タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識
2020年5月17日
ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。
NLR免疫受容体は、様々な病原体に対する植物防御を媒介する上で重要な役割を果たす。ニコティアナベンタミアナ植物における免疫受容体などのNlRを含むToll/interleukin-1受容体ドメインの相互作用パートナーの同定のためのTurboIDベースの近接標識法について述べている。このプロトコルは、他の植物種におけるタンパク質とタンパク質相互作用を調査するための重要な参考文献を提供し、ニコティアナベンタミアナの関心のあるタンパク質に拡張することができます。
TurboIDベースの近接ラベル化アプローチは、生体内での一過性または弱いタンパク質タンパク質相互作用を捕捉するために使用できるため、従来のアプローチよりも明確な利点があります。高密度で湿った土壌でN.ベンタミアナ種子を成長させることから始めます。摂氏23~25度の18時間の光と8時間の暗い写真期間を持つ気候室でそれらを維持します。
植物は、その後のアグロインフィルトレーションのために4〜8の葉の段階に成長するまで、約4週間チャンバーに保管してください。TurboID融合を構築し、テキストプロトコルに記載されているように、プラスミドをアグロバクテリウム・トゥメファシエンスの有能な細胞に変換します。完全に成熟したN.ベンタミナ葉の腹膜表皮の接種に浸透するために1ミリリットルの針無し注射器を使用してください。
ろ過後36時間で、葉に200マイクロモルビオチンを浸潤し、葉組織を収穫する前にさらに3〜12時間植物を維持する。葉のサンプルを収集するには、ペチオールの基部で浸潤した葉を切断し、葉の静脈を取り除き、液体窒素で組織をフラッシュ凍結する。葉の組織を害虫とモルタルで粉砕し、マイナス80度のファルコンチューブで粉末を15または50ミリリットルに保存します。
全タンパク質を抽出するには、約0.35グラムの葉粉末を2ミリリットルチューブに移す。このプロセス中に液体窒素の低温で組織を維持するようにしてください。700マイクロリットルのRIPAライシスバッファーを粉末に加えます。
チューブを10分間渦出し、サンプルを氷の上に30分間放置し、チューブを反転して4〜5分ごとに内容物を混合します。チューブを摂氏4度で20,000倍に10分間遠心します。その後、上清を収集します。
脱塩カラムを通してサンプルを実行することにより、遊離ビオチンを除去します。柱の底部にあるシーラーを取り外し、50ミリリットルのチューブに入れてください。その後、キャップを緩め、1,000倍gと摂氏4度で列を遠心分離します。
脱塩カラムを新鮮な50ミリリットルチューブに入れ、5ミリリットルのRIPAライシスバッファーでカラムを3回平滑化します。1,000倍gと摂氏4度で2分間遠心し、毎回流れを捨てます。平衡カラムの樹脂の上部に1.5ミリリットルのタンパク質抽出物を加えます。
そして、抽出物が樹脂に入ると、RIPA溶菌バッファーの別の100マイクロリットルを追加します。柱を2分間遠心分離し、さらに使用するまで氷の上に脱塩サンプルを残します。脱塩タンパク質抽出物を定量化するには、バイオ・ラッド分光光度計を用いてOD595を測定します。
勾配BSA溶液の値に基づいて標準曲線を描画し、脱塩タンパク質サンプルの濃度を計算します。レンサプタビジンC1を室温で1分間1ミリリットルのRIPAライシスバッファーで結合した磁気ビーズと平衡化します。磁気ラックを使用してビーズを3分間吸収し、溶液を軽く吸引します。
その後、もう一度洗浄を繰り返します。タンパク質抽出物を平衡化された磁気ビーズに移し、一晩摂氏4度でチューブをリンベートし、タンパク質を精製します。翌日、磁気ラックでビーズを取り込み、上清を吸引します。
次に、ビーズをチューブに加えて1.7ミリリットルの洗浄バッファーで洗浄し、ローターで8分間インキュベートします。先に述べたように上澄み液を取り出し、1.7ミリリットルの洗浄バッファー2と洗浄バッファー3で洗浄を繰り返します。洗剤を取り除くために50ミリモルトリスHCLの1.7ミリリットルを加えます。
次に、チューブを磁気ラックに置き、上清を取り外します。50ミリモルトリスHCLの1ミリリットルで洗浄を繰り返し、新しい1.5ミリリットルチューブにビーズを移します。最後に、50ミリモルの重炭酸アンモニウムバッファーでビーズを6回洗浄します。
免疫ブロット分析に100マイクロリットルのビーズを使用して、ビオチン化タンパク質の濃縮を確認し、残りのサンプルをマイナス80°Cで保存するフラッシュフリーズします。ウェスタンブロットは、アグロインフィルトレートN.ベンタミアナ葉のタンパク質発現およびビオチン化を分析するために使用された。浸潤した葉のビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンC1結合型磁気ビーズで効率的に濃縮され、その後の質量分析解析を行った。
様々なサイズの異なるタンパク質が捕捉され、濃縮タンパク質のウェスタンブロット分析はスミアバンドを示した。この手順を試みるとき、脱塩カラムの底にあるシーラーを取り外し、各遠心分離の前にキャップを緩めることを忘れないでください。このプロトコルはニコチアナベンタミアナの興味のある他のタンパク質に容易に適応可能であり、また他の植物種のTurboID PLを拡張するために使用することができる。
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概要
本記事では、Nicotiana benthamianaにおけるNLR免疫受容体の相互作用パートナーを同定するための、TurboIDベースの近接標識法について解説します。このプロトコルは、さまざまな植物種におけるタンパク質間相互作用の研究に適応させることが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 植物免疫学
- タンパク質間相互作用
- バイオテクノロジー
背景
- NLR免疫受容体は、病原体に対する植物の防御において極めて重要です。
- タンパク質間相互作用を理解することは、免疫応答を解明する上で不可欠です。
- 従来の方法では、一過性または弱い相互作用を捉えられない場合があります。
- TurboIDは、in vivo研究のための新しいアプローチを提供します。
研究目的
- NLR受容体の相互作用パートナーを同定するための手法を開発すること。
- Nicotiana属およびその他の植物のタンパク質に適用可能なプロトコルを提供すること。
- 植物の免疫メカニズムへの理解を深めること。
使用方法
- TurboIDを用いた近接標識技術。
- 制御条件下でのNicotiana benthamiana植物の育成。
- in vivoにおけるタンパク質相互作用の同定。
- 様々な標的タンパク質への本手法の適応。
主な結果
- NLR受容体の相互作用パートナーの同定に成功したこと。
- 本手法が他のタンパク質にも適用可能であることを実証したこと。
- 一過性の相互作用を捕捉できたという証拠。
- 本プロトコルが今後の研究の参照基準となること。
結論
- TurboID法は、植物におけるタンパク質相互作用を研究するための有用なツールです。
- このアプローチは、植物免疫の研究を前進させることができます。
- さらなる応用により、他の種やタンパク質への展開が期待されます。
よくある質問
産業上の意義
TurboIDを用いた近接ラベル化により、植物におけるタンパク質間相互作用を室温で迅速に同定することが可能となり、毒性試薬や長時間のインキュベーション、あるいは高温条件を必要とする従来の手法における主要な制限が解消されます。このアプローチは、従来のアッセイでは見逃されがちな一過性または弱微な相互作用を捉えることで、植物免疫研究における標的の検証およびメカニズムの低リスク化を支援します。本手法は、初期の探索段階における予測の信頼性を高め、植物種を横断してNLR免疫受容体やその他の標的タンパク質を研究するための、拡張性と再利用性の高いプラットフォームを提供します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 植物体内におけるNLR免疫受容体のタンパク質相互作用ネットワークをマッピングすることで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 不安定な相互作用を保持する迅速な室温ラベル化により、生物学的なリスク低減を促進する。
- 科学的価値： 毒性のある過酸化水素を使用せず、ほぼ生理的な条件下で近接タンパク質を特定することで、ターゲットへの信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：ストレプトアビジンアフィニティー精製により、ダウンストリームの質量分析に向けた定量的で濃縮依存的なリードアウトを生成します。
- 運用の価値：ビオチン処理後12時間以内にアッセイ可能なサンプルを提供し、ハイスループットスクリーニングへの対応を可能にします。
- 運用の価値：標準化された脱塩、ビーズベースの濃縮、および厳格な洗浄ステップを通じて、再現性を確保します。
翻訳および前臨床研究
- 科学的価値： Nicotiana benthamianaにおけるNLRインタラクターを免疫応答経路に関連付けることで、疾患に関連するシステムの知見を提供します。
- 運用上の価値： 植物種間で適応可能なプロトコルにより、発見から前臨床検証までのトランスレーショナルな継続性を可能にします。
- 科学的価値： 時間的なビオチンパルスラベリングを通じて、安定的な相互作用と一過性の相互作用を区別することで、メカニズム解明におけるリスク低減を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
TurboID近接標識法は、植物ベースのバイオ医薬品研究におけるリード化合物の同定に向けた取り組みに先立ち、仮説検証およびパスウェイの解明を支援し、初期探索のプロセスに適合します。
- 探索生物学： in vivoでNLR TIRドメインに近接するタンパク質を同定することにより、生物学的仮説を検証します。
- スクリーニング： 定量的なビオチン化読み取り値を生成し、異なる条件下での相互作用強度の比較を可能にします。
- 分析： 定量的な相互作用プロファイリングに適した、質量分析互換サンプルを作成します。
- トランスレーショナルリサーチ： 分子相互作用を、疾患に関連する植物モデルにおける免疫表現型へと結びつけます。
- 汎用的再利用： Nicotianaおよびその近縁種におけるあらゆる標的タンパク質に適応可能な、プラグアンドプレイ形式のプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：共免疫沈降法では捉えきれない弱く一過性の相互作用を捕捉することで、予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：アッセイ時間を、BioIDの16～24時間から、10分間の標識と短時間のインキュベーションに短縮します。
- 戦略的価値：ターゲットの優先順位付けに不可欠な、早期かつ信頼性の高い相互作用データを提供し、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：メカニズム的に検証された相互作用ネットワークを通じて、リスクを調整した開発推進を可能にします。
実施上の検討事項
- 分子クローニング、アグロインフィルトレーション、および植物タンパク質抽出の専門知識が必要です。
- 濃縮のための遠心分離機、マグネットラック、およびストレプトアビジン結合ビーズへのアクセスが必要です。
- ラボ間でのビオチン濃度、インキュベーション時間、および洗浄プロトコルの標準化が求められます。
- 植物種や細胞内コンパートメントに応じて、ライシスおよびバッファー条件の最適化が必要です。
- 特定の植物組織における内在性ビオチンレベルによる制限があるため、バックグラウンドコントロールが必要です。
