Name: ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ精子細胞からの減数分裂染色体調製法。核表面広がり技術と超高解像度顕微鏡を用いて、減数分裂前期の染色体構造を可視化する効率的なプロトコルを解説します。

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私たちは、原稿とアン・グエンに関するコメントに対するトレント・ニューマンとマスダ・シャリフィに感謝します。この作品は、S.M.Bに授与されたNIH R01 GM079115によってサポートされました。

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</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

ここでは、ゼブラフィッシュ精巣から分離された精子から広がる核表面におけるテロメアおよび染色体関連タンパク質の位置を探査する方法について説明する。我々は、これらの方法が精巣の大きさに調整して他のテレオスト種の精子細胞の分析に適用可能であることを期待する。
ゼブラフィッシュのマイオティックタンパク質に対して抗体が少ないのに対し、ヒト(h)またはマウス(m)タンパク質に上げられた以下の抗体を用いて成功を収めています。我々の研究室では、シナプトン複合体(SC)の信頼できるマーカーとして機能した鶏のゼブラフィッシュSycp1タンパク質(zfSycp1)に対する抗体を上げましたが、このタンパク質は染色体が完全にシナプス化されている初期のジゴテンから後期パチテンにのみ存在します。ウサギ抗hSYCP3抗体は、レプトテンから後期パチテンにおけるSCの溶解までマイオティック染色体軸を検出するのに非常に信頼できるものでした(図1B,C)。特に、Sycp3によって定義された全長軸を有する古典的なジプロテン段階とS...

性的生殖は、2つのハプロイド・アプタの組み合わせを通して進行し、それぞれが体細胞の染色体補体の半分を運ぶ。Meiosisは、DNA複製の1ラウンドと染色体分離の2つの連続したラウンドを通じてハプロイドのアホテを生成する特殊な細胞分裂である。前相Iでは、相同染色体(ホモログ)は、対合、組換え、およびシナプス化を受けなければならないが、後者は、横断フィラメントによって架橋された2つの相同軸を含むシナプトン複合体の形成によって特徴付けられる、Sycp1(図1A、B)。これらのプロセスを適切に実行しないと、人間の流産の主な原因である異常の多い球体の生産につながる可能性があります1.組み合わせ、組換え、シナプスの間の協調に関する我々の知識は、酵母、C.エレガンス、マウス、ショウジョウバエなどの幅広い生物の研究によって促進されてきた2。相同染色体の組み合わせの一般的なプロセスは、分離が続くが十分に保存されているが、組換えとシナプス化への依存性とこれらのイベントの順序は異なります。
相同の組換えを開始するマイオティック二重鎖破断(DSB)形成は、レプトテンおよびシナプスの間に花束に集まったテロメアの近くで発生し、シナプスは3、4の直後に続く。DSB形成およびシナプス開始のこの構成はまた、ヒトにおける男性のマイオシスの特徴であるが、マウス5、6、7、8では、 ゼブラフィッシュがヒト精子形成のモデルとして役立つことを示唆している。ゼブラフィッシュのマイオーザ症を研究するいくつかの実用的な利点もあります。男性と女性の両方が成人期を通じてゲーム形成を受け、生殖腺は簡単にアクセスでき、何百もの子孫が単一の十字架から生成されます。さらに、胚は透明であり、外部的に発達し、これは、異常体素3、9による胚発生における収差の早期発見を容易にする。ゼブラフィッシュを使用することの欠点は、性的成熟度(約60日)に達するのが遅く、核表面に必要な物質の量は、その大きさに応じて〜10〜20匹の成虫動物から収集されなければならないということです。
マイオティック染色体広がり製剤は、マイオティック染色体ダイナミクスの主要なシグネチャを調べることができるので、すべてのモデル生物間で染色体ダイナミクスを研究するための重要なツールです。ゼブラフィッシュでは、マイオティックプログラムと核組織の進行の重要な側面は、魚3、4、9、10、12によるタンパク質および/または核酸の免疫蛍光検出のための抗体を用いて、ここで染色体拡散と呼ばれる核表面広がりを探査することによって解剖されてきた。実際、花束中のクラスター化テロメアの偏光局在化は、スプレッド製剤中に保存することができる(図1C)。最近では、ゼブラフィッシュの精子染色体を蛍光検出法や超解像顕微鏡法とともに用い、ゼブラフィッシュテロメアダイナミクス、相同染色体の組み合わせ、二重鎖破壊局在化、および主要なマイオティック遷移におけるシナプスの詳細な進行を解明した。ここではゼブラフィッシュ精巣の精子から発色広がりの染色体を調製し、続いて蛍光ペプチド核酸(PNA)プローブで染色し、染色体関連タンパク質の繰り返しテロメア配列と免疫蛍光検出を行う方法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL遠心分離チューブ</td><td>いくつかの商用ブランドが利用可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL微量遠心チューブラック</td><td>いくつかの商用ブランドが利用可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16%ホルムアルデヒド、メタノールフリー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>2 mL</td> いくつかの<td>商用ブランドが利用可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm ガラスカバースリップ</td><td>コーニング</td><td>2980-245</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 mm ガラスカバースリップ</td><td>VWR インターナショナル</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐形遠心分離管</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>363696</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブバッグ</td><td>いくつかの商用ブランドが利用可能</td><td></td><td>プラスチック製のカバースリップを作るために使用されます。</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1605-100</td>滅菌<td>蒸留水で100mg / mlのストック溶液を調製します。</td></tr><tr><td>セルストレーナー、100 & マイクロ;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CF405M ヤギ 抗チキン IgY (H+L)、高度に交差吸着された</td><td>Biotium</td><td>203775-500uL</td><td>1:1000</td></tr><tr><td></td><td>で使用 バージェス研究所で生成</td><td>N/A</td> 1<td>:100 で使用</td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Coplin 瓶</td><td>数個利用可能な</td><td></td><td></td>商業ブランド</tr><tr><td>DNase I、ウシ膵臓からのグレードII</td><td>ロシュ診断</td><td>10104159001 ダル</td><td></td></tr><tr><td>ベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT10014CV</td><td></td></tr><tr><td>デュモンNo.5鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-30</td><td>精巣の解剖には2つが必要です。</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes, 5 mL</td><td>VWR International</td><td>89429-308</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP228-100</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ニワトリIgY(H+L)二次抗体, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11039</td><td>1:1000で使用</td></tr><tr><td>ヤギ抗ニワトリIgY(H+L)二次抗体, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11042</td><td>1:1000で使用</td></tr><tr><td>ヤギの抗hDMC1</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-8973</td><td>私たちの手では機能しません</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)交差吸着二次抗体、アレクサフロー488サー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11008</td><td>1:1000</td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ウサギIgG(H + L)交差吸着二次抗体で使用、アレクサフルーア594</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11012</td><td>1:1000</td></tr>ヤ<tr><td>ギ血清</td><td>で使用Sigma-Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>湿度チャンバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-112-3683</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>VWR インターナショナル</td><td>230401V (モデル 5420)</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター シェーカー</td><td>ニューブランズウィック サイエンティフィ</td><td>ック モデル クラシック C25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーScientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimerbly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>湿度チャンバーに使用</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>いくつかの市販ブランドが利用可能</td><td></td><td>少なくとも~1.65倍の倍率が可能な標準的な顕微鏡で十分です。</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>マウス アンチハムスターSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>私たちの手では機能しません</td></tr><tr><td>マウス 抗hMLH1</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>550838</td><td>私たちの手では機能しません</td></tr><tr><td>マウス 抗hRPA</td> シ<td>グマ-アルリッチ</td><td>MABE285</td><td>私たちの手</td></tr><tr><td>では機能しませんNa2HPO4 &middot;7 H2O</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200 solution</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>74257</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック・トランスファー・ピペット</td> いくつかの<td>市販ブランドが利用可能</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PNA TelC-Alexa647</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1013</td><td>メーカーごとに準備の指示。</td></tr><tr><td>PNA TelC-Cy3</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>製造元の指示に従って準備します。</td></tr><tr><td>ProLong Diamond 退色防止封入剤</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗hRPA</td><td>ベチル</td><td>A300-244A</td><td>1:300 で使用</td></tr><tr><td>ウサギ抗 hSCP3</td><td>Abcam</td><td>ab150292</td><td>1:200 で使用</td></tr><tr><td>ウサギ抗 hRad51</td><td>GeneTex</td><td>GTX100469</td><td>1:300で使用</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>スーパーカットはさみ、30°C、角度、10cm</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>50-822-353</td><td>また、任意の小さなハサミを使用できます。</td></tr><tr><td>シルガードキット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9897184</td><td>メーカーの指示に従って準備します。</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>滅菌蒸留水で希釈して、20%の作業溶液を作ります。室温で保存してください。Triton X-100は、水で希釈すると沈殿物を形成します。沈殿物は一晩で溶解します。</td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ワージントン 生化学</td><td>LS003708</td><td></td></tr><tr><td>鶏卵白からのトリプシン阻害剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td>滅菌蒸留水で希釈して 20% の作業溶液を作ります。室温で保存してください。</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 4 mm (マイクロハサミ)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosisは、性的生殖のためのハプロイドの解球を作成するために必要な重要な細胞プロセスです。モデル生物は、ペアリング、シナプス、適切な染色体分離を保証する組み換えイベントなど、マイオティックの前相中に起こる染色体事象を理解するのに役立っています。マウスは、これらのプロセスの根底にある分子メカニズムを理解するための重要なモデルであったが、このシステム内のすべてのマイオティック事象は人間のマイオーシスに類似しているわけではない。我々は最近、ヒト精子形成のモデルとしてゼブラフィッシュのエキサイティングな可能性を実証した。ここでは、染色体広がり製剤におけるマイオサイト染色体および関連タンパク質を可視化する方法について詳しく説明します。これらの製剤は、染色体構造の高解像度分析を可能にするという利点を有する。まず、成体ゼブラフィッシュから精巣を解剖し、続いて細胞解離、分解、染色体の広がりについて説明する。次に、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション(FISH)による生声染色体タンパク質の局在を検出する方法について、免疫蛍光検出、および核酸配列を挙げる。これらの技術はゼブラフィッシュ系におけるマイオティッククロマチンアーキテクチャの細胞学的分析に有用なツールセットを含む。ゼブラフィッシュコミュニティの研究者は、これらの技術を迅速に習得し、生殖機能の標準的な分析に組み込むことができるはずです。

ゼブラフィッシュの精子拡散製剤を準備・可視化する方法を概説した。正しく実行すると、我々の手順は、よく広がり、重複しない核をもたらす。このような核を回収するには、適切な量の出発物質(すなわち、精巣)を有し、トリプシンおよび十分な数のDNase I処理において十分な時間の精巣を治療することが重要である。これらのスプレッドは、テロメアおよびマイオティックタンパク質に染色して、プロフェーズIの間にマイオティック進行を研究することができる。 
<img alt="減数分裂細胞におけるSycp3,Sycp1蛋白質のシナプトネマ複合体図,蛍光顕微鏡観察" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60671/60671fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data...

核表面の拡散は、間見下がれの間に染色体の事象を研究するために不可欠なツールです。ゼブラフィッシュの精子から前相Iの間にマイオサイト染色体を調製し、可視化する方法を実証する。

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

ゼブラフィッシュは、相同染色体ペア、シナプス、組み換えを含むmeiosの染色体事象を研究するための優れた脊椎動物モデルとして浮上しています。この核表面拡散プロトコルは、超解像顕微鏡を用いて、大染色体アーキテクチャの主要な特徴を可視化することを可能にしました。研究者は、他のゼブラフィッシュスプレッドプロトコルよりも少ない破片でスライドあたり何百もの十分に広がる核を期待することができます。この手順の最も技術的に困難な部分は、皮膚に近接し、他の器官にも付着しているので、ゼブラフィッシュ精巣の解剖です。解剖手順を視覚化することで、研究者は動物の組織に埋め込まれた生殖腺を見たときに何を期待するかを知ることができます。オスのゼブラフィッシュを安楽死させた後、小さなはさみで一度に1匹の魚を切断し、マイクロハサミを使って腹側の正中線に沿って切断して体腔を露出させます。シリコーンコーティングされたペトリ皿に魚を入れ、1X PBSの浅いプールで覆います。1.65倍の倍率で顕微鏡の下で、鉗子を使用して精巣を解剖する。精巣からできるだけ多くの脂肪と周囲の組織を取り除きます。周りの脂肪は少し暗い外観を持っている可能性がありますが、腺は解剖スコープの光の下に半透明に表示されます。脂肪のいくつかの量は、手順を妨げることなく、生殖腺に残される可能性があります。解剖された精巣を2ミリリットルのDMEMを用いた5ミリリットルチューブに直接加え、氷の上に置いてください。精巣細胞を解約するには、精巣で5ミリリットルチューブに200マイクロリットルのコラゲターゼ溶液を加える。溶液を数回反転して混ぜます。32°Cで100 RPMでインキュベーターシェーカーで精巣をそっと振ります。10分ごとにチューブを迅速に反転し、解離を容易にします。1 時間後、DMEM は曇りになり、精巣は小さな塊になります。精巣はコラゲラーゼでインキュベートされている間、摂氏37度に0.1モルスクロース溶液の100マイクロリットルを前温。コラゲターゼを洗い流すために、DMEMを5ミリリットルの最終体積に加え、チューブを数回反転します。ペレットは、室温で3分間200gで精巣を出す。上清の3ミリリットルを取り除き、2ミリリットルしか残らないようにします。DMEMを2回繰り返します。最後のDMEM洗浄後、上清を4ミリリットル除去し、DMEMを1ミリリットル、トリプシン溶液200マイクロリットル、DNase I溶液20マイクロリットルを添加します。チューブを数回反転して溶液を混合します。100 RPMで32°Cで管を水平に振ります。解離を容易にするために、5分ごとにチューブを迅速に反転させます。5 分から 15 分経過すると、DMEM ソリューションには束がほんのわずかしか含み欠かねます。トリプシン阻害剤溶液500マイクロリットルとDNa

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-zebrafish-spermatocytes

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

これは、すぐに紫外線で不活化精子と受精した後、第二減数分裂をブロックすることにより、雌性発生二倍体のゼブラフィッシュの胚（遺伝のみ寄与母親由来胚）を生成するための方法です。...

初期の圧力による雌性発生二倍体のゼブラフィッシュを作成

植物におけるFISHのための適切な高速空気乾燥滴下染色体製造方法

有糸分裂はすべての生物にとって重要であり、欠陥はしばしば癌や発達障害を引き起こします。このイメージングプロトコルとゼブラフィッシュをモデルシステムとして使用することで、研究者は生きた脊椎動物の有糸分裂と、有糸分裂プロセスに欠陥がある場合に生じる多数の欠陥を視覚化することができます。...

ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

倍数性操作のための修正されたプロトコルは、初期胚に細胞質分裂における1サイクルのストールを誘導するために熱ショックを使用しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュで実証されているが、他の種にも適用可能です。...

熱ショック2処理とゼブラフィッシュ胚の倍数性マニピュレーション

減数分裂は、DNA 複製の単一の円形および染色体の 2...

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。さらに、5...

全体の睾丸針によるゼブラフィッシュを精原細胞の凍結保存に超急速冷却浸漬

哺乳類の卵形成がエラーを起こしやすい、染色体の紡錘のために特に知られています。この原稿は、マウス前期, クロマチンを広める準備方法をについて説明します中期私と卵母細胞の II...

クロマチン広がるマウス卵母細胞の進行を前期から中期 II の分析のための準備

ここでは、成人マウス精巣から生の大腸および後の大動脈芽細胞を分離する簡単で効率的な方法を提示する。低細胞毒性、バイオレット励起DNA結合色素および蛍光活性化細胞選別を使用して、多くの下流用途に対して非常に富んだ精子細胞集団を単離することができる。...

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

ここでは、ゼブラフィッシュの卵巣卵胞で濾胞細胞と卵母細胞を分離するための簡単な方法を提示し、ゼブラフィッシュにおける卵巣の発達の調査を容易にする。...

ゼブラフィッシュの卵巣卵胞における濾胞細胞と卵母細胞の分離

CRISPR-Cas技術は、ゲノム編集の分野に革命をもたらしました。ただし、目的の生殖細胞系列編集を見つけて分離することは、依然として大きなボトルネックです。したがって、このプロトコルは、標準的なPCR、制限消化、およびゲル電気泳動技術を使用して、F0...

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。...

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

学ぶゼブラフィッシュ精子細胞からの減数分裂染色体調製法。核表面広がり技術と超高解像度顕微鏡を用いて、減数分裂前期の染色体構造を可視化する効率的なプロトコルを解説します。

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

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