アグロバクテリウム-形態新生遺伝子を用いた再カルシトランストウモロコシ近交線の媒介性不成熟胚変態

ほとんどのトウモロコシ近親交配ラインは、従来の変換プロトコルを使用して遺伝的に変換することはできません。ここでは、迅速で遺伝子型依存性の低い QuickCorn 変換方法について説明します。クイックコーン法は、メイズ転写因子ベビーブームおよびWUSCHELを利用する。

形質転換ベクター系に組み込まれると、これらの遺伝子は、胚発生の成長を刺激するために相乗的に働く。従来のトウモロコシ変換プロトコルとは異なり、QuickCorn法では変換時にカルス誘導ステップを伴いません。我々の研究で用いられるバイナリベクターのT-DNA領域には、モルフォジェネ生成遺伝子、マーカー遺伝子、cre/loxP組換えシステムの3つの重要な構成要素が含まれています。

熱誘発cre/loxPの組換えシステムは、植物の発達における正常なカルス再生を可能にするために、トウモロコシゲノムから形態素遺伝子を除去するためにT-DNAに含まれていた。シルクが出現し、翌日花粉が利用可能になった場合は、シルクが出現する殻の葉の端から約2 1/2センチメートル下の70%エタノール滅菌ハサミでシルクと殻をカットし、シルクをシュートバッグで覆います。タンセルからアンサーが現れたら、タッセルをタッセルバッグで覆い、茎の周りのバッグのベースにスキッドペーパークリップを置きます。

タッセルバッグを置いた翌朝、植物をそっと曲げ、袋をタップして花粉の放出を促します。その後、タッセルバッグを取り出し、花粉が逃げるのを防ぐためにバッグの上部を折ります。レシピエント植物を受粉するには、絹を露出させ、すぐに絹の上にタッセルバッグから花粉を注ぎます。

すぐに受粉した耳をタッセルバッグで覆い、ステープルで茎の周りのバッグのベースを固定します。受粉後9~12日後の未熟な胚の大きさを確認するには、殻をそっと引き下げて、耳の周りの約1/3〜1/4、耳の下の距離の約1/3でカーネルを露出させる。メスを使用して、サイズと色の他のカーネルの大部分に似ているように見える単一のカーネルのキャップをスライスし、胚を抽出するために定規とヘラを使用します。

次に、定規またはキャリパーを使用して胚の長さを測定します。収穫から1~4日以内に、収穫した耳から殻と絹を取り出し、各耳の上部またはベースに適切なハンドルを挿入します。ハンドルを上に向けた無菌層流れフードに消毒漂白剤溶液の大きな容器に耳を浸します。

20分後、新鮮な滅菌蒸留水を1回5分間たっぷり使って耳を3回洗い流し、耳を数分間乾燥させます。次に、耳当たり2ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブを700A液体培地で満たし、滅菌メスを使用して各カーネルクラウンの上部1〜2ミリメートルを取り除き、耳の胚乳を露出させます。耳の先端に面した側のカーネル内の未熟な胚を、コブの取り付けの近くに見つけます。

トップハンドラーと右利きのオペレータの場合は、大きな無菌ペトリ皿の上に耳を置き、胚から最も遠いペリカルプの胚精子にマイクロヘラを挿入します。優しく上向きにひねりを加えて、胚を外し、胚を露出させ、ヘラを使用して胚を700A液体培地の1つのチューブに慎重に入れる。左手で耳を保持するベースハンドラオペレータの場合は、胚から最も遠い腹蓋部の胚精子にマイクロヘラを挿入し、優しく上向きにねじって子宮を取り除きます。

アグロバクテリウム懸濁液培養で胚を培養するために、作製した作業板から700A液体培地の10ミリリットルに細菌を採取し、ボルテックスを完全に懸濁して細菌培養を中断する。波長550ナノメートルで光学密度を測定し、新鮮な700A培地の1ミリリットルで胚を洗浄します。胚を1ミリリットルのアグロバクテリウム懸濁液に浸し、渦を低い設定で30秒間浸します。

562V共同培養培地の個々のプレートに各チューブの内容物全体を移す前に、チューブを水平に5分間水平にしてベンチに胚を落ち着かせる。プレートをそっと旋回して胚を均等に分配し、過剰なアグロバクテリウム懸濁液を吸引する。ドーム型の側面を上に向けて慎重に胚を向け、胚を損傷しないように注意してください。

その後、暗闇の中で摂氏21度で一晩インキュベーションのためにプラスチックボックスにプレートを置きます。翌朝、感染した胚を安静培地605Tに慎重に移し、1皿あたり約30個の胚を置き、スクテルン側を上に置き、暗闇の中で摂氏26度で4〜10日間のインキュベーションを行う。約7日間で、体細胞胚の発生は、ザイゴティックスクテルの表面で観察することができる。

休息期間の終わりに、胚の箱を45度の摂氏インキュベーターに入れ、相対湿度70%で2時間、暗闇の中で摂氏26度で1〜2時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、10〜15の熱ショックを受けた未熟な胚を、選択的薬剤として除草剤イマザピルの1リットル当たり05ミリグラムを添加したシュート形成培地の個々のプレートに置く。必要に応じて慎重にコレプタイルを取り除き、胚を26°Cの暗いインキュベーターに2週間戻します。

インキュベーションの終わりに、1プレートあたり約8個の組織を発根媒体プレートに移し、16時間の光と摂氏27度で8時間の暗さを持つ1〜2週間のインキュベーションを行います。プランツが発達するにつれて、シュートと活発な根の両方を含む1つのより強いプランレットを、さらに7〜14日間光の下で発根媒体の個々のプレートに置きます。完全に開発されていない芽は、土壌に移動する準備ができるまで、別の1〜2週間、同じ媒体上でインキュベートされるようにします。

植物がより活発になるにつれて、寒天を取り除くために水道水で根をすすいでください。その後、個々の植物を排水孔付きトレイ内の事前湿潤した土壌のない基質を含む3インチのポットに移植し、プラスチック製の湿度ドームの有無にかかわらず成長室にトレイを置きます。ポット移入後9~14日後、各植letを土壌を1.5ガロンのポットに移植する。

ポットに制御放出肥料を追加し、温室で植物を維持します。工場から耳の芽が出始めると、半透明のシュートバッグを使用して、バッグを取り外さずに新興シルクを観察できるようにします。次に、実証された開発の適切な段階で植物を受粉する。

トウモロコシの耳は、一般的に受粉後9〜12日収穫される。1.5~2ミリメートルの長さの未熟な胚は、このプロトコルの変換に最適な外植体です。感染から8日後、ZsGreen発現体細胞胚は蛍光顕微鏡で可視化することができる。

感染の8日後に熱処理がクレコンビナーゼ発現を誘導し、その結果、2つのloxP部位の間に横たわる形態原性遺伝子、cre、およびZsGreen発現カセットの切除が生じる。除草剤を含むシュート形成培地上の培養の3〜4週間後、成熟胚を有する組織を増殖させたり、除草剤に耐性のある芽を撃つ場合が観察できる。除草剤耐性組織の一部はZsGreenに対して陰性であり、これらの組織で火葬切除が起こる可能性が高いことを示唆している。

組織を発根培地と軽いインキュベーションに移動させた後、よく発達した根を持つ健康で活発な成長する芽を収穫することができます。いくつかの組織は、おそらく同一の遺伝子導入パターンを有するクローン植物のために複数の芽を有するように見えることがあることに注意してください。QuickCorn法は、トウモロコシ変換効率を大幅に向上させ、変換可能な遺伝子型のリストを拡張することができます。

このプロトコルは、最小のトウモロコシ変換トレーニングを受けた研究者が正常に再現することができます。QuickCorn法を使用して、根ざした植物は、感染の日のわずか5〜7週間で土壌に移す準備ができているはずです。培地組成、サブ培養のタイミング、温度と照明条件に注意してください。

出発材料の品質もまた、成功した変換のために不可欠です。このプロトコルで使用される化学物質、漂白剤溶液、除草剤は、生物危険です。ご使用時には、適切な個人用保護具を着用してください。