Name: OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学ぶOaAEP1を用いたタンパク質重合体の酵素学的合成法と単分子力分光法のための固定化技術。機能残基を保持しながら制御された配列のポリタンパク質を作製する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、中国自然科学財団(グラントNo.21771103、21977047)、江蘇省自然科学財団(グラントNo.)BK20160639)と江蘇省双荘プログラム。

1. タンパク質の生産
<ol><li>
遺伝子クローン
	<ol>
<li>目的タンパク質(POI)用にコード化した遺伝子(POI):ユビキチン、ルブレドキシン(RD)51、セルロース結合モジュール(CBM)、ドッカリンXドメイン(XDoc)およびルミノコッカスフラベファシス、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ、エラスチン様ポリペプチド(Elps)からの凝集体。</li>
		<li>ポリメラーゼ連鎖反応を行い、異なるタンパク質断片から遺伝子を再結合するための3制限消化酵素システムBamHI-BglII-KpnIを用いる。</li>
		<li>直接DNAシーケンシングによりすべての遺伝子を確認する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タンパク質の発現と生産
	<ol>
<li>発現用に pQE80L-POI または pET28a-POI プラスミドを使用して大腸菌BL21(DE3) を変換します。</li>
		<li>各抗生物質(例えば、100 μg/mLアンピシリンナトリウム塩または50 μg/mL、カナマイシン)を用いて、1つの単一コロニーをLB培地の15mLに選びます。16-20時間の37 °Cで200rpmで培養を振り続けます。</li>
		<li>一晩培養液を800mLのLB培地(1:50希釈)に希釈します。rubredoxinの場合は、1,800 x gで培養を遠心分離し、M9培地の15 mL(0.4%のグルコース、0.1 mMのCaCl2、2mM MgSO4を補って)に再懸濁し、M9培地の800mLに希釈した。</li>
		<li>200rpmで振とうながら37°Cで培養液をインキュベートし、培養が0.6の600nm(OD600)で光学密度に達するまで。タンパク質発現を検査するための事前誘導制御として、培養液のサンプル100μLを保存します。</li>
		<li>IPTGを1mMの最終濃度に添加してタンパク質発現を誘導し、200rpmで4時間の培養液を37°Cで振る。タンパク質発現を検査するための誘導後制御として、培養液の100μLサンプルを予約してください。</li>
		<li>4°Cで25分間13,000 x gで培養を遠心分離し、精製前に-80°Cで保存します。 注: ここでプロトコルを一時停止できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
目的タンパク質の精製
	<ol>
<li>25 mLのリシスバッファー(50mMトリス、150 mM NaCl、pH 7.4、DNase、RNase、PMSF)で細胞を再懸濁し、ソナレータ(15%振幅)を使用して氷上で30分間ライセリングします。</li>
		<li>4°Cで40分間19,000 x gで細胞ライセートを明らかにする。</li>
		<li>Co-NTAまたはNi-NTAアフィニティカラムのパック1 mL(ベッドボリューム)を、重力流によって10列ボリューム(CV)の超純水と10 CVの洗浄バッファー(50 mMトリス、150 mM NaCl、2 mMイミダゾール、pH 7.4)で洗浄します。</li>
		<li>重力流によってカラムを通ってタンパク質上清を3回通過させます。</li>
		<li>50個のCVでカラムに洗浄バッファを注ぎ、汚染タンパク質を取り除きます。</li>
		<li>氷冷溶出バッファーの 3 CV (20 mM トリス、400 mM NaCl、250 mM イミダゾール、pH 7.4) の結合タンパク質を溶出します。ラベドキシンタンパク質に関しては、4°CでpH8.5でアニオン交換カラムを用いた更なるアニオン交換精製が必要である。</li>
		<li>SDS-PAGEでサンプルを分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. カバースリップとカンチレバー表面の機能化
<ol><li>
機能化されたカバースリップ表面の準備
	<ol>
<li>40mLの超純水に20gのクロム酸カリウムを溶かします。グラスロッドを使ってクロム酸カリウム溶液に360mLの濃硫酸をゆっくりと加え、クロミック酸を調製します。 注意:ここで使用される化学物質と最終クロム酸は、強く腐食性と酸性です。適切な保護具で作業します。この溶液は、濃硫酸を加えるときに熱を放出し、冷却のためのゆっくりとした追加と適切な休止を意味する。</li>
		<li>クロム酸処理により、ガラスカバースリップを80°Cで30分間洗浄し、活性化します。カバースリップを光から保護しながら、室温で1時間の1%(v/v)APTESトルエン溶液に完全に浸します。</li>
		<li>トルエンと絶対エチルアルコールでカバースリップを洗浄し、窒素の流れでカバースリップを乾燥させます。</li>
		<li>80°Cで15分間カバースリップをインキュベートし、室温まで冷却します。</li>
		<li>2つの固定化カバースリップとインキュベートの間に、スルホ-SMCC(1mg/mL)の200 μL(1mg/mL)をジメチルスルホキシド(DMSO)溶液に加え、光から保護された1時間のインキュベートを行います。</li>
		<li>最初にDMSOでカバースリップを洗い、次に絶対エチルアルコールで残留スルホ-SMCCを除去します。</li>
		<li>窒素の流れの下でカバースリップを乾燥させます。</li>
		<li>200 μM GL-ELP50nm-Cタンパク質溶液のピペット60 μLを機能化されたカバースリップに、約3時間インキュベートする。</li>
		<li>超純水でカバースリップを洗浄し、未反応のGL-ELP50nm-Cを除去します。 注:機能化されたカバースリップは4 °Cで貯蔵の下で約2週間可能である。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
機能化カンチレバー表面調製
	<ol>
<li>クロム酸処理により、80°Cで10分間、カンチレバーを洗浄します。</li>
		<li>1%(v/v)APTESトルエン溶液でアミノシラン化によってカンチレバーを機能化し、80°Cで15分間焼いてからスルホSMCCに結合します。</li>
		<li>C-ELP50nm-NGLを1.5時間のスルホ-SMCCのマレイミド基と表面にリンクします。</li>
		<li>超純水により、カバースリップ上の未反応C-ELP50nm-NGLを洗い流します。</li>
		<li>機能化されたカンチレバーを200μM GL-CBM-XDocタンパク質溶液200μMの200μLに浸し、20~30分間25°Cで200nM OaAEP1を含有します。次に、AFMバッファー(100 mMトリス、100 mM NaCl、pH 7.4)を使用して未反応タンパク質を洗い流します。 注: 片持ち面とカバースリップの表面化学は似ています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 制御された配列を用いて段階的にポリタンパク質を調製する
<ol><li>このライゲーションユニット Coh-tev-L-POI-NGL を OaAEP1 によってカバースリップ面に固定化された GL-ELP50nmに 30 分間リンクします。</li>
	<li>AFMバッファー(100 mMトリス、100 mM NaCl、pH 7.4)を15~20 mL使用して、未反応のタンパク質を洗い流します。</li>
	<li>TEVプロテアーゼの100 μL(0.5 mM EDTA、75 mM NaCl、25 mMトリス-HCl 10%[v/v]グリセロール、pH 8.0)を加えて、TEV認識部位でタンパク質ユニットを25°Cで1時間切断します。</li>
	<li>残りのタンパク質を洗い流すために15-20 mLのAFMバッファーを使用してください。</li>
	<li>OaAEP1によるライゲーションユニットCoh-tev-L-POI-NGLをOaAEP1によって30分間リンクします。</li>
	<li>ステップ3.3~3.5 N-1を繰り返して、ガラス表面にGL-(Ub)n-NGLを構築します。最後のTEV切断反応を省略して、タンパク質ポリマーの凝集をCoh-tev-L-(Ub)n-NGL-Glassとして予備します。</li>
</ol>4. AFM実験の測定とデータ解析
<ol><li>
AFM測定
	<ol>
<li>10 mM CaCl2および 5 mM アスコルビン酸でチャンバーに AFM バッファーの 1 mL を追加します。</li>
		<li>実験用の機能化されたAFMプローブのD先端を選択します。等分定理を使用して、各実験の前に正確なばね定数(k)値を持つAFMバッファーのカンチレバーを較正します。</li>
		<li>片持ちチップをサンプル表面に取り付けて、まとまり/ドッカーニンのペアを形成します。</li>
		<li>片持ち面を表面から400 nm·s-1の一定速度で引き込みます。その間、4000 Hzのサンプルレートで力延長曲線を記録します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
データ分析
	<ol>
<li>JPK データ処理選択の強制拡張トレースを使用します。</li>
		<li>ソフトウェアを使用してトレースを分析します。ポリマー弾性のワーム様鎖(WLC)モデルで曲線を適合させ、個々のタンパク質展開ピークに対する展開力と輪郭長増分を得ます。</li>
		<li>展開する力のヒストグラムをガウス モデルに合わせて、展開フォースの最も可能性の高い値 (<Fu>) と輪郭長インクリメント (<ΔLc>) を取得します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

我々は、ポリタンパク質の酵素性生合成および固定化のためのプロトコルを説明し、AFMベースのSMFSによるポリタンパク質設計を検証した。この方法論は、ポリタンパク質工学と固定化4、6、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61のための以前の方法を補完する、設計された配列でタンパク質ポリマーを構築するための新しいアプローチを提供します。<sup class="xr...

合成ポリマーと比較して、天然の多ドメインタンパク質は、サブドメイン1の数と種類がよく制御された均一な構造を有する。この機能は、通常、改善された生物学的機能と安定性2、3をもたらす。システイン系ジスルフィド結合結合結合や組換えDNA技術など多くのアプローチが、複数ドメイン4、5、6、7を有する重合タンパク質を構築するために開発されている。しかし、前者の方法は常にランダムで制御されていない配列を生み出し、後者の方法は、有毒で大きなタンパク質の過剰発現の困難さや、補因子やその他の繊細な酵素による複雑なタンパク質の精製など、他の問題につながります。
この課題に対応するため、プロテアーゼTEV8,9と組み合わせたプロテインリガーゼOaAEP1を用いて、ポリマー/ポリタンパク質のタンパク質モノマーを段階的に結合する酵素法を開発しています。OaAEP1 は、厳格かつ効率的な内ペプチダーゼ.2つのタンパク質は、N末限がGly-Leu残基(GL)であり、C末終点がNGL残基である他のタンパク質がNGL残基である場合、30分以内にOaAEP1によって2つのテルミニを介してAsn-Gly-Leu配列(NGL)として共有結合することができる。しかし、OaAEP1を使用してタンパク質モノマーをリンクさせると、システイン系カップリング法のような制御されていない配列を有するタンパク質ポリマーに導く。そこで、取り外し可能なTEVプロテアーゼ部位とロイシン残基をENLYFQ/G-L-POIとして持つタンパク質ユニットのN末限を設計しています。TEV切断の前に、N末端はOaAEP1ライゲーションに関与しなかった。そして、さらにOaAEP1ライゲーションと互換性があるN末経でGL残基がTEV切断後に暴露される。このように、比較的良好な配列を持つポリタンパク質の逐次酵素生合成法を達成した。
ここでは、当社の段階的酵素合成法は、配列制御および制御されていないポリタンパク質サンプル調製法、および単分子研究のためのタンパク質固定化、特に次のような複雑系に使用することができます。金属タンパク質。
さらに、AFMベースのSMFS実験により、タンパク質ポリマーの構造と安定性を単一分子レベルで確認することができます。AFM、光ツイーザー、磁気ツイーザーを含む単分子力分光法は、ナノテクノロジーにおける一般的なツールで、生体分子を機械的に操作し、その安定性を測定する11、12、13、14、15、16、17、18、19、20である。単分子AFMは、タンパク質(un)折りたたみ21、22、23、24、25、受容体リガンド相互作用26、27、28、29、30、31、32、33、34の研究で広く使用されています。 35,無機化学結合20,36,37,38,39,40,41,42,43および金属- リガンド結合 , 金属タンパク質44,45,46,47,48,49,50.ここで、単分子AFMは、対応するタンパク質展開シグナルに基づいて合成されたポリタンパク配列を検証するために使用される。

<table><tbody><tr><td>鉄(III)塩化物六水和物</td>エネルギー<td>化学</td><td></td><td>99%</td></tr><tr><td>塩化亜鉛</td>アルファ<td>Aesar</td><td></td><td>100.00%</td></tr><tr><td>塩化カルシウム水和物</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td>99.9965%結晶凝集</td></tr><tr><td>体L-アスコルビン酸</td><td>シグマライフサイエンス</td><td></td><td>バイオエクストラ、&ge;99.0%、結晶性</td></tr><tr><td>(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>&ge;99%</td></tr><tr><td>スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>90%</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>マックリン</td><td></td><td>99%</td></tr><tr><td>5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)</td><td>アルファ エーザー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遺伝子</td><td>Genscript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanowizard 4 AFM</td><td>JPK ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLCT カンチレバー</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mono Q 5/50 GL</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA FPLC システム</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>セイル ブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30 遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲルイメージシステム</td><td>タノン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

oaaep1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

化学・バイオコンジュゲーション技術は近年急速に開発され、タンパク質ポリマーの構築が可能です。しかし、制御されたタンパク質重合プロセスは常に課題です。ここでは、合理的に対照的な配列で重合タンパク質を段階的に構築するための酵素的方法論を開発しました。この方法では、タンパク質モノマーのC末端は、OaAEP1(オルデンランディア・アフィニアスパラジニアル・エンドペプチダーゼ)1)を用いたタンパク質結合のためのNGLであり、N末端は一時的なN末端保護のための鎖切りTEV(タバコエッチウイルス)切断部位に加えてL(ENLYFQ/GL)であった。その結果、OaAEP1は一度に1つのタンパク質モノマーのみを添加することができ、その後TEVプロテアーゼはQとGの間のN末経を切断してNH 2-Gly-Leuを暴露した。その後、ユニットは次のOaAEP1ライゲーションの準備ができています。この工学的ポリタンパク質は、原子間力顕微鏡ベースの単分子力分光法(AFM-SMFS)を用いて個々のタンパク質ドメインを展開することによって検査される。したがって、本研究は、ポリタンパク質工学と固定化のための有用な戦略を提供する。

OaAEP1ライゲーションによって隣接するタンパク質間に導入されたNGL残基は、展開力(<f u>)としてポリマー中のタンパク質モノマー安定性に影響を及ぼさないし、輪郭長増分(&lt;ΔLc&gt;)は前の研究と同等である(図1)。このルブレドキシンタンパク質の精製結果を図2に示す。TEV切断後のタンパク質が、制御配列を有するタンパク質ポリマーを構築する以下のOaAEP1ライゲーションと適合していることを証明するために、図3は、SDS-PAGE画像を基準として提供する。機能化された片持ちおよびカバースリップ調製のステップは、図4に記載されています。カバースリップ上のポリタンパク質の段階的な酵素生合成と固定化を図5に示す。このプロトコルを使用すると、対照配列を有するタンパク質ポリマーを構築し、AFMベ...

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

我々の酵素法は、制御された数の重合度を有するプロテインオリゴマーを使用する。これは、タンパク質ベースの材料構築と同様、単一分子力分光分析研究のための完璧なサンプル調製物です。我々の方法は、標的タンパク質にシステインを導入しない。システインはタンパク質にとって最も重要な機能残基の1つであるため、重合物質タンパク質または酵素の構築を容易にします。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるイビン・デンとシェンチャオ・シーです。まず、20グラムのクロム酸カリウムを40ミリリットルの超純水にビーカーで溶かします。ジクロメートカリウム溶液に360ミリリットルの濃硫酸をゆっくりと加え、ガラス棒を使って軽くかき混ぜます。クロム酸にガラスカバースリップを入れ、摂氏80度でオーブンに30分間移します。カバースリップを水で洗浄し、絶対エチルアルコールを洗浄し、カバースリップを窒素の流れで乾燥させます。光から保護しながら、室温で1時間、容量APTESトルエン溶液によって1%体積でカバースリップを完全に浸漬。最初にトルエンでカバースリップを洗い、次に絶対的なエチルアルコールで洗い、カバースリップを窒素の流れで乾かします。カバースリップを摂氏80度で15分間インキュベートし、室温まで冷まします。ピペットを使用して、2つの固定されたカバーリップの間のDMSO溶液中の1ミリグラム当たり1ミリグラムの200マイクロリットルをDMSO溶液に加え、光から保護された1時間インキュベートします。1時間後、最初にDMSOでカバーリップを洗い、次に絶対的なエチルアルコールで洗い、残留スルフォ-SMCCを除去します。カバースリップを窒素の流れの下で乾かします。ピペット60マイクロモルGL-ELP-50 cys-タンパク質溶液を機能化したカバースリップに入れ、摂氏25度で約3時間インキュベートします。その後、カバースリップを超純水で洗い、未反応のGL-ELP-50-cysを取り除きます。官能化されたカンチレバー表面を調製するには、まず片持ち面をクロム酸に浸し、80°Cで10分間片持ち面を洗浄します。酸を洗い流すために水と絶対エチルアルコールを使用してください。プラスチックチューブキャップに1時間アミノ酸分を行うほど、容量APTESトルエン溶液で1%体積でカンチレバーを浸します。絶対エチルアルコールでカンチレバーをすすぎ、80°Cで15分間焼きます。片持ち体をスルフォ-SMCC溶液に1時間浸し、絶対エチルアルコールでカンチレバーをすすきます。cys-ELP-50-NGLを表面にリンクするには、カチレバーをcys-ELP-50-NGLにスルフォ-SMCCのマレイミド群に1.5時間浸漬します。その後、未反応のcys-ELP-50-NGLを超純水で片持ち体に洗い流します。次に、機能性のある片持ち体を、200ナノモルOaAEP1を用いた50マイクロモルGL-CBM-XDockerinタンパク質溶液200マイクロリットルを含む溶液に浸漬し、20〜30分間摂氏25度に置きます。その後、AFMバッファーを使用して未反応のタンパク質を洗い流します。AFM実験の前に未反応の残留タンパク質を洗い流すのが重要です。対象となるグリゲーション単位の凝集-T-L-タンパク質をカバースリップ表面に固定化されたGL-ELP-50にリンクするには、15マイクロリットルのOaAEP1をカバースリップに加え、30分間インキュベートさせます。未反応のタンパク質を洗い流すために15〜20ミリリットルのAFMバッファーを使用してください。TEVプロテアーゼを100マイクロリットル加え、TEV認識部位でタンパク質ユニットを摂氏25度で1時間切断します。その後、AFMバッファーの15〜20ミリリットルを使用して、残留タンパク質を洗い流します。OaAEP1によって30分間、目的の結合単位の凝集-T-L-タンパク質をGL-ユビキチン-NGLガラスにリンクします。ガラス表面に構築されるGL-ユビキチン-NGLを構築するタンパク質に応じて、ポリタンパク質調製ステップn1回を繰り返す。最後のTEV切断反応を省略し、タンパク質ポリマー上の凝集を凝集-TEV-L-ユビキチン-n-NGLガラスとして凝集して予備する。10ミリモルの塩化カルシウムと5ミリモルアスコルビン酸を含むAFMバッファーを1ミリリットルをAFM液室に加えます。実験用に、機能化されたAFMプローブのD先端を選択します。プローブを AFM バッファに浸します。表面から毎秒400ナノメートルの一定の速度で片持ち面を引き込みます。その間に、4,000ヘルツのサンプルレートで力延長曲線を記録します。等分割定理を使用して、各実験の前に正確なばね定数K値でAFMバッファ内の片持ち体を較正する。ドッカリンで機能したカンチレバーチップを、凝集して機能するタンパク質に取り付け、凝集ドキンペアを形成します。次に、JPKデータ処理ソフトを開き、特徴的なのこぎりのようなパターンと高い剥離力を持つ力延長曲線を選択します。本研究では、OaAEP1ライゲーションにより隣接タンパク質間に導入されたNGL残基は、展開力およびコントラ長インクリメントとして発現されるポリマーにおけるタンパク質単量体安定性に影響を及ぼさなかったが、以前の研究と同等であった。フェルベドキシンのフェリック形態の精製は、495ナノメートルおよび575ナノメートルの典型的なUV視覚化吸収ピークを提示したが、亜鉛形態は、ステップワイズ消化およびライゲーションのSDSページゲル結果は、TEV切断、純粋なGFP-TEV-プロテアーゼ、および精製された製品-UBQuitiのタンパク質混合物である凝集性TEV-L-ユビキチンを示した。切断されたGL-ユビキチンおよび凝集-TEV-L-ユビキチンライゲーション混合物を、OaAEP1および純粋OaAEP1の有無にかかわらず同様に示す。ペプチドの取り付けに成功するためには、活性スルフォ-SMCCで表面を機能化することが重要です。ここでは、重合タンパク質を構築する新しい方法を提供します。これは、研究者が単一分子力分光法を使用して複雑なタンパク質システムを研究することを容易にします。クロム酸は強く腐食性および酸性である。準備して取り扱うときは注意してください。

oaaep1-mediated-enzymatic-synthesis-immobilization-polymerized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。...

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

セルロソームは、セルロースを消化するために設計された多酵素複合体です。AFMベースのSMFSを使用して、セルローム関連タンパク質集合体の機械的特性とフォールディング配置を研究しました。セルロソームの組み立てに関与する個々の受容体-リガンド複合体の相互作用を研究するための、タンパク質の固定化、データ取得、およびデータ解析のための完全なワークフローを紹介します。...

AFMベース1分子力分光法によるセルロソームの受容体リガンド系の探索

ここでは、二枚の光学トラップされたマイクロスフェアの間に懸架単一のDNA分子と相互作用する単一の蛍光標識タンパク質分子を検出するための機器および方法が記載されている。...

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

電子舌(eT)の構築に関する新しいアプローチが説明されており、これによりセンシング材料の設計と製造が大幅に簡素化され、eTが液体中のサンプルの連続的な進化プロファイルとランドスケープを生成することができます。得られたeTは、識別などの一般的なタンパク質分析に効率的です。...

タンパク質分析のための継続的な認識パターンを生成する電子舌

多種多様な単一分子をAFMチップに共有結合するプロトコールが提示されます。これらの分子が固体支持体および生体界面に付着力および自由エネルギーを決定するための手順および例が提供される。...

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

このプロトコルを記述する、heterobifunctional シラン カップリング剤による酸化シリコン薄膜表面の原子間力顕微鏡による単一分子力分光法のために設計するで例示されている蛋白質の共有結合固定化、RrgA の相互作用 (毛 1 先端付着性S.

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

ここでは、単純な開始材料から L-ジヒドロキシフェニルアラニン生合成の遺伝的定款及びタンパク質接合への応用のためのプロトコルを提案する.

遺伝的定款生合成 L-ジヒドロキシフェニルアラニン (DOPA) とタンパク質接合への応用

原子間力顕微鏡(AFM)片持ち体先端へのプローブ分子の共有結合は、その物理的性質を調査する上で不可欠な技術である。これにより、AFMベースの単一分子力分光法を介して、高い再現性を持つ伸縮力、脱着力、ポリマーの長さを決定することができます。...

AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合

時間分解された単一分子タンパク質誘導蛍光増強は、タンパク質の局所的な構造変化に敏感な蛍光分光性近接センサとして有用である。ここでは、より長い範囲のFRET定規を使用して測定した場合、球状に非構造化および不安定として知られているα-Synucleinの安定した局所的な立体構造を発見するために使用できることを示す。...

時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

学ぶOaAEP1を用いたタンパク質重合体の酵素学的合成法と単分子力分光法のための固定化技術。機能残基を保持しながら制御された配列のポリタンパク質を作製する手法です。

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

さらに動画を探す