Name: ラベルフリーインピーダンスベースのGPCRアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: 学ぶラベルフリーインピーダンス測定を用いたGPCRアゴニストの逐次投与プロトコル。単一ウェルで完全な用量応答解析を実現し、希少な細胞サンプルやオルガンオンチップモデルでのスループット向上に貢献します。

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私たちは、バーバラ・ゴリクニックとナジャ・ヒンターレイターが細胞培養と実験的解決策の調製に協力してくれたことに感謝します。著者らは、ドイツ研究財団(DFG)が助成金番号222125149に基づき資金提供した研究訓練グループ1910「選択的GPCRリガンドの薬用化学」による財政的支援に感謝して認めている。JASは、バイエルン男女共同参画プログラムによって授与された奨学金に特に感謝しています。

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<li>Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+analysis+of+GPCR-mediated+changes+in+endothelial+barrier+function%3A+overview+and+fundamental+considerations+for+stable+and+reproducible+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).</li>
<li>Lieb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+versus+conventional+cellular+assays%3A+Functional+investigations+on+the+human+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor.</a> Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).</li>
<li>Stolwijk, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+throughput+of+label-free+cell+assays+to+study+the+activation+of+G-protein-coupled+receptors+by+using+a+serial+agonist+exposure+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol.</a> Integrative Biology. 11, 10(2019).</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

このプロトコルは、同じ受容体に対する特定のアンタゴニストの存在または存在しない場合のアゴニスト誘発GPCR活性化の用量応答関係を決定するためのラベルフリーインピーダンス測定の方法を記載する。この方法の概念実証は、最近の出版物12で提示されました。我々の知る限りでは、インビトロの単一細胞層を用いたアゴニスト媒介GPCR活性化の完全な用量応答曲線の確立を記述する最初の研究である。このアプローチは、必然的にラベルフリーの細胞モニタリングアプローチの使用を必要とし、エンドポイントアッセイには適用されません。
このプロトコルは、細胞のインピーダンスが連続的に記録されている間に、その内因性アゴニストヒスタミンの濃度の増加で刺激されるヒトヒスタミン1受容体(hHR1)を内因的に発現するU-373 MG細胞の例で実証されている。アンタゴニスト研究に対するプロトコルの適用性を実証するために、hH1Rに対する競合的アンタゴニストであるジフェンヒドラミンの一定濃度の1つの存在下で実験を繰り返した。インピーダンス記録はまた、他のH1Rアゴニスト(例えば、UR...

このレポートは、標識のないインピーダンス測定による接着性成長細胞におけるリガンド誘導Gタンパク質共役受容体(GPCR)活性化の定量化のために開発された逐次付加プロトコルの詳細な説明を提示する。Gタンパク質共役受容体(GPRS)は、多数の生理機能およびヒト疾患1に関与している。これと細胞表面での良好なアクセス性のために、GPCRsは最も重要な薬物標的の1つです。この評価は、GPCRsを標的とする700の承認された薬物の推定数に反映され、すべての市販薬の約35%のシェアに相当する2。
新薬の開発は、(i)生物学的標的分子の同定と機能的特徴付け、および(ii)新しい鉛物質の発見および管理可能な薬物への開発という2つの中心的なプロセスからなる。どちらのプロセスにおいても、薬物標的相互作用とその後の生物学的下流応答を定量的に評価するためには効率的な方法が必要である。前臨床薬の開発プロセスの異なる段階は、薬物と標的の間の生体分子相互作用研究から、培養中の細胞の機能的研究、切除臓器物質または動物全体に関する実験に至るまで、さまざまな分析方法を利用しています。いずれも、前者から後者3まで生理学的意義と生物学的複雑さが増加する。動物実験を最小限に抑えることが全体的な目標ですが、実験動物や動物全体から隔離された器官を用いた薬理学的研究は、新薬候補を包括的に特徴付けるために避けられないと考えています。分析的読み出しの面では、臓器薬理学研究は、最も高い生理学的関連性の遠位、統合的な「全体的な」機能的応答を提供する。このような実験の欠点は、技術的および倫理的な理由に対するハイスループットスクリーニングと互換性がなく、インビトロ細胞培養4に基づく研究によって大部分が置き換えられている点である。
細胞培養におけるGPCR活性化を定量化する方法は、異なるラベルベースの化学アッセイを含み、第2のメッセンジャーを特異的に検出する、下流のシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態、ある転写因子またはリガンド誘導細胞内受容体の転写を介した転写活性化4、5を含む。このようなラベルベースのアッセイの欠点は、潜在的に有害な色素または放射性マーカーで細胞にラベルを付ける必要があります。多くの場合、事前に指定する必要がある露出時間のエンドポイント決定としてアッセイを実行する必要があります。ラベルベースのエンドポイントアッセイを使用すると、実験のこの非常に限られた偏ったタイミングと、化学標識およびプローブが通常の細胞生理学に干渉するリスクが伴います。
近年、共鳴導波格子5,6を適用するインピーダンスベースの技術や光学方法など、GPCR活性化をモニタリングするためのラベルフリーアッセイが登場している。これらのアプローチでは、細胞の標識は実験的に必要とされない。これらの物理的読み出しは、低振幅信号上で動作するように、そのような方法は非侵襲的と考えられ、それらは潜在的にリアルタイムで連続的な細胞モニタリングを可能にし、観察時間は、読み出しではなく細胞培養によって制限される。臓器全体からの読み出しと同様に、ラベルフリーのアプローチは、一般的にホリスティック細胞応答について報告し、シグナリングネットワーク全体に沿った統合が時間依存的であるが、細胞形態または質量再分布の非特異的な変化をもたらすときの受容体活性化のはるかに下流である。インピーダンスベースアッセイは、細胞形状7,8の変化の誘電体シグネチャを測定するのに対し、共鳴導波路格子を用いた測定は、動的質量再分配(DMR)9に起因するセル基板界面における屈折率の変化に敏感である。統合文字は、Gタンパク質(Gq、Gi/0、Gs、G12/13)またはβアレフィングの種類に関係なく、受容体媒介事象に非常に敏感なラベルフリーの方法を作り、受容体の内因性発現レベルに適しています。
標準的なラベルフリーインピーダンスベースのアッセイでは、細胞は、各ウェル10の底に堆積した同平面金膜電極を有するマルチウェルプレートで付着して成長する。これらの電極アレイはインピーダンスアナライザに接続され、実験刺激に対する細胞応答は時間分解されたインピーダンス測定値によって個々の井戸から記録されます。典型的なGPCRアッセイでは、リガンドは個々のウェルに個別に異なる濃度で添加される。インピーダンス時間経過におけるリガンド誘導性の変化は、次に、最大信号変化、曲線下面積、所定の時間間隔内または所定の時間点における曲線の傾き内の信号変化などの特性曲線特徴に関して分析され、リガンドの効力および有効性11を定量化する。
電極アレイのコストは、ハイスループットスクリーニング(HTS)キャンペーンにおけるこの技術の適用を制限する可能性がある。さらに、並列に追跡されるサンプルの数が増加するにつれて、個々の測定の数が増加し、それによって各ウェルの利用可能な時間分解能が徐々に減少する - でも、最先端のマルチチャンネル記録のために。このような条件下では、高速かつ一過性の細胞応答は、測定を逃れ得る。さらに、従来の1ウェル - 1つの濃度アプローチは、リガンド-GPCR相互作用分析における適合性に関して、浸透したオルガンオンチップまたはボディオンチップの開発にかなりの時間とコスト要因を課します。
このため、アゴニスト濃度が段階的に増加する一方で、単一ウェルのインピーダンスを連続的にモニタリングすることにより、培養細胞単層におけるリガンド誘導GPCR活性化の全用量応答曲線の記録を可能にする段階的投与プロトコルを開発した。この連続アゴニスト付加プロトコルは、ヒスタミン1受容体(H1R)を内因的に発現するヒトU-373MG細胞の現在の例に示すように、ウェル当たりのスループットを10以上の濃度に有意に増加させる。したがって、この方法は、時間分解能が最大で保持されている間、ラベルフリー用量応答研究におけるスループットを大幅に改善する可能性を有する。

<table><tbody><tr><td>B&uuml;rkerカウント</td><td>チャンバーMarienfeld(Lauda-K&ouml;nigshofen, Germany)</td><td>640210</td><td></td></tr><tr><td>cell culture flasks 25 cm2</td><td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Cell incubator (Heraeus Function Line BB15)</td><td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)Thermo</td><td></td><td></td> Scientific (</tr><tr><td>Heraeus 1S-R)</td><td>Thermo Scientific (Darmstadt, Germany)</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>Diphenhydramine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)</td><td>D3630</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>インピーダンス機器 (ECIS Z&theta;)</td><td>Applied BioPhysics Inc. (米国ニューヨーク州トロイ)</td><td>\</td><td></td></tr><tr><td>8-well electrode Arrays (8W1E PET)</td><td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)</td><td>\</td><td>PETベース、0.049 mm2作動電極と~50 mm2 対電極 (金)</td></tr><tr><td>96ウェル電極アレイ (96W1E+ PET)</td><td>Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, 米国)</td><td>\</td><td>PETベース、電極2個(金)、総電極面積0.256 mm2</td></tr> 子<tr><td>牛胎児血清(FCS)</td><td>Biochrom(ベルリン、ドイツ)</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>Histamine dihydrochloride</td><td>Carl Roth(カールスルーエ、ドイツ)</td><td>4017.1</td><td></td></tr><tr><td>層流フード(Herasafe、KS 12)</td><td>Thermo Scientific(ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>51022515</td><td>クラスII安全キャビネット</td></tr><tr><td>Leibovitz' L-15 medium</td><td>Thermo Scientific (ダルムシュタット、ドイツ)</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット 大 (100 - 1000 &micro;L)</td><td>ブラント(ヴェルトハイム、ドイツ)</td><td>704780</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット大(20-200&マイクロ;L)</td><td>Brandt(ヴェルトハイム、ドイツ)</td><td>704778</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡(位相差、Nikon Diaphot)</td><td>Nikon(D&uuml;</td><td></td><td></td>ペ</tr><tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>ピペット、血清学的</td><td>Greiner bio-one (フリッケンハウゼン、ドイツ)</td><td>607 180</td><td></td></tr><tr><td>ピペット (accu-jet pro)</td><td>ブラント (ヴェルトハイム、ドイツ)</td><td>26300</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma Aldrich (タウフキルヒェン、ドイツ)</td><td>T4174</td><td>in PBS with 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>Tube, 15 mL</td><td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Tube, 50 mL</td><td>Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany)</td><td>210 261</td><td></td></tr><tr><td>U-373 MG cells</td><td>ATCC (Rockville, MD, USA)</td><td>ATCC HTB-17</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス (TW21)</td><td>Julabo (Seelbach)、ドイツ)</td><td>\</td><td></td></tr></tbody></table>

ラベルフリーインピーダンスベースのgpcrアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル

Stepwise Dosing Protocol for Increased Throughput in Label-Free Impedance-Based GPCR Assays

細胞培養実験においてリガンド誘導GPCR活性化を非侵襲的に研究するために、ラベルフリーインピーダンスベースのアッセイがますます使用されています。このアプローチは、デバイス依存の時間分解能を数十ミリ秒に抑えるリアルタイムのセル監視を提供し、高度に自動化されています。しかし、サンプル数が高くなると(例えば、さまざまな異なるリガンドに対する用量応答試験)、使い捨て電極アレイのコストと、連続したウェルバイウェル記録に対する利用可能な時間分解能が制限されることがあります。従って、ここでは、ラベルフリーGPCRアッセイの出力を大幅に増加させる可能性のあるシリアルアゴニスト付加プロトコルを紹介します。連続アゴニスト添加プロトコルを使用して、GPCRアゴニストは、サンプルのインピーダンス(アゴニストモード)を連続的にモニタリングしながら、単一細胞層に濃度を増加させながら順次添加される。このシリアルアプローチにより、1つの単一細胞層からGPCRアゴニストの完全な用量応答曲線を確立することが可能になりました。連続アゴニスト付加プロトコルは、異なるGPCRカップリングタイプ、Gq Gi/0またはGsに適用可能であり、研究中の受容体の組換えおよび内因性発現レベルと互換性がある。GPCRアンタゴニストによる受容体遮断は、同様に評価可能である(アンタゴニストモード)。

各種アゴニスト溶液を調製するための典型的なスキームは、表1-4にアゴニストとしてヒスタミンを用いた8ウェル電極アレイを用いた実験のために示されている。表1および表2は、加算モード1(図1)を用いた実験の体積および濃度を示し、表3および表4は加算モード2(図1)に続く実験の体積および濃度を示す。データは、式(1)を用いて計算された。
代表的な実験は、ヒスタミン1受容体を内因的に発現するU-373 MG細胞のコンフルエント層について、ヒスタミンをアゴニストとして使用して直径250μmの働く電極を用いて8ウェル電極アレイ上で増殖した。測定は12kHzの単一周波数で行った。アゴニ...

このプロトコルは、ラベルフリーインピーダンス測定を用いて単一の微小電極上で成長した単一の細胞層からのアゴニスト誘発GPCR活性化に関するフル用量応答関係のリアルタイム記録を示す。新しいドージング方式は、時間分解能を損なうことなくスループットを大幅に向上させます。

ラベルフリーインピーダンスベースのGPCRアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル

Label-free impedance-based assays are increasingly used to non-invasively study ligand-induced GPCR activation in cell culture experiments. The approach ...

このプロトコルは、GPCRアゴニストの完全な機能的濃度応答関係を1つの細胞集団から記録し、低細胞サンプル数であっても詳細なアゴニスト特性評価を提供する。シリアル・ドージングの主な利点は、フル濃度応答解析に十分な単一のウェルであるため、スループットの増加です。この技術は、閉じたマイクロ流体容器のオルガンオンチップ形式のような、まれで複雑な生物学的モデルにおける単一の伝達を研究するのに適しています。適切な機器が利用可能な場合、プロトコルを実行することは困難ではありません。適切な濃度でさまざまなGPCRリガンド溶液を調製することが成功の鍵です。大学院生のマイケル・スキバと、私たちの研究室の学部生アン・ミルドナーが手順をデモンストレーションします。電極アレイにセルを播種する場合は、各電極アレイのウェルに適切な濃度のセルを追加し、セルを室温で10〜15分間ウェルボトムに均一に落ち着かせる。37°Cおよび5%の二酸化炭素で標準的な細胞培養インキュベーターで少なくとも36時間後、細胞層を位相対比顕微鏡で検査し、各電極を細胞で完全にカバーします。次に、各ウェルの細胞培養培地を、適切な量の事前温め、無血清培地に置き換えます。インピーダンス記録を開始するには、インピーダンスアナライザの接続アレイホルダに電極アレイを配置し、電極とインピーダンスアナライザとの間の適切な低インピーダンス接触を確認します。ソフトウェアのユーザーインターフェイスで電極タイプやマルチウェル形式を選択します。単一および複数の周波数データ取得モードが使用可能で、分析するウェルの数が少ないか、時間分解能が重要でない場合は、複数の周波数記録を選択します。最大時間の解像度を確保するには、1 つの監視頻度を選択します。次に、時間コースデータの取得を開始し、データを保存する場所のデータフォルダを選択します。インピーダンスの読み取り値は、8ウェルアレイのアゴニストモードでシリアル付加プロトコルを開始するには、細胞に関心のあるアゴニストの最も低い濃度の30マイクロリットルを追加するために、すべてのウェルの指定された周波数数で記録されます。次に、細胞が応答し、アゴニストの各連続希釈が添加されるまで、次に最高濃度の30マイクロリットルを追加する前に、事前に定義された期間の平衡をとらせます。データを分析するには、アゴニスト解の最初の加算前の最後のデータポイントのインピーダンスを減算し、インピーダンス値を正規化するために加算ゼロの時間を設定します。正規化インピーダンスの時間経過をプロットし、個々の時間コースをプロットして、各追加ステップの後にインピーダンスの最大値を特定します。これらの値を使用してデータシートを作成し、最大インピーダンス変化の値をアゴニスト濃度の関数としてプロットします。次に、データフィッティングルーチンを使用して、4パラメータロジスティックモデルを使用して半最大有効濃度と最大応答を決定します。本代表的実験では、ヒスタミン濃度を上げた10液を15分ごとに細胞に順次添加し、インピーダンスの変化を各時点で測定した。インピーダンスの変化は、ヒスタミン濃度の関数としてプロットすることができ、7つのウェルから実験データポイントに取り付けられた4パラメータロジスティックモデルの伝達関数を得ました。ヒスタミン受容体のダウンレギュレーション、細胞脱感作、または過剰刺激を考慮して、この単一の連続ドージング実験に示すように、分析のためのデータ範囲を縮小することができます。3パラメータ最適化をデータに適用して、この分析に0.75プラスマイナス0.12マイクロモルの半分の最大有効濃度を提供することができます。ヒスタミン受容体アンタゴニストジフェンヒドラミンの添加は、最初のヒスタミンの20分前に、連続的なドージングスキーム内のインピーダンスの遅延増加をもたらし、細胞応答を惹起する高アゴニストの必要性に対応する。用量応答関係において、アンタゴニストの効果は、曲線の右シフトとして表され、半最大有効濃度の増加に対応し、アンタゴニストがアゴニストに対して競合リガンドである場合である。シリアルドージングスキームの適用が成功することは技術的には簡単ですが、正確なタイミングですべてのステップを実行することは困難であるため、思慮深い計画が必要です。シリアル・ドージングは、並列で監視されるサンプルの数に関して制限されている他の読み出しシステムで濃度応答研究を行う道を開きました。連続ドージングの特に利点は、細胞力学のような他の表向きの変化に敏感である全く新しい読み出しを用いて受容体媒介シグナル伝達の研究を可能にする。吸入や飲み込むと危険な場合があるため、受容体アゴニストのストック溶液を準備する際には手袋とゴーグルを着用してください。

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