Name: ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ ヒト心臓スライスの二重電圧・カルシウム光学マッピング法。バイブロトーム切片、蛍光色素を用いた同時記録で前臨床薬物スクリーニングを実現し、心臓生理学研究に貢献します。

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NIH(助成金R21 EB023106、R44 HL139248、R01 HL126802)、Leducq財団(プロジェクトRHYTHM)、米国心臓協会博士研究員(19POST34370122)による資金提供は感謝しています。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、心突っ込んで逮捕されたヒト心臓から実行可能な心臓スライスを得るためのステップバイステップの方法を提示し、膜貫通電位と細胞内カルシウムの二重光学マッピングを用いてスライスを機能的に特徴付ける。保存された細胞外環境とネイティブの細胞と細胞の結合により、ヒト心臓スライスは、基本的な科学的発見と薬理学的薬剤および遺伝子治療の有効性および心臓毒性試験のために、ヒト心臓の正確なモデルとして使用することができる。この技術はまた、心房節、房室節、プルキンエ繊維などの心臓の特定の領域の構造的機能的マッピングを可能にする。ここで説明するプロトコルは、短期研究に最適な心臓スライス生成、画像処理、および分析の基本的な手順をリストしています。組織スライスの静的培養は、長期間にわたって心臓組織の変化を誘発することが示されているので、長期的な研究のために、我々は、電気機械刺激12、13、14,13,14のようなより多くの生理学的培養条件を組み込むことを読者に奨励する。</...

動物モデルは、ヒト生理学および病態生理学の基礎的なメカニズムを理解するために使用される貴重なツールであり、また様々な疾患を治療するための治療法の予備試験のためのプラットフォームである1。これらの動物研究2に基づく生物医学研究の分野で大きな進歩がとられています。しかし、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、およびイヌ,3、4を含む、ヒトと動物の生理学の3間に有意な種間の違いが存在する。その結果、動物実験の段階で約束を示したが、臨床試験5で結果に応えられなかった多くの薬物、遺伝子、および細胞療法があった。このギャップを埋めるために、孤立した心筋細胞およびヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、様々な薬物および疾患に対するヒト生理学の応答を試験するモデルとして開発された6。幹細胞由来心筋細胞は、心臓,6,7,87の代理として臓器オンチップ系で広く使用されている。68しかし、iPSC由来の心筋細胞(iPSC-CM)の有用性は、比較的未熟な表現型と心筋細胞亜集団の表現の欠如によって妨げられる。成熟した心筋は、線維芽細胞、ニューロン、マクロファージ、内皮細胞などのいくつかの共存する細胞タイプから構成される複雑な構造である。一方、孤立したヒト心筋細胞は電気的に成熟しており、培養パラメータ9を改変することにより異なる心筋細胞亜集団を得ることができる。それでも、これらの筋細胞は一般的に、細胞間結合の欠如、急速な分化、およびvitro10,11,11における不整脈行動の発生による変化作用電位形態を示す。いくつかの制限は、iPSC-CMおよび心臓筋細胞の3D細胞培養モデルによって対処された。これらのモデルは、スフェロイド、3D培養物をカプセル化したヒドロゲル足場、設計された心臓組織(EHT)、および心臓オンチップシステムを含み、心筋細胞、線維芽細胞、および内皮細胞などの複数の心臓細胞集団を使用する。彼らは自己集合するか、足場に沿って組み立てて3D構造を形成し、心筋の複雑な異方性の性質を再現するものもあります。これらのモデルは、成熟した型の細胞、収縮特性、および心臓組織に類似した分子プロファイルを有することが報告されている。心臓オンチップシステムはまた、薬物検査および疾患モデルにおける全身効果の研究を可能にする。しかし、インビトロ細胞ベースモデルは、天然の細胞外マトリックスを欠いているため、臓器レベルの電気生理学を正確に模倣することはできません。対照的に、ヒト心臓スライスは、無傷の細胞外マトリックスおよびネイティブ細胞間接触を有し、ヒト心筋の不整脈特性をより正確に調べるのに有用である。
研究者は、急性および慢性薬物検査のための生理学的前臨床プラットフォームとしてヒト心臓組織学的スライスを開発し、心臓電気生理学および心臓病進行を研究するために12、13、14、15、16、17、18、19。12,13,14,15,16,17,18,19iPSC由来の心筋細胞と比較すると、ヒト心臓スライスは成熟した心筋細胞表現型を有する成人ヒト心臓電気生理学をより忠実に複製する。単離されたヒト心筋細胞と比較すると、心臓スライスは、良好に保存された細胞と細胞の結合と、その本来の細胞内および細胞外環境の本質的な存在のために、生理作用の可能性のある持続時間を示す。
このプロトコルは、ドナー心臓全体からヒト心臓スライスを生成するプロセスを記述し、急性(すなわち、時間の長さ)および慢性(すなわち、日-長い)研究を行い、光学マッピングを介して心臓電気生理学パラメータをテストする。このプロトコルは左心室(LV)組織の使用のみを説明するが、それは正常にマウス、ラット、モルモット、および豚14、20、21、22,20,21などの他の種だけでなく、心臓の他の領域に適用されています。,22私たちの研究室では、過去5年間移植を拒否されたヒトドナー心臓全体を使用していますが、組織がキューブに切り離される能力を持っている限り、代替手段(例えば、左心室補助装置[LVAD]移植、生検、子宮摘出)によって得られたドナー心臓サンプル組織に対してこれらの同じ手順を行うことは可能です。光学マッピングは、高空間(100 x 100ピクセル)と時間(>1,000フレーム/s)解像度で光学的作用電位とカルシウム過渡を同時にマッピングする能力があるため、この研究では分析に使用されています。多電極アレイ(MEA)や微小電極などの代替方法も使用できますが、これらの手法は比較的低い空間解像度によって制限されます。さらに、MEAは細胞培養用に設計されており、鋭利な微小電極は、心臓全体または大きな組織ウェッジで使用するためにより簡単に管理できます。
この記事の目的は、より多くの研究者が心臓電気生理学研究のためにヒト心臓組織を使用できるようにすることです。この記事に記載されている技術は、比較的単純で、短期間の研究(数時間から数日の順序で)に有益であることを留意すべきです。より多くの生理学的な生物模倣文化は、より長期にわたる研究(週の順)に関して議論され、他の多くの研究によって説明されてきた1212、18、23。,18,23電気刺激,、機械的負荷、および組織ストレッチは、12、18、23,18のインビトロ組織再モデリングの発症を制限するのに役立つ有利な調整機構である。23

<table><tbody><tr><td>1mL BD シリンジ</td><td>トーマス サイエンティフィ</td>ック <td>309597</td><td></td></tr><tr><td>2,3-ブタンジオン モノキシム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル培養プレート</td><td>コーニング</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>1377</td><td></td></tr><tr><td>ブレビスタチン</td><td>ケイマン</td><td>13186</td><td></td></tr><tr><td>バブルトラップ</td><td>ラドノティ</td><td></td><td></td>130149</tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>コーニング セル ストレーナー</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>ジ-4-ANEPPS</td><td>バイオチウム</td><td></td><td>ストック溶液 1.25 mg/mL DMSO</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #3c 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>発光ダイクロイックミラー</td><td>Chroma</td><td>T630LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルター (RH237)</td><td>Chroma</td><td>ET690/50m</td><td></td></tr><tr><td>発光フィルター (Rhod2AM)</td><td>Chroma</td><td>ET590/33m</td><td></td></tr><tr><td>励起ダイクロイックミラー</td><td>Chroma</td><td>T550LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>励起フィルター</td><td></td><td>Chroma ET500/40x</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL 円錐形遠心分離管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>熱交換器</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td>シ<td>グマAldrichH3375</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50145502</td><td></td></tr><tr><td>インスリントランスフェリンセレン(ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>LED励起光源</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-Mic-LED-520</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>Micam Ultima L型CMOSカメラ</td><td>Scimedia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-07522-20</td><td></td></tr><tr><td>プラチナペーシングワイヤー</td><td>Alfa Aesar</td><td>43275</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P6867</td><td>非イオン性、界面活性剤ポリオール</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab データデータ収集および刺激装置</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 4/26</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2AM ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nadium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nadium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>滅菌器、ドライビーズ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z378550</td><td></td></tr><tr><td>Stone 酸素ディフューザー</td><td>ウォーターウッド</td><td>B00O0NUVM0</td><td></td></tr><tr><td>TissueSeal - Histoacryl 局所皮膚 接着剤</td><td>gobiomed</td><td>AESCULAP</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低融点 アガロー</td>ス <td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>超音波 超音波装置</td><td></td><td>ブランソン 1800</td><td></td></tr><tr><td>ビブラートーム</td><td>カムデンインスツルメンツ</td><td>7000 smz</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトの神経ノチカルスライスの二重電圧およびカルシウム光学マッピングによる前臨床心臓電気生理学的評価

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

ヒト心臓スライス製剤は、動物と臨床試験の間のギャップを埋めるために、ヒト生理学研究と治療試験のプラットフォームとして最近開発されました。薬物の効果を調べるために多くの動物および細胞モデルが使用されてきたが、これらの反応はヒトにおいてしばしば異なる。ヒトの心臓スライスは、実行可能な人間の心臓から直接派生するという点で、薬物検査の利点を提供します。保存された多細胞構造、細胞と細胞の結合、および細胞外マトリックス環境に加えて、ヒト心臓組織スライスは、成人ヒト心臓生理学に対する無数の薬物の効果を直接テストするために使用することができる。このモデルを心臓全体やくさびなどの他の心臓製剤と区別しているのは、スライスが長期的な培養を受けることができてしまうということです。したがって、心臓スライスは、薬物の急性および慢性の影響を研究することを可能にする。さらに、単一の心臓から数百から千のスライスを収集する能力は、同時に様々な濃度と他の薬物との組み合わせでいくつかの薬物をテストするハイスループットモデルになります。スライスは、心臓の任意の領域から調製することができます。このプロトコルでは、左心室自由壁から組織キューブを単離し、高精度振動ミクロトームを用いてスライスに切り離すことによって、左心室スライスの調製について説明する。これらのスライスは、その後、急性実験を行ってベースライン心臓電気生理学的機能を測定するか、慢性薬物研究のために培養することができる。このプロトコルはまた、膜貫通電位と細胞内カルシウムダイナミクスの同時記録のための心臓スライスの二重光学マッピングを記述し、調査中の薬物の効果を決定する。

ヒトのorganotypicスライスは、上記のプロトコルに従ってドナー人間の心臓の左心室から収集され、で示された図 1.デュアルカメラ光学マッピングシステム図 2スライスプロトコルの完成後約1時間で電圧とカルシウムの同時光学マッピングを行うために直立画像構成で使用された。データはリズム1.2を用いて分析された(図 3)、私たちの研究室が以前に公開し、Github(https://github.com/optocardiography/Rhythm-1.2)で自由に利用できるオープンソースの光学マッピングデータ分析ツール。測定された電気生理学的パラメータは、図 4.作用電位およびカルシウム過渡痕はシグナルコンディショナリングされ、さらなる分析で使用される代表的な痕跡は、図 4A.活性化時間は各ピクセルについて決定され、電圧およびカルシウムトレー...

本プロトコルは、前臨床薬物検査のためのヒト心臓スライスの切り離しおよび培養の手順を説明し、これらのスライスから膜貫通電圧および細胞内カルシウム信号を同時に記録するための光学マッピングの使用について詳述する。

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

このプロトコルは、前臨床生理学的薬物検査のためにドナー人間の心臓を採用するスキルを研究者に提供するため、重要です。この組織は、ヒト組織スライスにおける心行動電位と細胞内カルシウム過渡性の同時特性評価に電圧とカルシウム染料の両方を利用する。光学マッピングシステムを設定するには、下部ポリジメチルシロキサンゲル層を有する組織浴を灌流システムに取り付け、温度を維持し、浴透過物の蓄積を防ぐのに十分な速さで流量で灌流システムを通して100%酸素で酸素化した摂氏37度で1リットルの回収溶液を循環させる。次に、ターゲットを使用して2台のCMOSカメラの焦点と位置合わせを調整し、520プラスマイナス5ナノメートルの波長の緑色のLED光源を使用して、電圧感受性とカルシウムインジケータの色素を同時に励起します。組織切片を得る前に、凍結した液状心筋痛液を混合し、心臓組織を氷冷心筋プレギア浴に入れ、左心室自由壁を特定する。ビブラートメの金属組織ホルダーの背面に、あらかじめ作られたアガロースゲルを接着します。冷たい心肢麻痺溶液で組織の1センチメートルの立方体ブロックを切断し、局所皮膚接着剤を使用して、心内膜表面を上に向けて金属組織ホルダーに組織ブロックを素早く取り付けます。金属ホルダーを氷冷酸素スライス溶液のビブラードーム浴に移し、組織が完全に水没するようにし、ブレードを組織の前端に移動させます。ビブラートオムをオンにしてプリセットパラメータでスライスを開始し、ブレードがトラベキュラを越えて滑らかな心内膜組織に到達するまで最初のいくつかのスライスを破棄します。実験組織に到達したら、室温酸素化タイローデの回収液を含む培養皿の個々の100マイクロメートルナイロンメッシュ細胞ストレーナーに各スライスを慎重に移し、メッシュワッシャーでスライスを覆い、組織スライスをカールしないようにします。すべてのスライスが収集されたら、各スライスを慎重に1ウェルあたり3ミリリットルのPBSを含む6ウェルプレートの個々の井戸に移します。スライスを穏やかな揺れですすい、新鮮な滅菌PBSでこのプロセスを3回繰り返してから、サンプルを37°Cの培養培地を含む6ウェルプレートの個々の井戸に移します。その後、37度、30%酸素、および5%の二酸化炭素で加湿インキュベーターで毎分20回転で軌道シェーカーにプレートを置きます。切り取りたてのスライスまたは培養直後の回収液中のインキュベーションの20分後、目的のスライスを灌流系組織浴に慎重に移し、組織に最小限のストレッチを適用しながら4つの角をゲル層に固定します。0.3~0.5マイクロリットルのストックブレビスタチンを回収液の貯留槽に加える前に、約10分間、循環回収液でスライスをこの浴中で休ませます。スライスがブレビスタチンでインキュベートされている間、37度の回収溶液の1ミリ

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