Name: 高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶインフルエンザ擬似型粒子の製造法。H5N1およびH7N9由来のエンベロープ糖タンパク質を用いて高力性粒子を産生し、qRT-PCRで感染能を評価する。BSL-2環境で安全にウイルス再分節研究を行う手法です。

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この研究は浙江省医学・健康科学技術計画(グラント番号、2017KY538)、杭州市立医科医療技術計画(グラント番号、OO20190070)、杭州医科、及び杭州医科大学の助成金によって支えられた。技術キープロジェクト(グラント番号、2014Z11)と杭州自治体の自律的な社会開発と科学研究のアプリケーションプロジェクト(グラント番号、20191203B134)。

1. 1日目:細胞培養と播種
<ol><li>10%胎児ウシ血清(FBS)および100 U/mLペニシリンストレプトマイシン(DMEMコンプリートミディアム)を添加したダルベッコの変性必須培地(DMEM)を用いて、60mm皿でヒト胚性腎臓(HEK)293T/17細胞を培養し、 DCM)を37ωで、5%の二酸化炭素(CO2)インキュベーターを約80%のコンフルエントまでインキュベートする。 注:HEK 293T/17低通路セルをお勧めします。</li>
	<li>5 mL のリン酸緩衝生理食塩糸 (PBS) 1x で細胞を慎重に洗浄します。 メモ:HEK 293T/17セルの手動処理は、取り外しが容易なため、非常に穏やかでなければなりません。</li>
	<li>PBSを除去し、1 mLのトリプシンエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)溶液で細胞を解離します。37°C、5%CO2インキュベーターに入れ、細胞が解解けになるまで5分以内に入れます。</li>
	<li>DCM を 5 mL 追加してトリプシンを非アクティブ化します。細胞を上下に数回ピペットで単一細胞懸濁液に分散させます。</li>
	<li>細胞懸濁液をプレチルド15mL遠心管に移す。4°Cで5分間、250 x gで遠心分離して細胞を採取する。</li>
	<li>可能な限り多くの上清をデカントします。6 mL の DCM 培地で細胞ペレットを再サスペンドし、細胞をカウントします。DCM培地で細胞を1 x 106セル/mLに希釈します。</li>
	<li>細胞をウェルあたり1mLの細胞懸濁液を用いた6ウェルプレートにシードします。プレートを軽くたたいて、細胞を均等に分配します。プレートを37°C、5%CO2インキュベーターで一晩(14~16時間)インキュベートします。</li>
</ol>2. 2日目:リポフェクションによる4プラスミドコトランスフェクション
<ol><li>反転光顕微鏡で細胞の形態と密度を確認します。理想的には、細胞はトランスフェクション時に約85%のコンフルエントである必要があります。ウェルあたり1mLの無血清DMEM培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻します。 メモ:HEK 293T/17セルの手動処理は、取り外しが容易なため、非常に穏やかでなければなりません。</li>
	<li>トランスフェクトされる培養細胞のウェルごとに、トランスフェクション試薬の8μLを還元血清培地(チューブ1)で150μLの体積に希釈する。穏やかに混合し、室温で5分間インキュベート(RT、約20°C)。 注:トランスフェクションサンプルごとに、1.5 mLマイクロ遠心チューブを2本用意し、1と2を番号付けします。</li>
	<li>チューブ2では、プラスミドDNAの2.5μgを還元血清培地の150μLに希釈する。 注:チューブ2において、表1に示すように各プラスミドDNAを希釈する。VSVは広範囲の細胞に感染できるため、小胞性口内炎ウイルス(VSV)G糖タンパク質(プラスミドpLP-VSVG)をコードするプラスミドが陽性対照として用いられた。インフルエンザエンベロープ糖タンパク質を欠く負の対照粒子(Δenv pps)は、pcDNA-Gag-PolおよびpcDNA-GFPプラスミドを用いて生成した。</li>
	<li>5分インキュベーション後、希釈したDNAと希釈トランスフェクション試薬を組み合わせます。穏やかに混ぜ、RTでさらに15分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞および無血清培地を含む対応するウェルにDNA脂質複合体を添加する。プレートを前後に揺らして軽く混ぜます。</li>
	<li>37°Cで4~6時間インキュベートした後、5%CO2インキュベーターを取り出し、培地を取り出し、DMEMを2mLに交換します。37°、5%CO2インキュベーターでさらに36〜48時間インキュベートします。 注:無血清および抗体フリーのDMEMに交換してください。このプロトコルでは、2 つの HA と 2 つのナサを使用して 8 種類の pps を生成できます (表 1を参照)。</li>
</ol>3. 3日目:影響を受けやすい細胞の播種
<ol><li>感染性アッセイのために、96ウェルプレートでウェル当たり1 x 104細胞で各タイプの感受性細胞を播種する。 注:この記事では、歯槽由来ヒト細胞株(A549細胞)とマディンダービーイヌ腎臓(MDCK)細胞の2種類の標的細胞を使用して感染性アッセイを行います。MDCK細胞はインフルエンザの研究に広く用いられており、良好なコントロールとなり得る。この手順は柔軟です。他の標的細胞株は、研究要件に従って使用することができます。</li>
	<li>プレートを37°C、5%CO2インキュベーターで一晩(14~16時間)インキュベートします。</li>
</ol>4. 4日目:擬似型ウイルス粒子採取、定量、感染性アッセイ
<ol><li>擬似型ウイルス粒子採取<ol>
<li>メディアの色を確認します。理想的には、薄いピンクまたはわずかにオレンジでなければなりません。440~460nm以下の反転蛍光生物学的顕微鏡で細胞を調べます。</li>
		<li>36~48時間の経形で、0.45μmのポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜フィルターを通過してppsを収穫し、細胞破片を除去します。</li>
		<li>ppsを小さなボリュームのアリコートに分割します。</li>
		<li>ppsは-80°Cで保管してください。 注: プロトコルはここで一時停止できます。しかし、PPSの感染性は凍結および解凍後に急激に低下するので、これは推奨されません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>擬似型ウイルス粒子定量<ol>
<li>精製ppsの20μLを1.5mLリボヌクレアーゼ(RNase)フリーマイクロ遠心管に移す。</li>
		<li>0.24 U/mLベンゾナスヌクレアーゼを1μL加えます。37°Cで1時間インキュベートし、DNAおよびRNA汚染を排除します。 注:標的RNAは、一般的にダウンレギュレートされたサイトメガロウイルス(CMV)-GFP RNAは、ppsにパッケージ化されており、ベンゾナーゼヌクレアーゼによって分解されることを避けることができます。</li>
		<li>試料を-70°Cで凍結し、ベンゾニンゼヌクレアーゼを不活性化します。</li>
		<li>50分間50°Cで2μLのプロテイナーゼK.インキュベートを加えてエンベロープタンパク質を消化し、CMV-GFP RNAを放出します。プロテイナーゼKを100°Cで3分間不活性化する。</li>
		<li>ユニバーサルプローブワンステップRT-qPCRキットを使用したリアルタイム定量逆転写(qRT)-PCRによるppsの定量化は、フォワードプライマー5'-AACAAAAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTATTATtaTtaA-3'、逆プライマー5'-GGGTCTCTTGTGTACT-3'、およびプローブ5'-FAM-CCCCCAATGAAAGACCCCCCCC-TAM-3'、リアルタイムPCRサーモサイカー上。感染する前にRNAコピー数のppsを正規化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>感染性アッセイ<ol>
<li>qRT-PCR データの観点から各タイプの pps を 4 x 105コピー/mL (pp 正規化) に希釈します。</li>
		<li>トシル・フェニルアラニンクロロメチルケトン(TPCK)-トリプシンをH7N9 HAを収容するppsに40μg/mLの最終濃度に添加します。37°Cで1時間インキュベートし、機能サブユニットHA1とHA2を形成します。 注:彼らはHA1-HA2切断部位で複数のアルギニンおよびリジン残基を有するので、TPCK-トリプシンでH5を収容するppsを治療する必要はありません。この多塩基性切断部位は、ユビキタス細胞プロテアーゼによって切断することができる。</li>
		<li>正規化されたppsをDMEM培地(無血清)と1:1の比率(体積/体積)で混合します。</li>
		<li>感受性細胞を含むプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。</li>
		<li>上清を吸引し、前温PBSの0.1 mLで細胞を一度洗浄する。</li>
		<li>pps-DMEM 混合物の 0.1 mL を 1 ウェルに追加します。pps の各タイプの感染性テストを 1 つの影響を受けやすい細胞株にトリプリケートします (図 2を参照)。</li>
		<li>96ウェルプレートを37°C、5%CO2インキュベーターで4~6時間インキュベートします。</li>
		<li>上清を吸引し、DCMの0.1 mLに交換します。</li>
		<li>96ウェルプレートを37°C、5%CO2インキュベーターで24~36時間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 5日目または6日目:感染性検出
<ol><li>96ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。</li>
	<li>上清を吸引し、前温PBSの0.2mLで細胞1xを洗浄する。</li>
	<li>PBSを除去し、0.25%トリプシンEDTA溶液の0.1 mLで細胞の解ソを解除します。</li>
	<li>37°C、5%CO2インキュベーターで細胞が解解するまで3分間置きます。 注:これは細胞の塊につながるので、5分以上インキュベートしないでください。</li>
	<li>DCM を 0.4 mL 追加してトリプシンを非アクティブ化します。</li>
	<li>細胞を上下に数回ピペットで単一細胞懸濁液に分散させます。</li>
	<li>細胞懸濁液を冷却した1.5 mLマイクロ遠心管に移します。</li>
	<li>蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてGFPレポーター陽性細胞を決定します。 注:GFPレポーター陽性標的細胞の比率を決定するには、対照サンプル(pps未処理A549細胞またはMDCK細胞)を使用してフローサイトメーターゲートを設定し、サンプルあたり10,000細胞のGFPレポーター陽性細胞をカウントします。</li>
</ol>

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著者たちは何も開示する必要はない。

このプロトコルでは、BSL-2設定でインフルエンザウイルス擬似型粒子(pp)を生成する方法について説明する。レポータープラスミドpcDNA-GFPはppsに組み込まれ、感染性アッセイでFACSによってppsを定量するために使用することができる。インフルエンザの研究に広く用いられているため、2種類の影響を受けやすい細胞株を選びました。MDCK細胞は、これらの研究で使用される可変不死化ヒト細胞に良好な制御を提供するであろう。
このプロトコルは、GFPレポーターを組み込み、細胞膜上に芽を生成することができるレトロウイルスMLVに基づいています。この技術は、インフルエンザウイルス粒子4、22、23、24を包装するために広く開発されている。いくつかの他のシステムは、レンチウイルスHIV-1擬似タイピングシステム19、25、26<...

ウイルス粒子の使命は、感染した宿主細胞から非感染宿主細胞にそのゲノムを輸送し、それを複製能力のある形態1の細胞質または核に送達することである。このプロセスは、最初は宿主細胞受容体への結合によって引き起こされ、続いてビリオンと細胞膜の融合が続く。インフルエンザウイルスのようなエンベロープウイルスの場合、スパイク糖タンパク質は受容体結合および融合1、2を担う。ウイルスエンベロープ糖タンパク質(例えば、パイロゲン、抗原)は、ウイルスライフサイクル開始(結合および融合)、ウイルス病因、免疫原性、宿主細胞アポトーシスおよび細胞トロピズム、細胞内分泌経路、ならびに種間の伝染および再分類など、多くの重要な特性および事象に関与している。ウイルスエンベロープ糖タンパク質に関する研究は、ウイルス感染プロセスの多くの側面を理解するのに役立ちます。擬似型ウイルス粒子(pp)は、擬似ウイルスまたは擬似粒子とも呼ばれ、擬似タイピング技術8、9、10を介して生成することができる。この技術は、C型肝炎11、12、B型肝炎13、小胞性口内炎ウイルス(VSV)14、15、およびインフルエンザウイルス16、17、18、19を含む多くのウイルスの擬似型粒子を開発するために使用されている。この技術は、レンチウイルスまたは他のレトロウイルスのGag-Polタンパク質に基づいています。
擬似型ウイルス粒子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質発現プラスミドをコトランスフェクションすることにより3プラスミド系を用いて得ることができ、エンベロープenv遺伝子を欠損させるレトロウイルス包装プラスミド、およびppプロデューサー細胞に別のレポータープラスミドを得ることができる。レトロウイルスは、そのGagタンパク質によって組み立てられ、ウイルスエンベロープタンパク質1を発現する感染細胞膜から芽を出す。従って、レトロウイルスギャグタンパク質を用いて高力インフルエンザppsを得て、インフルエンザHAおよびNAを発現する細胞膜上に芽を生成することができる。これまでの研究では、すべての組み合わせにおけるHA/NAは機能的であり、ウイルスライフサイクル16、17、18、20、21で対応する機能を実行することができました。これらのppsは、ヘマグルチン酸、ノイラミニダーゼ活性、HA受容体結合トロピズム、および感染性を含むインフルエンザの生物学的特性を調べるために使用されます。HAとNAはいずれもウイルスのライフサイクルにおいて重要な表面機能タンパク質であるため、異なるインフルエンザに由来するHAとNAの不一致は、それらの間の再分け合いを部分的に示すことができる。ここでは、3プラスミド擬似タイピングシステムを用いて、2つのHAと2つのNA(HPAI H5N1株とH7N9染色に由来する)を組み合わせて8種類のインフルエンザppsを生成します。ppsのこれらの8つのタイプは、2つのネイティブpps、H5N1pp、H7N9ppが含まれています。2 つの不一致の pps, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp;1つの糖タンパク質(HAまたはNA)のみを収容する4つのpps、H5pp、N1pp、H7pp、N9pp.インフルエンザウイルスに関する研究、H5N1およびH7N9などの、バイオセーフティ要件によって制限される。野生インフルエンザウイルス株のすべての研究は、バイオセーフティレベル3(BSL-3)実験室で行われるべきである。擬似型ウイルス粒子技術は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)設定で人工ビリオンをパッケージ化するために使用することができます。したがって、ppsは、ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)の2つの主要な糖タンパク質に応じてインフルエンザウイルスプロセスを研究するためのより安全で有用なツールを表します。
このプロトコルは、3プラスミドコトランスフェクション戦略(図1で概観)を用いたこれらのppsの生成、ppsの定量方法、および感染性検出について説明する。ppの生産には3種類のプラスミドが含まれます(図1)。レトロウイルスGag-Polタンパク質をコードするgag-pol遺伝子をレトロウイルス包装キットからクローニングし、pcDNA 3.1プラスミドに挿入し、pcDNA-Gag-Polと名付けました。緑色蛍光タンパク質をコードする強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)遺伝子をpTRE-EGFPベクターからクローニングし、pcDNA 3.1プラスミドに挿入し、pcDNA-GFPと呼んだ。クローニング中に、プライマーを介して包装シグナル(ƒ)配列を追加した。HA遺伝子およびNA遺伝子を、それぞれpVRC-HAおよびpVRC-NAと名付けられたpVRCプラスミドにクローニングした。最後のプラスミドは融合タンパク質をコードし、目的の他の融合タンパク質と置き換えることができます。当社の擬似タイピングプラットフォームには、pVRC-HAとpVRC-NAの2つの糖タンパク質発現プラスミドが含まれています。これにより、BSL-2設定における異なるウイルス株間の再種合けに関する研究を簡素化することができます。

<table><tbody><tr><td>ベンゾナーゼヌクレア</td><td>ーゼミリポア</td><td>70664</td><td>効果的な粘度低下とタンパク質溶液からの核酸の除去</td></tr><tr><td>クリアフラットボトムポリスチレンTC処理マイクロプレート(96ウェル)</td><td>コーニング</td><td>3599</td><td>最適な細胞付着のために処理 ガンマ線による滅菌と認定された非発熱性 ウェル同定</td></tr><tr><td>のための個々の英数字コードクリアTC処理されたマルチウェルプレート(6ウェル)</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>ウェル同定のための個々の英数字コード 最適な細胞付着のために処理 ガンマ線照射による滅菌</td></tr><tr><td>ダルベッコの修飾必須培地(DMEM)</td><td>ギブコ11965092</td><td></td><td>多くの異なる哺乳類細胞の増殖をサポートするための広く使用されている基礎培地</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>エクセル</td><td>FND500</td><td>基本的な細胞培養、専門研究、および特定のアッセイに優れた価値を提供できるウシ胎児血清</td></tr><tr><td>蛍光活性化細胞選別(FACS)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>cytoflex</td><td></td></tr><tr><td>ヒト肺胞腺癌 A549細胞</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>ヒト胚性腎臓(HEK) HEK-293T/17細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td>多種多様な接着細胞株および浮遊細胞株を効果的にトランスフェクションすることが示されている汎用性の高いトランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>倒立型蛍光生物顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>倒立型光学顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>迅速、高感度、高精度のプローブベースのqPCR検出と標的RNAターゲットの定量。</td></tr><tr><td>Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit</td><td>NEB</td><td>E3006L</td><td>Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free-Non-pyrogenic</td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 mm, gamma sterilized</td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 & micro;m、PVDF</td><td>ミリポア</td><td>SLHV033RS</td><td>改良された最小必須培地(MEM)であり、細胞の増殖速度や形態を変えることなく、ウシ胎児血清の補給を少なくとも50%削減できます。Opti-MEM I培地は、リポフェクタミン試薬などのカチオン性脂質トランスフェクション試薬との併用にも推奨されます。</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>抗生物質のペニシリンとストレプトマイシンは、グラム陽性菌とグラム陰性菌に対する効果的な複合作用により、細胞培養の細菌汚染を防ぐために使用されます。</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>最大RCFは12,500 xg 温度範囲は-80 >Cから120 &deg;C RNase-/DNase-free 滅菌PP</td></tr><tr><td>遠心チューブ (15 mL)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>安定性と反応性の高いセリンプロテアーゼ</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>最適な細胞接着のために処理 ガンマ線による滅菌と認定された非発熱</td></tr><tr><td>性TC処理培養皿 (60mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>ウシ膵臓由来トリプシン TPCK処理済み、基本的に無塩、凍結乾燥粉末、&ge;10,000 BAEE単位/mg蛋白</td></tr><tr><td>質TPCKトリプシン</td><td>ΣT1426</td><td></td><td>トリプシンのこの液体製剤はEDTAおよびフェノール赤を含んでいる。Gibco Trypsin-EDTA は、ブタの膵臓に由来するプロテアーゼの照射混合物であるトリプシン粉末から作られています。トリプシンは、その消化強度により、細胞解離、日常的な細胞培養継代、および初代組織の解離に広く使用されています。解離に必要なトリプシン濃度は、細胞の種類や実験要件によって異なります。</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

高病原性h5n1および鳥類h7n9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

高病原性鳥インフルエンザA型ウイルスH5N1(HPAI H5N1)及びH7N9のヒト及びその致死性の時折の直接感染は、深刻な公衆衛生上の問題であり、流行の可能性を示唆している。しかし、ウイルスの分子理解は初歩的であり、そのエンベロープタンパク質の生物学的性質を治療標的として研究し、感染を制御する戦略を開発する必要があります。ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)エンベロープ糖タンパク質の機能解析、HAおよびNAの再種化特性を含む鳥インフルエンザウイルスを研究するための固体ウイルス擬似型粒子(pp)プラットフォームを開発し、受容体は、栄養、中和抗体、診断、感染性、薬剤開発およびワクチン設計の目的で。ここでは、2つのインフルエンザA型(HAPI H5N1および2013鳥類H7N9)からエンベロープ糖タンパク質(HA,NA)を用いてppsを確立するための実験手順について説明する。彼らの世代は、マウス白血病ウイルス(MLV)のようないくつかのウイルスの容量に基づいて、エンベロープ糖タンパク質をppに組み込む。さらに、これらのppsをRT-qPCRで定量化する方法、およびHとNの起源に応じてネイティブおよび不一致のウイルスppsの感染性検出についても詳しく説明します。このシステムは非常に柔軟で適応性があり、エンベロープドコードタンパク質を持つウイルスppsを確立するために使用することができます。したがって、このウイルス粒子プラットフォームは、多くの研究研究で野生ウイルスを研究するために使用することができます。

上記の一般的な手順に応じて、2つのグループHA/NまたはVSV-G糖タンパク質または非エンベロープ糖タンパク質を組み合わせた10種類のppsを生成しました(表1を参照)。そのうち7人は感染性です。エンベロープなし糖タンパク質または唯一の港NAを収容するppsは、ここでの感染性を示さなかった。インフルエンザpp産生手順は図1に概観されている。ppsの透過電子顕微鏡写真(例えば、H5N1pp)を図3に示す。これらのppsの感染性アッセイの結果を図4に示す。7種類のppsの感染率は、細胞当たりのゲノムコピー(GCP)で評価した[感染の多重度(MOI)]値20.H5を抱くppsグループでは、 H5N1、(H5+N9)、およびH5の感染率は90.05±4.05%、17.78±1.58%、10.15±2.85%の細胞株A549および40.37±4.92%、5.24±1.32%、4.88±0.27%であった。H7を抱くppsグループでは、 ...

このプロトコルは、2つのインフルエンザA株からエンベロープ糖タンパク質を有する高力性ウイルス性偽型粒子(pp)を生成する実験プロセスと、その感染性を決定する方法を記述する。このプロトコルは、異なるエンベロープ糖タンパク質を持つエンベロープウイルスの他のタイプのppsを開発するために非常に適応性があります。

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

インフルエンザウイルスPPを産生し、その感染性を決定するこの技術は、BSL-2都市におけるインフルエンザウイルスの研究を簡素化することができる。PPSのqRT-PCRデータに基づいて、感染のPPSを正規化した。2つの糖タンパク質発現プラスミドがコード化され、ウイルス再分類に関する研究を簡素化することができます。細胞の播種の翌日、逆光顕微鏡で細胞の形態と密度を確認します。理想的には、細胞はトランスフェクションで約85%コンフルエントでなければなりません。培地をウェルあたり1ミリリットルの無血清DMEMに置き換え、プレートをインキュベーターに戻します。トランスフェクションされる細胞のウェルごとに、トランスフェクション試薬の8マイクロリットルを、血清培地を減らして150マイクロリットルの体積に希釈する。溶液をやさしく混ぜ、室温で5分間座らせます。一方、プラスミドDNAの2.5マイクログラムを158マイクロリットルの減らされた血清培地に希釈する。5分間のインキュベーションの後、希釈したDNAと希釈トランスフェクション試薬を組み合わせ、溶液を軽く混合し、室温で15分間放置します。DNA脂質複合体を、無血清培地中の細胞と対応するウェルに添加する。その後、前後に揺らすことでプレートを穏やかに混ぜます。プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%を4~6時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、1ウェルあたり2ミリリットルのDMEMに交換します。その後、さらに36〜48時間インキュベートします。各タイプの感受性細胞をウェルあたり10,000個の細胞と96ウェルプレートでシードします。その後、37°Cと5%の二酸化炭素インキュベーターで一晩プレートを残します。トランスフェクション後3日目に、ピンクやオレンジを薄くする必要がある培地の色を確認し、440〜460ナノメートルの波長の下で反転したフローレス生物顕微鏡で細胞を調べます。トランスフェクション後38~48時間で、0.45マイクロメートルのポリビニリデンフッ化膜フィルターを通過して細胞の破片を除去し、少量のアリコートに分けてマイナス80°Cで保存することで、pseuotyped型粒子またはPPSを収穫します。PPSを定量化するには、精製されたウイルス粒子の30マイクロリットルを1.5マイクロリットルのRNase-フリーチューブに移し、ベンゾナーゼヌクレアーゼを1マイクロリットル加えます。DNAおよびRNA汚染を除去するために、チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをマイナス70°Cに凍結してヌクレアーゼを活性させ、2マイクロリットルのプロテイナーゼK.Incubateを30分間添加してエンベロープタンパク質を消化し、CMV-GFP RNAを放出します。その後、3分間摂氏100度でプロテアーゼKを非活性にします。テキスト原稿で指定されたプライマーおよびプローブでユニバーサルプローブワンステップRT-qPCRキットを使用して、定量的な逆転写RTPCRでPPSを定量化します。PPSを1ミリリットル当たり10~5回目のRNAコピーの4倍に正規化します。その後、H7N9ヘマグルチニンを収容するPPSに1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度にTPCK-トリプシンを加えます。PPSを摂氏37度で1時間インキュベートし、機能サブユニットHA1とHA2を形成します。正規化したPPSとDMEM培地を1対1の比率で混合し、感受性のある細胞を含むプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。上清を吸引し、100マイクロリットルの予め温めたPBSで細胞を1回洗浄します。各ウェルに100マイクロリットルのPPS-DMEM混合物を加え、各タイプのPPSの感染性試験を1つの感受性細胞株に3トリクロミケートする。37°Cと5%の二酸化炭素で4〜6時間プレートをインキュベートします。その後、上清を吸引し、感染検出前にさらに24〜36時間プレートをインキュベートするDCMの100マイクロリットルに置き換えます。私たちの結果は、PPSは現在、人々に感染していると考えられています。従って必要な安全なガードのプロシージャは、マスクを着用し、バイオセーフティキャビネットで感染アッセイを行うなどの取ることを推奨します。このプロトコルは、2つのグループ化されたヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ属の胞口炎ウイルスG糖タンパク質またはエンベロープ糖タンパク質を有する10種類の擬似型粒子またはPPSを生成するために生成した。PPSを透過型電子顕微鏡で画像化し、その感染率をA549とMDCKの2つの細胞株で評価した。H5を収容するPPS群では、H5N1、H5プラスN9およびH5の感染率は、それぞれ約90%18%、細胞株A549と40%5%および5%であった。H7を収容するPPS群では、H7N9、H7プラスN1およびH7の感染率は、それぞれ約10%7%、細胞株A549、8%4%および1%であった。血液胞性口内炎ウイルスG糖タンパク質PPの感染率は、A549で約21%、MDCK細胞で16%であった。デルタエンベロープ糖タンパク質PPは感染性を示さなかった。PPプロデューサーHEK-293T/17細胞は、この手順の基礎を構成することを覚えておくことが重要です。したがって、最適な成長は私たちにHEK-293T / 17細胞を教えてくれるのが最も重要です。この手順に従うか、またはL2受容のような他の試験に従って、境界アッセイを行うことができる。このアッセイは、受容体好みの生物学的特異性をほとんど取り除き、パターンはPPSのトロピズムを明らかにすることができる。彼らはインフルエンザウイルスから糖タンパク質を取ったので、2プラスマックスにクローン化されます。HAとNAタンパク質は別々に研究することができるので、それらの間で再分類を行います。変異体および成熟した効果を探索することができる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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