Name: 超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 学ぶ、cryoAPEX法を用いた膜蛋白質の電子顕微鏡局在化解析。HEK293細胞でAPEX2タグ付きタンパク質を可視化し、ウイルス複製メカニズムや細胞構造の保存を研究する強力な手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ここで説明するプロトコルは、Senguptaら、細胞科学ジャーナル、132(6)、jcs222315(2019)48による出版物に由来する。 この研究は、国立衛生研究所のR01GM10092(S.M.へ)とAI081077(R.V.S.)、インディアナ州臨床翻訳科学研究所のCTSI-106564(S.M.へ)、PI4D-209263(S.M.)による感染症・感染症研究所の助成金によって支えられている。

1. 細胞培養とトランスフェクション
<ol><li>播種HEK-293T細胞は直径60mm以上の組織培養皿に、37°Cおよび5%CO2で細胞培養インキュベーターで60%~90%の合流点に成長する。</li>
	<li>トランスフェクション試薬を用いたAPEX2タグ付き哺乳動物発現プラスミドを有するトランスフェクション細胞(材料表を参照)。</li>
	<li>トランスフェクション後 12~15時間で、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を1回洗浄します。PBSでやさしく洗って皿から細胞を取り出します。特定の細胞型に対して必要な場合は、トリプシンなどの解離試薬を使用してもよい。5分間500xgで遠心分離し、ペレットを形成する。
</li>
</ol>2. 化学固定とペルオキシダーゼ反応
<ol><li>慎重に上清を除去し、2%グルタルアルデヒド(v/v)の2 mLで0.1 Mナトリウムカコジレートバッファー、pH 7.4、室温でペレットを再懸濁します。氷の上にサンプルを置き、30分間インキュベートします。 この時点からステップ2.3.3まで、サンプルと溶液を氷上に保管し、4°Cで遠心分離を行います。 注意:グルタルアルデヒドとナトリウムカコジレートバッファー(ヒ素を含む)の両方が有毒です。取扱いの際には、適切な安全手順と個人用保護具を使用する必要があります。グルタルアルデヒドおよび/またはカコジレートナトリウムバッファーを含む溶液は、有害な化学廃棄物として処分する必要があります。</li>
	<li>ペレットを3倍に5分間洗浄し、2 mLの0.1 Mカコジレートナトリウムバッファーを使用します。これらの後のスミッシュと同様に、必要な溶液中の細胞ペレットを静かに再懸濁し、500 x gで5分間遠心分離し、上清を慎重に除去して廃棄する。サンプルの損失を最小限に抑えるために、繰り返しペレット化および再懸濁ステップを使用して注意する必要があります。</li>
	<li>ペルオキシダーゼ反応を行う<ol>
<li>0.1 Mカコジレート酸ナトリウム緩衝液中に3,3'-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)の1mg/mLを含む新鮮な溶液を調製する。5~10分の激しい渦によってDABを溶解します。 注意:DABは有毒であり、潜在的な発がん性物質であり、適切な安全手順と個人用保護具で処理する必要があります。DABを含むソリューションは、有害な化学物質廃棄物として処理する必要があります。</li>
		<li>3 mLのDAB溶液で再懸濁し、続いて500 x gで5分間ペレットを洗浄します。</li>
		<li>ペレットを過酸化水素を添加した3mL DAB溶液に再懸濁し、最終濃度5.88mMを達成した。客室内で30分間インキュベートします。ペレットは、不溶性DAB反応生成物の存在を示す目に見えて茶色になります。 注: DAB インキュベーション時間は、サンプルごとに最適化する必要があります。色の変化は軽い顕微鏡で監視することができる。私たちの経験では、ほとんどのタンパク質に対して15〜45分のインキュベーションが適切です。過酸化水素は、開いたてのボトルまたは開封後に十分に密閉されたボトルから得る必要があります。</li>
		<li>細胞をペレットし、0.1 Mカコジレート緩衝液で5分間2x洗浄し、続いてダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)または選択した細胞培地で1回洗浄する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10%のウシ胎児血清と15%ウシ血清アルブミンを含むDMEM(または選択した他の細胞培地)のクライオプロテクター溶液の500μLで細胞ペレットを再懸濁する。ペレットは再び、厚い凍結保護溶液中のペレットを達成するために必要な場合は500xgから遠心分離機の速度をわずかに増加させる。上清の大部分を捨て、ペレットが乾燥しないように十分な液体が残っていることを確認します。高圧凍結器に細胞ペレットを輸送します。</li>
</ol>3. 高圧凍結
<ol><li>高圧冷凍庫の貯蔵庫を液体窒素(LN2)で満たし、ポンプを開始してサンプルチャンバをLN2で満たします。 注意:液体窒素を使用する場合は、適切な安全手順と個人用保護具を使用してください。 注:これらのステップは、Leica EMPACT2高圧冷凍庫に固有のものです。</li>
	<li>実験室の拭き取りまたはペーパータオルのコーナーを使用して、細胞ペレットから残りの液体を取り除きます。十分な液体は、ペレットが歯磨き粉と同様の一貫性でペーストを形成することを残すべきである。20 μLピペットチップに吸引できるほど薄くする必要があります。</li>
	<li>細胞ペレットの吸引2~3μLを膜担体に付着させます。膜キャリアの井戸を完全に充填し、表面張力が上にわずかなドームを作り出しますが、液体がウェルからこぼれないようにします。気泡は存在しないはずです。</li>
	<li>膜キャリアをカートリッジにスライドさせて固定します。準備と準備が済んだ HPF マシンにカートリッジを入れ、スタートボタンを押してフリーズします。</li>
	<li>温度対時間と圧力対時間グラフを調べて、圧力が2100バールに達し、温度が200 ms以内で-196 °Cに達したことを確認し、測定の600ミリ秒で両方のパラメータが安定したままであることを確認します。</li>
	<li>細胞ペレットが使用されるか、または必要な数のサンプルが凍結されるまで、手順 3.3 ~ 3.5 を繰り返します。</li>
	<li>カートリッジをLN2に浸したまま、各膜キャリアをカートリッジから取り出し、プラスチックカプセルに入れ、LN2でいっぱいのクライオバイアルにプラスチックカプセルを入れる。 注: ここでプロトコルを一時停止できます。サンプルを含むクライオバイアルは、凍結した箱またはクライオボックスのLN2デュワーに格納することができます。</li>
</ol>4. フリーズ置換
注意:液体窒素を使用する場合は、適切な安全手順と個人用保護具を使用してください。さらに、ステップ4で利用される化学物質の多くは、タンニン酸、四酸化オスミウム、酢酸ウラニルを含む有毒である。これらの化学物質は、適切な安全手順に従って取り扱い、有害な化学物質廃棄物として処分されなければなりません。
<ol><li>自動凍結置換ユニットに LN2を入力します。温度を-90°Cにします。</li>
	<li>FS ミックス 1 を準備し、FS を開始します。<ol>
<li>化学フードに、0.2%のタンニン酸(w/v)と5%のDI水をアセトンに、アリコート1サンプル当たり1mLの溶液をクライオバイアルに調製します。凍結するLN2に入れる。</li>
		<li>FSミックス1バイアルと冷凍細胞ペレットを含むクライオバイアルをFSユニットのサンプルチャンバーに入れます。膜キャリアを含む内部カプセルをLN2バイアルからFS Mix1を含む対応するバイアルに移す。</li>
		<li>FS プロトコルを開始し、最初のステップは-90°Cで24時間です。24時間後、FSを一時停止し、サンプルを-90°Cに冷却したアセトンで5分間3x洗浄した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>FSミックス2を準備し、FSを完了 注意:四酸化オスミウムは、確立された安全プロトコルに従って訓練を受けた個人によってのみ処理されるべき非常に有毒で酸化性の化学物質です。オスミウム含有溶液の貯蔵と廃棄のためのプロトコルに従うだけでなく、四酸化オスミウムが使用されているラボ領域の標識が必要です。四酸化オスミウムは、目の保護、完全な腕の保護を提供するラボコート、二重ニトリル手袋、および任意の呼吸器を含む個人的な保護具を備えた化学フードで扱われるべきです。<ol>
<li>化学フードに、1%の四酸化オスミウム、0.2%酢酸ウラニル、および5%のDI水の溶液をアセトンで調製する。アリコート1サンプルあたり1 mLをクライオバイアルに入れ、LN2に入れ、凍結する。 注:タンニン酸(アセトンでは10%/v)、四酸化オスミウム(アセトンでは10%w/v)、酢酸ウラニル(メタノールで8%w/v)のストック溶液を準備し、FSミックスの調製を容易にするためにLN2デワーの凍結バイアルに貯蔵することができます。</li>
		<li>FSミックス2を使用したクライオバイアルをFSユニットに入れ、カプセルを第3のアセトン洗浄からFSミックス2バイアルに移します。FSミックス2で-90°Cで72時間インキュベートし、続いて12〜18時間にわたって0°Cまで緩やかに加温した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>温度を0°Cに保ち、開いたてのボトルからあらかじめ冷却したアセトンで30分間3倍洗います。</li>
</ol>5. 樹脂の浸潤と埋め込み
注意:ここで使用される樹脂(材料表参照)は、重合前に有毒であり、適切な安全手順と個人用保護具で取り扱う必要があります。非重合樹脂は有害な化学廃棄物として処分する必要があります。
<ol><li>新たに開いたボトルからアセトンに溶解した樹脂濃度の増加に伴いサンプルに浸透します。メーカーの指示に従って樹脂成分A、B、Dをプラスチックビーカーに調製し、0°Cでそれぞれ2%、4%、8%の2hの樹脂濃度でサンプルをインキュベートします。インキュベートは、15%、30%、60%、90%、および100%樹脂で、各温度で4時間ずつ行う。成分A、B、C、およびDの混合物で4時間インキュベートする。</li>
	<li>細胞ペレットを持つ膜キャリアを平らな埋め込み型に上げ、樹脂(A、B、C、D)で充填します。サンプルの紙ラベルは、この時点で井戸に追加することができます。</li>
	<li>24-36時間の60°Cのオーブンで重合する。 注: プロトコルは重合後に一時停止できます。</li>
	<li>モールドからブロックを取り出し、冷まします。膜キャリアを除去するために、まず、サンプルを超微小体の垂直チャック内に配置し、拡大して可視化することができる。膜キャリアから膜キャリアを分離し、膜キャリア上の液体窒素を組み合わせて金属をプラスチックから分離し、カミソリブレードを使用して膜キャリアの周りの樹脂を切り離す。分離したら、ブロックの表面に細胞ペレットドームを残して膜キャリアを静かに持ち上げます。</li>
	<li>最初の金型よりもわずかに深い平らな埋め込み金型に、露出したセルペレットを上向きにしてブロックを配置し、樹脂で満たします。60 °Cで 24~36時間重合します。 注: プロトコルは重合後に一時停止できます。</li>
</ol>6. セクション
<ol><li>カミソリの刃を使用して、セルペレットの周りのブロックをトリミングします。次に、ブロックをサンプルチャックのウルトラミクロトームの断面アームに配置します。ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、ブロックを細胞ペレットを囲む台形にトリミングします。</li>
	<li>ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、細胞ペレットの90 nmの超薄型セクションを取得します。</li>
	<li>TEM グリッド上のセクションのリボンをピックアップします。Formvarでコーティングされた銅製のスロットグリッド(1 x 2mm2スロット)は、シリアルセクションのイメージングに便利です。ろ紙の端を吸い取ってグリッドを乾燥させ、TEMグリッド収納ボックスに保管します。 注: プロトコルは、セクション化後に一時停止できます。</li>
</ol>7. TEM イメージング
<ol><li>TEMホルダーにグリッドを取り付け、顕微鏡に入れます。CryoAPEXサンプルのスクリーニングには、80kVのTecnai T12を日常的に使用しています。APEX2標識で、対象細胞や細胞内構造の画像を取得します。</li>
	<li>必要に応じて、鉛ポスト染色を用いて追加の膜コントラストを得る。非ポスト染色サンプル(図2I-K)とリードポスト染色サンプル(図2A-H)の比較については、図2を参照してください。<ol>
<li>乾燥グリッドを薄めた塩化ナトリウム溶液(約1.5mM)の滴で下にフロートし、それぞれ1分間2倍、10分間1x。</li>
		<li>1分間のサトの鉛溶液の滴にグリッドを浮かべ、1分間塩化ナトリウム溶液3xに浮かべて洗浄し、DI水3xで1分間、グリッドから余分な液体をブロットし、グリッドボックスに保管します。 注意:鉛は有毒な化学物質であり、適切な安全手順と個人用保護具で取り扱う必要があります。鉛を含む溶液は有害な化学廃棄物として処分されるべきである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>TEM上の画像ポスト染色サンプル。 注:TEMの従来のサンプル調製では、TEMイメージングの前に鉛の対照ステップが実行されます。ただし、cryoAPEX サンプルの場合は、コントラストのないサンプルで最初にイメージングを行うことをお勧めします。これにより、タグからの信号は、より軽く染色された細胞構造との強いコントラストによって容易に見つけることができます。多くのサンプルでは、これ以上の染色は必要ありません。ただし、膜のコントラストを追加したい場合は、鉛ポスト染色(ステップ7.2)を実行し、サンプルを再イメージ化することができます。</li>
</ol>

著者らは利益相反を宣言していない。

ここで提示されるcryoAPEXプロトコルは、細胞環境内の膜タンパク質の局在を特徴付ける堅牢な方法を提供します。遺伝的にコードされた APEX2 タグを使用すると、目的のタンパク質の正確な局在化が実現するだけでなく、クライオフィクセションと低温脱水を使用することで、周囲の細胞の超構造の優れた保存と染色が実現します。これらのアプローチを組み合わせることで、細胞内のコンテキスト内で高精度でタンパク質を局地化するための強力なツールです。
この方法の進歩の核心は、従来のTEM法による調製後に経験した超構造の喪失は、固定ステップ40ではなく脱水工程から主に来るという事実である。以前は、ペルオキシダーゼの反応前に化学固定が必要なため、ペルオキシダーゼベースの方法はHPF/FSと互換性がないと考えられていました。これを回避するために、CryoCHEMという名前のプロトコルが最近開発され、サンプルが最初に凍結され、続いて再水和とペルオキシダーゼ反応49が行われた。このアプローチは、サンプル染色および保存...

生物学的研究には、細胞内およびオルガネラ内の細胞内タンパク質局在化を解決する問題が含まれることがよくあります。免疫蛍光顕微鏡はタンパク質局在化の有用な低分解能のビューを提供し、超解像イメージングにおける最近の進歩は、蛍光タグ付きタンパク質1、2、3の解像度の限界を押し上げている。しかし、電子顕微鏡(EM)は、タンパク質の標識は課題であるが、高解像度の細胞超構造をイメージングするためのゴールドスタンダードのままです。
歴史的に、超構造タンパク質局在化の問題にアプローチするためにいくつかのEM法が使用されてきた。最も一般的に利用されている方法の1つは、抗原特異的一次抗体を使用して目的のタンパク質を検出する免疫電子顕微鏡(IEM)です。EMシグナルは、電子密度の高い粒子と共役する二次抗体の適用により生成され、最も一般的には金金4、5がコロイド状である。あるいは、大根ペルオキシダーゼ(HRP)などの酵素と結合した抗体は、6,7,8の電子密度の高い沈殿物を製造するために使用することができる。IEM には、事前埋め込みと埋め込み後のラベリングという 2 つの主要なアプローチがあります。事前埋め込みIEMにおいて、抗体は細胞に直接導入され、細胞9、10、11の光固定および透過性化が必要となる。両方のステップは、超構造12、13を損傷する可能性があります。1.4 nmナノゴールドと結合した抗体Fab断片からなるかなり小さい抗体の開発は、非常に穏やかな透過性条件を使用することができます。しかし、ナノゴールドはTEMの下で直接可視化するには小さすぎて、14、15、16を見えるようにするために追加の強化ステップが必要です。埋め込み後IEMでは、固定、脱水、および樹脂17への埋め込みによって完全に処理された細胞の薄い切片に抗体が適用される。このアプローチは浸透化ステップを回避しますが、サンプル調製を通して目的のエピトープを維持することは困難である18,19,20.光固定法に続いて凍結、凍結分断、抗体検出により、エピトープ保存21,22が改善されました。しかしながら、クライオ超ミクロトミーの技術的要件は、細胞内で達成される最適でないコントラストと同様に、23の欠点である。
遺伝的にコードされたタグを使用すると、目的のタンパク質の検出に関連するIEMの多くの困難が排除されます。HRP、フェリチン、リース、ミニソグ、メタロチオーネイン24、25、26、27、28、29、30、31、32を含む様々なタグが利用可能です。これらの各方法には、以前の方法よりも利点がありますが、それぞれが広く使用されるのを妨げる欠点もあります。これらの欠点は、サイトゾル中のHRPの不活性からフェリチンタグの大きなサイズ、ReAsHの光感受性、およびメタロチオネインの細胞染色との相溶性の小さいサイズおよび適合性の欠如まで及ぶ。近年、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ由来のタンパク質が、APEX233,34というEMタグとして設計されている。ペルオキシダーゼとして、APEX2は3,3'ジアミノベンジジン(DAB)の酸化を触媒し、目的タンパク質(25nm未満)33、35から最小の拡散で局所EMコントラストを提供するために四酸化オスミウムと反応する沈殿物を生成することができる。従来のHRPベースの方法とは異なり、APEX2は非常に安定しており、すべてのセルラーコンパートメント33でアクティブなままです。サンプルは、従来のEMサンプル染色法と、周囲の構造33、34、36の良好な可視化を可能にする方法を使用してTEM用に処理することができる。サイズが小さく、安定性と汎用性が高いため、APEX2は大きな可能性を秘めたEMタグとして登場しました。
上で論議したアプローチの多くは、超構造保存、クライオフィクセションおよび低温凍結置換における現在の最新技術と組み合わせることができないか、まだ組み合わせられていない。したがって、正確なタンパク質局在性を決定するために、膜保存や細胞染色の欠如に苦しんでいます。これは、取得できるデータの解決と解釈を必ずしも制限します。高圧凍結(HPF)によるクライオフィケーションは、液体窒素中の試料を高圧(約2,100bar)で急速に凍結し、水性試料の結晶化ではなくガラス化を引き起こし、したがってほぼ天然状態の細胞を37、38、39に保存する。HPFは、凍結置換(FS)、低温(-90°C)のアセトンでの脱水を、四酸化オスミウムや酢酸ウラニルなどの典型的なEM染色剤とインキュベーションと組み合わせた。HPFとFSは、従来の化学固定(アーティファクトにつながる可能性のあるより長いプロセス)や室温または氷上でのアルコール脱水(脂質および糖の抽出につながる可能性がある)に対して明確な利点を提供し、したがって、タンパク質検出のための最良のEMタグと組み合わせることが望ましい。
HPF/FSがAPEX2標識と組み合わされていない理由の1つは、光化学固定がペルオキシダーゼ反応の前提条件であり、DAB反応生成物の拡散を制限していることである。これまでのAPEX2研究では、固定およびペルオキシダーゼ反応は、染色およびアルコール脱水33、36のための伝統的なEM法が続いている。しかし、HPF/FSによる化学的固定に続いて、従来の化学固定とアルコール脱水単独で40を保存する上で明確な利点を提供することが示されている。従来のTEMサンプルに見られる超構造的完全性の喪失は、脱水よりも固定に関連していないように見え、これは通常、室温または氷上でアルコールを使用して行われ、脂質および糖40、41の抽出につながる可能性がある。クライオAPEX法を開発するために、化学固定とペルオキシダーゼ反応、続いてHPFおよびFSが超構造保存の面で最適な結果を生み出すと仮定した。
ここでは、APEX2 タグと cryofixation とフリーズ置換メソッドを組み合わせた cryoAPEX プロトコルを紹介します (図 1)。この簡単なプロトコルは、対象となる APEX2 タグ付けされたタンパク質のトランスフェクション、細胞の化学固定、およびペルオキシダーゼ反応から成ります。HPFとFSは、次いで典型的な樹脂埋め込みと薄い断面化を行います。TEMイメージングは、この方法を用いた超構造の優れた保存を明らかにする。さらに、高分解能細胞内局在化および小胞体(ER)内腔タンパク質の空間分布が観察された。この方法は、電子顕微鏡分析のために細胞内の膜タンパク質局在化の検出に広く有用である。私たちの手では、この方法は、HEK-293T(ヒト胚性腎臓)、HeLa(ヒト子宮頸癌)、Cos7(アフリカの緑のサル腎臓線維芽細胞)、BHK(ベビーハムスター腎臓)など、組織培養で成長した様々な細胞株に成功しています。詳細な指示は、HEK-293T細胞を使用して以下に説明します。

<table><tbody><tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン四塩酸塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>アセトン (ガラス蒸留)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>ビーカー;プラスチック、使い捨て 120 cc</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>極低温保存バイアル、2 mL</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修正イーグルスミディアム</td><td>コーニング</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka、単一成分 A、M エポキシ樹脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka、単一成分B、硬化剤964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka、単一成分C、加速器960(DY 060)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka、単一成分D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>埋め込み金型、標準フラット、14 mm x 5 mm x 6 mm</td>電子<td>顕微鏡Sciences</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>埋め込み型、標準フラット、14 mm x 5 mm x 4 mm</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清;Nu-Serum IV 成長培地 サプリメント</td><td>コーニング</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>ガラス ナイフ ボート、6.4 mm</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>ガラス ナイフメーカー</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド 10% 水溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>高速移送システム付き高圧冷凍庫</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td>ズ EM PACT2</td><td>アーカイブ製品 ライカ EM ICE</td></tr><tr><td>過酸化水素 30% 溶液</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>EM PACT2 用メンブレンキャリア、1.5 mm x 0.1 mm</td><td>マガー・サイエンティフィ</td><td>ック 16707898</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム、結晶</td><td>性電子顕微鏡科学</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20X、超高純度グレード</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>AFS/AFS2 用プラスチックカプセル、5 mm x 15 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>スロットグリッド、2 x 1 mm 銅、Formvar サポートフィルム付き</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムカコジル酸緩衝液、0.2 m、pH 7.4</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、ペレット 500 g (ACS)</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Tanning Acid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿、ポリスチレン、滅菌、コーニング、100 mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラガラスナイフストリップ</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate Dihydrate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオapex法

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

シグナル伝達や膜の密転のような主要な細胞イベントは、細胞コンパートメント内の適切なタンパク質位置に依存します。タンパク質の正確な細胞内局在化を理解することは、多くの生物学的な質問に答えるために重要です。タンパク質の局在化と適切な細胞保存と染色を組み合わせた堅牢なラベルの探求は、歴史的に困難でした。電子顕微鏡(EM)イメージングの最近の進歩は、細胞の保存と標識標的タンパク質を増加させる多くの方法と戦略の開発につながっています。比較的新しいペルオキシダーゼベースの遺伝的タグであるAPEX2は、クローン可能なEM活性タグの有望なリーダーです。透過型電子顕微鏡(TEM)の試料調製も近年、高圧凍結(HPF)によるクライオフィク沈作の出現と、凍結置換(FS)による低温脱水および染色の出現とともに進んでいる。HPFおよびFSは、TEMイメージングのための細胞超構造の優れた保存を提供し、第2は、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的に、二次的な光子試料のイメージングを行う。ここでは、Apex2 タグを HPF と FS と組み合わせた cryoAPEX メソッドのプロトコルを紹介します。このプロトコルでは、目的のタンパク質にAPEX2がタグ付けされ、続いて化学固定とペルオキシダーゼ反応が行われます。従来の染色や室温でのアルコール脱水の代わりに、試料を凍結固定し、FS経由で低温で脱水と染色を行います。CryoAPEXを使用すると、目的のタンパク質を細胞内のコンパートメント内で識別できるだけでなく、構造的に保存された膜内のそのトポロジーに関して追加情報を解決することができます。この方法は、オルガネラ内のタンパク質分布パターンを解読し、1つのオルガネラ内のタンパク質の区画化を他の未標識オルガネラに近接して区別するのに十分な高い解像度を提供できることを示す。また、CryoAPEXは、組織培養で増殖した細胞に対して手続き的に簡単かつ受け入れやすい。これは、典型的なクライオフィクセションと凍結置換方法と同じ技術的に困難ではありません。CryoAPEXは、遺伝的にタグ付けできる膜タンパク質のTEM分析に広く適用可能です。

従来の固定と脱水を用いたcryoAPEX法を用いた超構造保存を比較するために、小胞体膜(ERM;ER膜)ペプチドをAPEX2でタグ付けし、HEK-293T細胞にトランスフェクトした。ERM-APEX2は、ERの細胞質面に局限し、組織化平滑ER(OSER)34、42、43として知られている形態学的に異なる構造にER構造を改造する。OSERの形態は、超構造保存を比較するのに最適な領域として機能する滑らかで平行な、密積層膜の領域を含む。従来の APEX 法によるサンプルの調製により、OSER 構造の明確なラベル付けが行われた (図 2A–D)。高倍率での検査では、積層膜がフリルで現れ、同心円膜密度の間に不均一なギャップが存在し、膜保存と脂質抽出が不十分であることが示された(図2D)。</st...

このプロトコルは、APEX2タグ付けされた膜タンパク質を、最適に保存された細胞超構造内の透過電子顕微鏡法によって局在させることができるクライオAPEX法を記述する。

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

この方法は、膜の完全性と細胞内アーキテクチャを維持しながら、膜タンパク質の染色能力を兼ね備えています。したがって、膜関連タンパク質を正確に局所化するのに本当に強力です。この技術の主な利点は、信頼性の高い遺伝的に複製可能なタグであるAPEX2を、低温置換および凍結置換を含む電子顕微鏡の細胞保存における最先端の方法と組み合わせることである。これらを組み合わせることで、保存状態の良い細胞内での正確なタンパク質の局在化が可能になります。このプロトコルは、ウイルスがホストセル内で複製するメカニズムを解剖するために使用できます。ウイルスは、多くの場合、感染スキーム中にホストタンパク質をハイジャックします.ウイルスは小さなゲノムであり、これらの宿主細胞の中で複製するために利用する。最近では、未公開のデータで、この技術を使用してこれらのタンパク質にラベルを付け、ウイルスがどのように複製するかを理解することができました。この技術は、ゴルジの崩壊を引き起こす細菌毒素に関する最近の共同研究で本当に重要であることが判明しました。cryoAPEXを用いて、通常の免疫蛍光技術を使用して見るのが本当に難しい断片化したゴルジ片で毒素を正確に局地化することができました。この技術を実証することは、大学院生のエレイン・ミヘルクと、私たちの研究室の研究員ステファニー・エンジェルです。HEK293細胞を皿に播種した後、製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いて、APEX2タグ付き哺乳動物発現プラスミドで細胞をトランスフェクトする。トランスフェクション後12~15時間で、PBSで細胞を1回洗います。その後、PBSで細胞を皿から15ミリリットルの円錐管に洗い流します。500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を慎重に取り除き、ペレットを2%グルタルアルデヒド2ミリリットル、0.1モルのカコチル酸ナトリウムを室温でpH 7.4で再懸濁します。サンプルを氷の上に置き、30分間インキュベートします。次いで、試料を摂氏4度で5分間5分間500xgでペレット化する。ペレットを摂氏4度で遠心分離して0.1モルカコチル酸ナトリウムバッファーの2ミリリットルでそれぞれ5分間3回洗浄します。遠心分離後、上清を取り除く。ペルオキシダーゼ反応を行うために、ペレットを3ミリリットルのDAB溶液で再懸濁し、その後500xgで5分間ペレット化して洗浄する。その後、ペレットを5.88ミリモル過酸化水素で3ミリリットルのDAB溶液で再懸濁する。室温で30分間インキュベートします。ペレットは目に見えて茶色色になり、不溶性DAB反応生成物の存在を示す。DMEMでカコチル酸ナトリウムバッファーで再び洗浄した後、原稿によると、10%のウシ胎児血清および15%ウシ血清アルブミンを含むDMEMの凍結保護剤溶液の500マイクロリットルの細胞ペレットを再中断する。細胞懸濁液を0.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。ペレットを再度、500xgから遠心分離速度をわずかに増加させる。上清の大部分を捨て、ペレットが乾燥しないように十分な液体が残っていることを確認します。実験室のワイプまたはペーパータオルの角を使用して、細胞ペレットから残りの液体を離します。ペレットがペーストを形成するのに十分な液体を残し、歯磨き粉と同様の一貫性を保つ。細胞ペレットの2〜3マイクロリットルを吸引し、膜キャリアに堆積させる。表面張力が上にわずかなドームを作成するように、膜キャリアのウェルを完全に充填します。膜キャリアをカートリッジにスライドさせて固定します。カートリッジを準備済みでプライミングした HPF マシンに入れ、押してフリーズします。カートリッジを液体窒素に浸したまま、膜キャリアをカートリッジから取り出します。プラスチック製のカプセルに入れ、プラスチックカプセルを液体窒素でいっぱいのCryovialに入れ。化学フードで、溶液のサンプルあたり1ミリリットルを、体積タンニン酸で0.2%重量、そして5%DI水をクリオビアルでアセトンで調製します。液体窒素に入れて凍結します。凍結置換ミックス1バイアルと凍結細胞ペレットを含むCryovialsを凍結置換ユニットサンプルチャンバーに入れます。膜担体を含むインナーカプセルを液体窒素バイアルから、凍結置換を含む対応するバイアルに移入します。90°Cで凍結置換プロトコルを開始します。24時間後、凍結置換を一時停止し、90°Cに冷却されたアセトンでサンプルを5分間3回洗浄します。次に、化学フードで、1%オスミウム四酸化物質、0.2%酢酸ウラニル、および5%DI水の溶液のサンプルあたり1ミリリットルをクリボビアルで調製し、液体窒素に入れて凍結します。凍結置換を用いたCryovialsを2個を凍結置換ユニットに入れ、3回目のアセトン洗浄から2つのバイアルを混合して凍結置換にカプセルを移します。それらをインキュベートし、90°Cで72時間置換ミックス2を凍結し、続いて12〜18時間にわたって摂氏0度に徐々に温暖化します。温度を摂氏ゼロ度に保ち、バイアルにあらかじめ冷却したアセトンを加え、それぞれ10分間3回洗浄します。メーカーの指示に従ってプラスチックビーカーに選択した樹脂混合物を調製し、カプセルを浸すためにバイアルに2%4%と8%の樹脂を加えます。摂氏ゼロ度で2時間インキュベートします。次いで、15%30%60%90%及び100%樹脂成分のA、B、及びDの室温で4時間だけインキュベートする。20時間後、樹脂成分A、B、C、及びDを混合して調製し、4時間インキュベートする。細胞ペレット側の膜キャリアを平らな埋め込み型に入れ、樹脂混合物A、B、C、D.で満たし、オーブンに入れて24〜36時間摂氏60度で重合します。重合後、モールドからブロックを取り出し、サンプルを超ミクロトームの垂直チャックに入れ、倍率で視覚化することができます。膜キャリアをブロックから分離するには、膜キャリア上の液体窒素をバビングしてプラスチックから金属を分離し、カミソリブレードを使用して膜キャリアの周りの樹脂を切り離します。分離したら、細胞ペレットドームをブロックの面に残して、膜キャリアを静かに持ち上げます。露出したセルペレットを上方に向けて、最初の金型よりもわずかに深い平らな埋め込み金型に配置し、樹脂成分A、B、C、D.Polymerizeを60°Cで24~36時間充填します。カミソリの刃を使用して、セルペレットの周りのブロックをトリミングします。次に、サンプルチャックのブロックを超ミクロトームの切り離しアームに置きます。ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、細胞ペレットを取り囲む台形にブロックをトリミングします。ガラスまたはダイヤモンドナイフを使用して、細胞ペレットの90ナノメートル超薄い部分を得る。TEM グリッド上のセクションのリボンを選択します。フィルターペーパーの端を消してグリッドを乾燥させ、TEM グリッドの保管ボックスに保管します。TEMホルダーにグリッドを取り付け、ホルダーを顕微鏡に入れる。80キロボルトのTecnai T12を使用して、クライオAPEXサンプルをスクリーニングします。APEX2標識を用いて、対象となる細胞や細胞下構造の画像を取得します。本研究では、従来のAPEX法によるサンプルの調製により、組織化された滑らかな小胞体構造の明確な標識が得られた。高倍率では、積層膜がフリルに見え、同心円膜密度の間に不均一なギャップが存在し、膜の保存と脂質抽出が不十分であることを示した。cryoAPEXによって調製されたサンプルはまた、組織化された滑らかな小胞体構造の明確に定義された標識を有していたが、膜は滑らかで平行であり、脂質抽出はほとんど見られなかった。90ナノメートル薄い切片のTEM分析は、ハンチントン酵母相互作用タンパク質Eが核エンベロープと同様に末梢小胞体全体に存在することを明らかにした。さらに、タンパク質E密度を相互作用するハンチントン酵母は、ルミナル小胞体膜に沿って定期的に間隔をあけた病巣に分解した。タンパク質E分布と病巣を相互作用するハンチントン酵母も、従来の固定と脱水で調製されたサンプルに見えました。しかし、広範な膜破壊および抽出が存在し、サンプルを最適ではないものにした。APEX2標識は3つの細胞マーカーを用いて行い、その中でミトコンドリアの特異的染色のみを行い、CAAX-APEX2は、形質膜の特異的染色のみを行った。細胞内小器官では標識は認められなかった。ゴルジルーメンの染色は、当社のオリジナルのセングプタら原稿に記載されているように、アルファMAN2-APEX2マーカーを使用して評価された。この手順に従って、電子断層撮影や集光イオンビーム走査電子顕微鏡などの三次元法を、目的とするタンパク質の3D分布を調べるため行われてもよい。このプロトコルで使用される化学物質の多くは有毒であるため、使用前に安全データシートを参照して、化学物質が適切な個人用保護具を使用して処理され、制度上のガイドラインに従って処分されるようにする必要があります。

the-cryoapex-method-for-electron-microscopy-analysis-membrane-protein

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:Schönherr, S., et.al. は、マウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力特異的配置を調べるために、光遺伝学的免疫標識と凍結骨折レプリカ免疫標識を組み合わせました。J. Vis.

マウス脳組織の凍結破砕標本における神経膜タンパク質の免疫標識

超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。...

低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

ここでは、凍結破壊された植物組織を研究する手順を説明します。高圧凍結葉試料は凍結破砕され、二重層コーティングされているため、保存状態の良い凍結水和試料が得られ、クライオ走査型電子顕微鏡を用いて高倍率でイメージングされ、ビーム損傷が最小限に抑えられます。...

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。...

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

ここでは、我々は簡単に、低コストを提供し、時間効率のよいプロトコルは、化学的に透過型電子顕微鏡のための免疫組織化学を事前に埋め込むと互換性のある長期保存を可能に、アクロレイン固定液と霊長類の脳組織を修正します。...

プレ埋め込み免疫組織化学および電子顕微鏡のための非ヒト霊長類脳組織の調製

私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。...

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

相関光電子顕微鏡 (クレム) メソッドは、以前、光顕 (LM) で選択されているセルの電子顕微鏡検査 (EM) による画像ウイルスによる細胞内構造に適用されます。LM および EM は、ウイルス-宿主間相互作用の統合ビューを達成するためにハイブリッド...

相関光電子顕微鏡 (クレム) 追跡のウイルス蛋白質のイメージング関連するクライオ固定化細胞の構造

ここで提示されるのが、哺乳動物細胞内の膜タンパク質を標識し、液体相走査型透過電子顕微鏡用グラフェンで試料をコーティングするためのプロトコルです。放射線による損傷に対するサンプルの安定性もこのプロトコルで研究することができます。...

液相電子顕微鏡用化学固定哺乳類細胞のグラフェンエンクロージャ

このプロトコルは、クライオ構造の照明顕微鏡を用いて、生物学的に凍結保存されたサンプルを画像化する方法を示す。U2OS細胞の細胞骨格をイメージングして方法論を実証する。...

極低温保存細胞からの微視的データ収集

このプロトコルの目的は、細胞接着と成長を、クライオ電子顕微鏡用のグリッドの標的領域に向け出す方法です。これは、細胞播種前のパターン化領域に細胞外マトリックスタンパク質を堆積させた後、ユーザー指定のパターンで脱退された反ファリング層を適用することによって達成される。...

全細胞クライオ電子断層撮影ワークフロー内での細胞位置のダイレクト位置を測定するマイクロパターン化透過電子顕微鏡グリッド

このワークフローは、極低温トライコンシブイメージングプラットフォームを使用して、小さく(軸方向&lt;1μm)希少な(細胞あたり1コピー)蛍光標識された生物学的構造を標的としたラメラ生成を可能にします。このプラットフォームは、蛍光顕微鏡、集束イオンビームミリング、走査型電子顕微鏡を単一の焦点位置に統合し、ミリング中の同時蛍光顕微鏡を可能にします。...

極低温同時蛍光、電子、イオンビーム顕微鏡を用いた細胞のターゲットミリングのためのワークフロー

学ぶ、cryoAPEX法を用いた膜蛋白質の電子顕微鏡局在化解析。HEK293細胞でAPEX2タグ付きタンパク質を可視化し、ウイルス複製メカニズムや細胞構造の保存を研究する強力な手法です。

超構造保存細胞における膜蛋白質局在化の電子顕微鏡分析のためのクライオAPEX法

さらに動画を探す