評価(A)異なる薬物濃度下での細胞共培養の5日目に形成された3D回転楕円体の代表的な画像。(B) 異なる薬物濃度下で細胞コ培養の5日目に形成された平均サイズ(直径μm/回転楕円体)および3Dスフェロイド数(LPF x 4)の定量データ。定量的データは、平均±標準偏差(SD)として表される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig3alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Screenshot 1" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid01.jpg"> ビデオ1:細胞コカルチャーの初期段階における3Dスフェロイドの形成の動的プロセス。タイムラプスイメージングは、細胞コカルチャーの最初の~4〜52時間の間に、コカルチャーにおける線維芽細胞と腫瘍細胞との間の動的な細胞細胞相互作用および3Dスフェロイドの形成を示す。細胞は、コカルチャーの開始後約48時間で3D回転楕円体を形成し始めた。3Dスフェロイド形成のピークは、日〜5-7(ここでは表示されない)に発生した。3Dスフェロイドは線維芽細胞と黒色腫細胞で構成され、その大部分(約80%)が腫瘍細胞であった。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_1.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Screenshot 2" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid02.jpg"> ビデオ2:細胞コカルチャーの初期段階における2Dクラスターの形成の動的プロセス。タイムラプスイメージングは、単一培養におけるC8161黒色腫細胞によって形成された2Dクラスターの動的プロセスを示す。2Dクラスターの形成は、約日〜7-10で発生しました。タイムラプスイメージングは、DsRed+/C8161黒色腫細胞の単一培養における〜4〜52時間の期間を記録する。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_2.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Screenshot 3" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid03.jpg"> ビデオ3:共焦点顕微鏡で可視化された3D回転楕円体の構造と回転。3D回転楕円体のアーキテクチャと回転。緑色および赤色のレーザーを用いて、7日目に形成された回転楕円体を細胞コカルチャーでスキャンした。スキャン領域は10倍の目的で決定した。スキャンは、1 μm z ステップで、下から回転楕円体の上部まで開始します。3D回転の回転ムービーはフィジーのソフトウェアを使用して作成されました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_3.avi" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Screenshot 4" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid04.jpg"> ビデオ4:共焦点顕微鏡で可視化した2D腫瘍細胞群の構造と回転。2D クラスタのアーキテクチャと回転。細胞群の共焦点画像は、黒色腫細胞単一培養の7日目に撮影した。スキャン領域は10倍の目的で決定した。スキャンは、1 μm z ステップで、下から回転楕円体の上部まで開始します。2D クラスター回転ムービーは、フィジーのソフトウェアを使用して作成されました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_4.avi" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Screenshot 5" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid05.jpg"> ビデオ5:3D回転楕円体の動き。3Dスフェロイドは培養液中に吊り下げ、培養皿/ウェルに付着しなかった。細胞培養中の培地が緩やかなピペッティングによってよく邪魔されると、懸濁した3Dスフェロイドが移動した。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_5.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Screenshot 6" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid06.jpg"> ビデオ6:2D腫瘍細胞クラスターの安定度。2D腫瘍細胞群を培養液の乱れにもかかわらず培養プレートに固定し、不動にした。いくつかの単一の死んだ細胞は移動していた。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_6.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

腫瘍細胞と間質線維芽細胞のヘテロチピック相互作用に基づく新規三次元回転楕円体モデルが確立される。ここでは、腫瘍細胞と間質線維芽細胞の共培養、経時経過イメージング、および共焦点顕微鏡を紹介し、スフェロイドの形成を可視化します。この3次元モデルは腫瘍間質相互作用を研究し、癌の治療をテストするための適切なプラットフォームを提供する。

腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3D腫瘍球状モデル

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

私たちは、がんと間質の相互作用を研究し、癌治療をテストするためのプラットフォームを提供する新しい3Dスフェロイドモデルを開発しました。私の視点では、この3Dシステムは、本物の腫瘍状態をよりよく模倣するためにストロマ線維芽細胞の癌細胞を組み合わせたもので、したがって、創薬のための非常に強力なツールとなり得る。また、このモデルは黒色腫の研究に限定されない。これは、癌の他のタイプを調査するために使用することができます.この手順のデモンストレーションは、私の研究室のシニアサイエンティストであるホンウェイ・シャオ博士です。ヒト黒色腫細胞培養の場合、従来の接着細胞培養条件下で細胞を投げ、5%の二酸化炭素で摂氏37度でW489培地を完全に投げる。細胞が90%の合流度に達したら、細胞を1〜5の比率で分割する。マウス皮膚線維芽細胞培養の場合、採取した組織ペレットをPBSで洗浄してから、10%の胎児ウシ血清を添加したDMEMと、細胞培養インキュベーターでペニシリン・ストレプトマイシンを1%補充した。合流率が90%になったら、細胞を1対2の比率で分割します。コカルチャーをセットアップする前に、細胞の合流度が翌日約60%に達するように濃度で100ミリメートル皿に線維芽細胞を種付けします。翌朝、上清をGFPの1対3から1対5の濃度に置き換え、ポリブレンの1ミリリットル当たり4マイクログラムを添加した通常の培養培地中のストックから希釈したレンチウイルスに置き換える。上清を新鮮な培養培地に置き換える前に、細胞を細胞培養インキュベーターに6時間入れます。2日後、蛍光顕微鏡で細胞からのGFPシグナルを観察します。両方の細胞培養が安定的にトランスフェクションされた場合、両方の細胞培養を0.25トリプシン-EDTAから切り離して、センチメートルによって単一細胞懸濁液を収集する。細胞をコ培養培地濃度のミリリットル当たり10〜4番目の細胞の2倍に再懸濁し、メラノーマ細胞と線維芽細胞を1対1の比率で混合する。次に、各条件の24ウェルプレートと三重位の各ウェルに2ミリリットルの細胞を見て、細胞がプレート底に付着できるように細胞培養インキュベーターに4時間プレートを置きます。2D細胞クラスター形成を評価する黒色腫細胞単独培養については、24ウェルプレートの各ウェルに10〜4番目の黒色腫細胞を2回見て、細胞培養インキュベーターで7〜10日間培養する。次に、蛍光顕微鏡の標準プロトコルに従って、反転蛍光顕微鏡で細胞を撮影します。タイムラプス撮像システムがオフの場合は、イメージングの少なくとも1時間前にオンにします。システムの準備ができたら、慎重に培養プレートを顕微鏡のステージに移し、インキュベーターをスライドさせ、ドアをしっかりとロックします。タイムラプスイメージングシステムのソフトウェアを開き、容器を追加してプレートの種類とメーカーを選択し、顕微鏡がスキャンエリアを正確に見つけることができます。10倍の対物レンズと関心のあるウェルを選択し、スキャン領域のパラメータ、スキャンと開始時間と終了時間の間の間隔を設定します。次に、4時間から52時間の時間経過イメージングを記録します。画像記録の最後に、タイムラプスイメージングシステムソフトウェアを使用してデータを取得し、収集したビデオまたは画像セットをエクスポートします。共培養物の共焦点顕微鏡イメージングでは、プレートを反転蛍光顕微鏡のステージに置き、赤と緑のレーザービームを選択します。5~10倍の目的で細胞を観察し、スフェロイドを選択してスキャンを開始します。1ミクロンのzステップを使用して、回転楕円体の下から上までスキャンします。次に、適切な画像処理ソフトウェアを使用してデータを処理し、さらに回転して3Dムービーとして保存できる3D画像を再構築します。ここで、共培養した黒色腫細胞と線維芽細胞によって形成された多細胞3Dスフェロイドの画像が示されている。線維芽細胞の不在で培養された黒色腫細胞は典型的な3Dスフェロイドを形成しないが、一部の黒色腫細胞は拡張培養を伴う2Dクラスターを形成する。時間経過イメージングを用いて、線維芽細胞および腫瘍細胞は、約36時間でスフェロイドから始まる共培養において相互作用を観察することができる。本ムービーでは、培養の4〜52時間の単一培養黒色腫細胞凝集体形成の動的プロセスが観察できる。ここで、培養7日後の共焦点顕微鏡で3Dスフェロイド構造を観察することができ、一方、この映画では、2D細胞クラスターを可視化することができる。3Dスフェロイドは培養培地に懸濁したままで移動性であり、2D腫瘍細胞クラスターは培養プレートに付着する傾向があり、不動である。この3Dモデルは、腫瘍間質相互作用を研究するためのユニークなプラットフォームとして機能します。例えば、細胞間Notch1シグナル経路活性および癌関連線維芽細胞が癌の茎および開始細胞およびスフェロイド形成をどのように調節するかを解明する。さらに、このモデルは、癌幹細胞および細胞の薬剤応答をテストするために使用することができる。この方法は簡単かつ簡単ですが、適切な細胞密度と細胞比を使用し、例示したように適切な培養プレートを使用するように注意してください。この3Dモデルは、がん幹細胞の表現型を決定する重要な細胞内シグナル伝達経路活性を鎮静させるとともに、がん幹細胞が高感度である低分子化合物をスクリーニングする場合にも適用できます。

a-novel-stromal-fibroblast-modulated-3d-tumor-spheroid-model-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

さまざまな病気の徴候でもっと生理学的に関連するモデル開発およびに実装した創薬プログラムであります。ここで説明した新しいモデルのシステムは、回転楕円体を培養し、新しい抗がん剤を検索する高スループット 1536 ウェル プレート ベース...

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

ここで、両方のアーキテクチャを繰り返す 3 D...

黒色腫切片 3 D 回転楕円体の皮膚モデル

光コヒーレンストモグラフィ...

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

このプロトコルの目的は、免疫蛍光、転写などの異なる分析システムで対処することができる腫瘍バルク状環境における癌関連線維芽細胞(CAF)の分化を研究するために、インビトロモデルで3Dを確立することです。分析および生命細胞のイメージ投射。...

がん関連線維芽細胞分化とインビトロ研究における侵入のためのより生理学的システムとしての3Dスフェロイドモデル

このプロトコルは、繊維質間質コンパートメントを伴う3Dバイオミメティックモデルを提示する。細胞間相互作用、腫瘍増殖および転移の活性メディケーターである細胞外基質の生物物性を模倣した比率で生理学的に関連するヒドロゲルを調製した。...

神経癌の生物模倣モデルが、調整可能な生体特性を有する3D環境における腫瘍-ストロマ相互作用を研究する

関連するヒト疾患を忠実に再現する包括的な インビトロ モデルが欠けている。現在の研究は、ヒト肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を研究するための信頼性の高い インビトロ...

肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

多細胞3D腫瘍スフェロイドを肺腺癌細胞、線維芽細胞、および単球を用いて調製し、続いてこれらのスフェロイドから癌関連線維芽細胞(CAF)を単離した。単離されたCAFを正常な線維芽細胞と比較し、ミトコンドリアの膜貫通電位、活性酸素種、および酵素活性を研究することにより、ミトコンドリアの健康状態を評価しました。...

3D多細胞肺腫瘍スフェロイドから分離された癌関連線維芽細胞におけるミトコンドリアの健康評価

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。...

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

この記事では、3次元腫瘍スフェロイドを構築するための標準化された方法を示します。また、自動イメージングシステムを用いたスフェロイド観察と画像ベースの深層学習解析の戦略についても説明します。...

医薬品評価研究のための3D腫瘍スフェロイドの作製

本稿では、抗腫瘍抗体の重要ながん細胞死滅機構であるADCC機構を調節する化合物を同定する方法について紹介する。NK細胞の細胞毒性効果は、トラスツズマブの存在下で乳がん細胞スフェロイドで測定されます。画像解析により、スフェロイドの生細胞と死細胞、および標的細胞が同定されます。...

腫瘍スフェロイドモデルにおける抗体依存性細胞傷害性の定量化:創薬への応用

がんの転移を研究するためには、ヘテロセルのクロストークを捉える3Dがんモデルが急務となっています。私たちの研究は、侵入と細胞空間分布の研究に使用できる足場および足場のない環境でのヘテロ多細胞間質-上皮の生成を示しています。...

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

学ぶ 3D腫瘍球状モデルによる腫瘍間質相互作用の研究法。線維芽細胞と共培養し創薬スクリーニングに応用可能な革新的ながん研究プラットフォームを構築する手法です。

腫瘍間質相互作用と創薬を研究するための新規ストロマ線維芽細胞変調3D腫瘍球状モデル

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