アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床試験におけるDMD患者サンプルにおけるエキソンスキップ効率の特徴付け
2020年5月7日
ここでは、サンガーシーケンシング、RT-PCR、ウェスタンブロッティングを用いたジストロフィン38発現の分子特性を臨床試験で紹介する。
このプロトコルは、DMD分野で信頼性の高い結果を得るために重要である前臨床設定および臨床試験で筋肉組織を調製し、処理するための標準化された方法論を提供する。このテクニックは、DMD の試行をスキップする場合に関連しています。そして、主な利点は、それらが十分に確立され、まとめて行われれば再現可能であるということです。
これらの技術は主にDMDでのエキソンスキップに焦点を当てていますが、プライマーの変更により、スプライシング療法で治療される他の疾患にも同じ技術を適用できます。これらの方法は、エキソンスキップ効率とRNAおよびタンパク質の両方を達成するために使用することができる。分析用のサンプルを調製するには、まず、ガムが柔らかく粘着性になるまで、トラガカンスガムと水の等量を混合します。
この混合物を25ミリリットルのシリンジにロードし、0.5〜1センチメートルのガムを個々のコルクディスクに分配します。反対側にディスクにラベルを付け、液体の一部が凍結するまで液体窒素にイポランタンの容器を置きます。各標本を、コルクに対して垂直な各筋肉の縦軸を持つディスク上のトラガカンスガムに入れる。
各筋肉の底にガムを置いて筋肉を所定の位置に保持し、ピンセットを使用して冷たいイセペンタンの標本を凍結します。試料を1分間連続的に移動するか、完全に凍結するまで、一時的にドライアイスに置きます。その後、標本をガラスバイアルに入れ、摂氏80度の貯蔵を行います。
分析のために凍結した筋肉組織を切り離すために、クライオスタットを25°Cの作動温度に設定し、筋肉ブロックをホルダーに取り付けます。平らな切片が達成されるまで組織ブロックをトリミングします。逆転写PCRおよびウェスタンブロット分析では、厚さ10マイクロメートルのスライスを得る。
免疫体化学分析のために、6〜8マイクロメートルの厚いスライスを得て、そしてヘマトキシリンおよびエオシン染色のために、10〜12マイクロメートルの厚いスライスを得る。獲得後、スライスした切片を2本のミリリットルチューブに入れる。PCRおよびウェスタンブロッティングのサンプルを摂氏80度で保存してください。
ここで、マイクロチップ電気泳動システムは、逆転写酵素PCR反応のゲル画像、および用量エスカレーションフェーズ1でアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置前後の2人の患者からのスキップされたバンドのシーケンシング結果を示す。両方の患者は、削除を抱えています。予想通り、治療前に、両方の患者はスキップを示さなかったし、唯一のスキップされていないバンドを視覚化することができた。
12週間の治療の後、2番目の患者のために明確にスキップされた下のバンドを視覚化したが、第1の患者に対して任意のスキップされた製品を検出することは依然として困難であった。シーケンシング結果は、第2の患者に対してエキソン47と54、および第1の患者に対してエキソン44と54の連結を示した。スキップされたパーセンテージを計算するために、スキップされたバンドのモル濃度をスキップバンドとスキップされていないバンドで割った値です。
予想通り、治療前にウェスタンブロットによってジストロフィンバンドが検出されなかった。治療後、健常性コントロールで観察されたものと比較して、分子量が低い第2の患者からバンドを検出した。しかし、最初の患者は、治療後に検出可能なレベルのジストロフィンを示さなかった。
筋肉組織を正しく処理し、各標本をトラガカンスガムに一貫した方法で配置することが重要です。組織切片は、人工PCR、デジタルPCR、ウェスタンブロット、免疫組織化学、および異なるタイプのオミクスを含む多くの異なる方法で分析することができます。これらの技術は、加速することができ、開発、異なるエキソンを標的とする薬物をスキップする追加のエキソン、およびDMDの編集においてウイルスベースの開発に再び適用することができる。
概要
本研究では、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）に関連する臨床試験における、筋肉組織の調製および取り扱いの標準化された手法を提示します。特に、効果的な治療法の開発に不可欠なエキソン・スキッピング技術に焦点を当てています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 臨床試験
背景
- デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、重度の筋萎縮を伴う疾患です。
- エクソンスキッピングは、DMDに対する有望な治療アプローチです。
- 正確な実験結果を得るためには、信頼性の高い組織ハンドリングが不可欠です。
- 標準化された手法により、研究における再現性を向上させることができます。
研究目的
- 筋肉組織調製のための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
- DMDのエキソンスキッピング試験を促進すること。
- スプライシング療法で治療される他の疾患にも適用可能なフレームワークを提供すること。
使用方法
- トラガカントガムとイソペンタンを用いた筋肉組織の調製。
- 分析のための筋肉サンプルの凍結および切片作成。
- ジストロフィン発現を検出するための逆転写PCRおよびウェスタンブロッティング。
- エキソンスキッピング効率を分析するためのシーケンシング。
主な結果
- 治療を受けた患者におけるスキップされたバンドの可視化に成功。
- 治療後の患者1名においてジストロフィンの検出を確認。
- 患者間における治療反応のばらつき。
- 正確な結果を得るための、一貫した組織ハンドリングの重要性を強調。
結論
- 標準化された手法は、DMD治療を前進させるために極めて重要です。
- エクソンスキッピングは有望視されていますが、さらなる最適化が必要です。
- 今後の研究では、これらの手法を基盤として、より幅広い応用へと展開することが可能です。
よくある質問
業界における重要性
本プロトコルは、DMD患者サンプルにおけるエクソンスキッピング効率を評価するための標準化されたワークフローを確立するものであり、アンチセンスオリゴヌクレオチド開発におけるターゲットバリデーションを直接的に支援します。分子レベルでの機能回復を定量的に測定することを可能にすることで、viltolarsenのようなエクソン53スキッピング治療法のメカニズム的なリスク低減を実現します。このアプローチは、生化学的な読み出しを治療メカニズムに結びつけることで、前臨床から臨床へのトランスレーションにおける予測の信頼性を高めます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 患者由来サンプルを用いて、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるエキソンスキッピングを治療仮説として検証することを可能にします。
- 運用の価値： 標的分子活性を確認するための、再現性のあるサンガーシーケンシング、RT-PCR、およびウェスタンブロットの手法を提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： エクソンスキッピング効率の用量反応評価のための、スキップバンド対合計バンドの定量比を算出します。
- 運用的価値： 組織調製および切片作成プロトコルを標準化し、前臨床および臨床サンプルセット全体におけるアッセイの再現性を確保します。
翻訳および前臨床研究
- 科学的価値：実際の患者の筋生検におけるジストロフィン回復を特性解析することで、疾患に関連したシステム解析を支援します。
- 運用の価値：モデルシステム全体で一貫した分子読み取り値を使用することにより、発見から前臨床検証までの連続性を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットバリデーションからリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、機能的な有効性試験の前に、メカニズムの分子レベルでの確認を可能にします。
- 探索生物学： 患者サンプルにおいてオンターゲットのエキソン接合補正を確認し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの仮説検証を裏付ける。
- スクリーニング： ゲルイメージングおよびシーケンシングを通じてエキソンスキッピング率を定量的に提供し、化合物の比較を可能にする。
- 分析： モル濃度に基づくスキップバンドの定量化を行い、用量間および患者間の比較分析を可能にする。
- トランスレーショナルリサーチ： 分子レベルのエキソンスキッピングをジストロフィンタンパク質の検出に関連付け、RNAレベルのメカニズムとタンパク質レベルの結果を橋渡しする。
- エンタープライズ再利用： 複数のエキソン標的およびスプライシング療法に適用可能な、再利用可能な組織処理および分析フレームワークを確立する。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ヒト組織におけるエキソンスキッピングとジストロフィン回復を直接可視化することで、メカニズム上のリスクを軽減する。
- 運用的価値：標準化されたトラガカントガムによる包埋および凍結切片作成により、サンプルの整合性を確保し、ばらつきを低減する。
- 戦略的価値：機能的なエンドポイントに達する前に、ターゲットへの結合を分子レベルの根拠で示すことで、GO/NO-GO判断の指標とする。
- ポートフォリオへの影響：関連する患者の遺伝子型におけるエキソンスキッピング効率に基づき、アンチセンスオリゴヌクレオチドのリスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- RT-PCR、ウェスタンブロッティング、サンガーシーケンシングを含む分子生物学的手法の専門知識が必要です。
- 組織切片作成のためのクライオスタット装置、および急速凍結のための液体窒素/イソペンタンに依存します。
- 施設間またはタイムポイント間でサンプルの完全性を維持するために、標準化された組織処理プロトコルが必要です。
- エクソンスキッピング検出用のプライマーを設計する際、患者個別の変異による変動を考慮しなければなりません。
- デジタルPCRまたはキャピラリー電気泳動による検証がない場合、ゲルベースの手法の半定量的な性質による制限があります。
