Name: 細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶ 細胞を含まないS30-T7リゾートを用いた合成細胞の調製法。リポソームとエマルジョン移動でバクテリア抽出物を封入し、治療用タンパク質の現場生産プラットフォームを構築する。

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この作業は、ERC-STG-2015-680242によってサポートされました。
著者らはまた、テクニオン統合癌センター(TICC)の支援を認める。ラッセル・ベリーナノテクノロジー研究所;ローリーI.ローキー生命科学・工学センター;カミングラントのためのイスラエル経済省(52752);イスラエル科学技術宇宙省 - 主任科学者のオフィス (3-11878);イスラエル科学財団(1778/13,1421/17);イスラエル癌協会(2015-0116);GIFヤング助成金のための科学研究開発のためのドイツ・イスラエル財団(I-2328-1139.10/2012);キャリアインテグレーション補助金のための欧州連合FP-7 IRGプログラム(908049)。リン脂質研究センター助成金;ローゼンブラットがん研究財団、マラットファミリー財団助成金;アンガーファミリー財団。A.シュレーダーはアロンとタウブフェローシップを認めています。O. アディールはシャーマンとグットヴィルトのフェローシップを認める。G.チェンはシャーマン・フェローシップを認める。N.クリンスキーは、ロスチャイルド・カイザリア財団のアリアン・ド・ロスチャイルド女性博士課程を認めています。

注: 完全な合成セルの生産プロトコルの図を図 1に示します。ユーザーのニーズに応じて、プロトコルのタンパク質発現(セクション3.2)および合成細胞形成(セクション4)部分も独立して(いくつかの適応を伴って)行うことができる。
1. S30-T7のリセートの調製
<ol><li>50 μg/mL アンピシリンを補ったLB-寒天プレート上にpAR1219プラスミドを発現するT7 RNAポリメラーゼで形質転換した大腸菌BL21(DE3)細菌をストリークプレートし、単一コロニーを得る。</li>
	<li>スターター溶液を準備する:1コロニーを100mLのエルレンマイヤーフラスコで50μg/mLアンピシリンを補充したLB培地5mLに接種し、250rpmと37°Cの床インキュベーターシェーカーを使用して一晩成長します。重複を準備します。</li>
	<li>各5 mLスターターを、バッフル付き2 L エルレンマイヤーフラスコに50 μg/mLアンピシリンを補った500mLの結核培地に分けて接種し、250 rpmおよび37°Cのフロアインキュベーターシェーカーを使用して0.8-1のOD600に達するまで成長させます。分光光度計を使用して定期的にモニターします。</li>
	<li>T7 RNAポリメラーゼ発現の誘導のためにIPTGの100 mMストック(0.4〜0.6mMに達する)の2〜3 mLを加え、OD600≈4に達するまで培養を続けます。</li>
	<li>各エルレンマイヤーフラスコから2つの250 mL滅菌された遠心分離管に溶液を移します。</li>
	<li>遠心分離機は、4°Cで10g分間、それぞれ7,000xgで。上清を捨てます。 注:この段階では、細菌ペレットは、次のステップに進む前に数日間-20°Cで保存することができます。</li>
	<li>各ペレットを250 mLの冷水(4°C)S30 lysateバッファーと遠心分離機で7,000 x gで4°Cで10分間再懸濁します。 注:S30リセートバッファーは、ステップ1.9でホモジナイザーを使用して細胞リシスが行われた後のタンパク質安定性を維持するために使用されます。このステップから、1.12までのすべてのステップは、連続して迅速に実行する必要があります。 注:次のステップに進む前に、リセートを保存するために必要なヒントと1.5ミリリットルバイアルを事前に冷却してください</li>
	<li>上清を捨て、冷たいS30のライセートバッファーの15 mLで全てのペレットを再中断します。ガーゼパッドを使用して懸濁液をフィルターします。 注:15mlの溶液は、ホモジナイザーの体積によるものです。細菌濃度も重要であるに注意する必要があります。</li>
	<li>細胞破損のための4棒(2つのパス)の空気圧で、15,000 psiの働く圧力で均質化する。より濃縮された活性な溶解物の溶液希釈を避けてください。</li>
	<li>均質化された懸濁液の10 mLあたり0.1 M DTT(注意)の100 μLを加えます。</li>
	<li>4°Cで30分間24,700xgで懸濁液を遠心分離する。 g</li>
	<li>ライセート活性を維持するために、次のステップを迅速に実行します:上清を1つずつ200 μLのアリコートに分け、あらかじめ冷却した1.5mLバイアルですぐに液体窒素で凍結します。さらに使用するために-80 °Cで保管してください。 注意: DTT は刺激性および有害性に分類されるため、注意して扱う必要があります。</li>
</ol>2. 油脂溶液中の脂質の調製
<ol><li>POPCとコレステロールをクロロホルム(注意)に分解し、それぞれ100mg/mLの最終濃度にします。各バイアルを別々に渦。<ol>
<li>2mLガラスバイアルに構成部品を組み合わせる:クロロホルムに50μLのPOPC、クロロホルムに50μLのコレステロール、500μLのミネラルオイルを加えます。合成細胞の100μLの場合、油中の脂質のバイアル2バイアルが必要です。</li>
		<li>ボルテックスを、クロロホルムを蒸発させるために化学フードで80°Cで約1時間加熱した。指定した時間/条件に従い、ソリューションのボリュームを監視することによって、完全な蒸発が発生したことを確認します。 注:得られた脂質油中溶液は、室温で最大2週間保存することができます。結果を改善するために、各実験の前に新しい準備を使用することをお勧めします。脂質およびコレステロール比は、所望の膜組成に応じて変化させることができる。コレステロールの高濃度は、最終的な合成細胞溶液中の凝集体の形成につながることができます。 注意:クロロホルムは刺激性および有害に分類され、したがって注意して、煙抽出のある領域で扱われるべきである。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 外、内および供給の解決の準備
<ol><li>ストックソリューションの準備<ol>
<li>表 2に記載されているストック ソリューションを、超純水 (UPW) を使用して準備します。 注:ストックソリューションは事前に準備し、さらに使用されるまで-20°Cで保管する必要があります。試薬7は凝集体を形成する傾向がある。37°Cに加熱すると凝集が減少します。わずかな凝集は、反応に大きな影響を与えない。試薬8溶液は、乳白色および濁りである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>外側のソリューション<ol>
<li>DNase/RNaseフリーH2Oのグルコースを200mMの最終濃度に溶解します。</li>
		<li>100 μLの内部溶液に対して、1.6 mLの外液を調製します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレインナーソリューション<ol>
<li>表2に記載した量と濃度に従って試薬1〜14を加える。例えば、最終合成細胞容積が100 μLの場合、100 μLの内部溶液を調製します。 注: 最終的に必要なボリュームを完成させるために UPW を追加する必要があります。この段階では、混合物を数時間4°Cで保存することができる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>給餌ソリューション<ol>
<li>表3に記載した量と濃度に従って、すべての試薬を加えます。 注:摂食溶液の1:1比を使用してください:内部溶液。最終的な合成細胞容積が100 μLの場合は、100 μLの供給液を調製します。外、内および供給溶液の小さな過剰なボリュームを準備することをお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 合成細胞の調製
注:合成細胞の100 μLの調製のために、次のボリュームが調整されます。
<ol><li>タンパク質を産生する合成細胞<ol>
<li>15 mLチューブに、外側溶液の12 mLを入れ、油溶液中の500μLの脂質を層の上にゆっくりと加えます。室温で20分間インキュベートします。</li>
		<li>内溶液調製を確定するには:砕氷上の内部溶液成分を解凍して、保存された混合物にS30-T7リサート(試薬15)およびDNAプラスミド(試薬16)を加えることによって、最終体積100μLに混ぜ合わせる。</li>
		<li>油溶液中の脂質500μLを有する2番目の2mLガラスバイアルに、100μLの内部溶液を加えます。ピペットは1分間激しく上下し、レベル5でさらに1分間渦巻き。<ol>
<li>砕氷上で10分間インキュベートし、15 mLチューブの油相の上にゆっくりとエマルジョンを加えます(4.1.1から)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>遠心分離機は100xgと4°Cgで10分間、遠心分離機は400xgおよび4°Cで10分間、遠心分離機を10分間行う。 g遠心分離の終わりまでに、チューブの底部にペレットが観察されるべきである。 注:スイングバケット遠心回転子を使用すると、インオイル液滴の間相通過中に脂質の第2層のより良いカバレッジを取得するためにここで好まれます。観察可能なペレットがない場合、遠心速度を1000 x gに上げることができる。それ以外の場合は、外部ソリューションの比重を参照する「ディスカッション」セクションを参照してください。</li>
		<li>ペレットを抽出します。<ol>
<li>余分な油層を除去します。</li>
			<li>約400 μLの外側溶液を取り付けたトリミングされたピペットチップを使用してペレットを抽出します。水相のペレットのみを集めるために油相を通過しながら外液を放出する。<ol>
<li>ペレットの抽出後にチップを拭き取り、オイル残りを移動させないようにし、ペレットをクリーンな1.5 mLチューブに移します。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>遠心分離機を1,000 x gおよび4°Cで10分間、上清を取り除き、100 μLの供給液(内水溶液の1:1比)でペレットを再懸濁します。 注:固定角度の遠心回転子もここで使用することができます。</li>
		<li>タンパク質発現の場合は、振盪せずに37°Cで2時間インキュベートします。 注:最適なインキュベーション時間は、異なるタンパク質によって異なります。</li>
		<li>目的タンパク質特性に応じて適当な方法を用いて、産生タンパク質量を評価する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>推奨制御グループ<ol>
<li>内溶液および溶解活性の確認<ol>
<li>完全なインナー溶液(DNA&S30-T7溶解液)を準備してください。</li>
			<li>250rpmで床インキュベーターシェーカーを使用するか、1200rpmでサーモミキサーを使用して、2時間37°Cの一定温度ですぐに上記の反応をインキュベートする。 注:合成細胞のインキュベーション時間に合わせてインキュベーション時間を調整します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>合成細胞<ol>
<li>陰性対照群: DNAを含まない内部溶液で4.1で提示されたプロトコルを準備します。</li>
			<li>ポジティブコントロール:レポーター遺伝子のT7プラスミドコードを含むインナー溶液を用いて4.1で提示されるプロトコルを準備します。 注:sfGFPなどのレポーター遺伝子で構成される陽性対照群をテストグループと一緒に追加し、カプセル化効率ステップを確認します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167(2017).</li>
<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、大量のタンパク質産生合成細胞を製造するための簡単で手頃な方法を導入しています。アクティブセルの収量は、いくつかの重要なステップに重点を置いて、プロトコルの慎重かつ正確な実行に依存しています。この方法のライセート調製部では、菌体のリセート中に十分な量のタンパク質を得るためには、細胞のリシス前に適切な細菌密度に到達することが不可欠である。第二に、リシスプロセスは、タンパク質活性を維持するために液体窒素で速やかに凍結し、4°Cで行われるべきである。さらに、このプロトコルでは、T7 RNAポリメラーゼを発現するpAR1219プラスミドで形質転換した大腸菌BL21(DE3)細胞を用いた。異なる菌株が使用される場合、RNAポリメラーゼおよびリボソームの満足のいく量に達するために、ライセート濃度の変化が必要となる場合があります。同じ細菌株が使用される場合でも、異なるライゼート生産物は、バッチからバッチへの変動性を有し得る。
小胞生産セクションには、いくつかの重要な手順も含まれています。脂質の可溶化と鉱物油からのクロロホルムの除去は、油中水エマルションを確立する...

合成細胞は、人工的な細胞様粒子であり、生細胞の1つまたは複数の機能を模倣し、例えば、分裂する能力、膜相互作用を形成し、遺伝コード11、2、32,3に基づいてタンパク質を合成する。無細胞タンパク質合成(CFPS)システムを包み込んだ合成細胞は、DNAテンプレートの変化に伴い様々なタンパク質やRNA配列を産生する能力により、高いモジュール性を有します。タンパク質産生の現在のアプローチに代わる魅力的な代替手段を提示するCFPSシステムは、細胞リ,セート、精製成分、または合成成分に基づいており、リボソーム、RNAポリメラーゼ、アミノ酸およびエネルギー源(例えば、3-ホスホグリセリン酸およびアデニンリン酸)4、5、6、7、9、9、リソソー4,5ムなどのタンパク質合成に必要なすべての転写および翻訳機械を含む。6,7,8,9脂質小胞内のCFPSシステムのカプセル化は、生細胞10に依存することなく、タンパク質の簡単かつ効率的な生産を可能にする。さらに、このプラットフォームは、天然細胞内で分解し得るペプチドの合成、生きている細胞に毒性のあるタンパク質の産生、および非天然アミノ酸11、12,12を有するタンパク質を改変することを可能にする。合成細胞は、進化的な視点から細胞の生命を可能にするために必要な最小限の細胞成分を調査する研究目的のモデルとして使用されてきた11,13。合成細胞は、遺伝的回路の構築と実装、および指向進化14、15、1615,16のモデルとしても使用されてきた。14他の研究は、天然細胞の生物活性を模倣する合成細胞の能力に焦点を当て、糖尿病患者におけるベータ細胞などの損傷した天然細胞を置き換えることを目指している17。さらに、これらのCFPSカプセル化合成細胞が種々の治療用タンパク質を産生する能力は、臨床使用18に組み込まれる可能性を示している。
ここでは、脂質小胞に封入されたCFPSシステムに基づくRNAおよびタンパク質産生合成細胞の産生のためのボトムアップラボスケールプロトコル(図1)について説明する。これは、生体内での治療タンパク質薬のオンサイト生産のための新規薬物送達システムとしての合成細胞プラットフォームの潜在的な使用を示す19。これまでの研究では、CFPS反応と細胞ライセート調製プロセス44、8、208,20の最適化を調査してきました。また、細胞サイズのリポソーム製剤としては、マイクロ流体およびポリマーベースの液滴安定化法21,22,23など21,22,、リポソームの脂質組成24,25,2625,26にも異なる手法24が適用されている。23提示されたプロトコルにおいて、合成細胞は、油中の水中のエマルジョン移動法を用いて製造され、カプセル化プロセスは低温(<4°C)5、10、24、27、28で行われる。5,10,24,27,28これらの穏やかな条件は、分子機械、すなわちリボソームおよびタンパク質27、29、3029,30の生体機能完全性を保持27するために好ましいことが判明している。粒子の脂質組成は、コレステロールと1-パルミトイル-2-オレロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)の両方からなる。第1は、すべての哺乳動物細胞膜に見られ、膜の安定性、剛性および透過性の低下に不可欠であり、後者は哺乳動物リン脂質組成物11、13,13を模倣する。細胞転写および翻訳分子機械はBL21(DE3)大腸菌(大腸菌)株から抽出され、PAR1219プラスミドで過剰発現するT7 RNAポリメラーゼで形質転換され、CFPSの効力とタンパク質合成を増加させる。このシステムは、診断および治療用タンパク質を産生するために使用されており、インビトロおよびインビボ19,31,31の最大66 kDaの分子量を有する。以下のプロトコルは、合成細胞系の生産のための簡単かつ効果的な方法を提供し、タンパク質合成に関連する広範な基本的な問題に本質的に対処することができ、また、薬物送達用途に利用することができる。

<table><tbody><tr><td>A. ステップ1に必要な試薬(S30-T7ライセート調製)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 BL21(DE3)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2527</td><td>大腸菌BL21(DE3)。</td></tr><tr><td>pAR1219</td><td>Sigma</td><td>T2076</td><td>変換用TargeTronベクトル。</td></tr><tr><td>50 mg/mL アンピシリン</td><td>Sigma</td><td>A9518</td> のストック溶液を <td>-20°C で保存。</td></tr><tr><td>10 g/L バクトトリプトン</td><td>BD バイオサイエンス&nbsp;</td><td>211705</td><td>Luria Bertani (LB) 寒天培地 (1.5%) プレートの調製用。</td></tr><tr><td>10 g/L 塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>5 g/L バクト酵母抽出物</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>15 g / L寒天培地</td>メル<td>ク</td><td>1.01614.5007</td><td></td></tr><tr><td>50 &g/mL アンピシリン</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>10 g/L バクトトリプトン</td><td>BD バイオサイエンス&nbsp;</td><td>211705</td><td>Luria Bertani(LB)培地(20 mL)の調製用。</td></tr><tr><td>10 g/L 塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>5 g/L バクト酵母抽出物</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>50 &マイクロ;g/mL アンピシリン</td><td>Σ</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>12 g/L バクトトリプトン</td><td>BD バイオサイエンス&nbsp;</td><td>211705</td><td>Terrific Broth(TB)培地(1L)の調製用。</td></tr><tr><td>24 g/L バクト酵母エキス</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>4% (v/v) グリセロール無水</td><td>Bio-Lab</td><td>7120501</td><td></td></tr><tr><td>2.32 g/L K2HPO4</td><td>スペクトル化学</td><td>P1383</td><td></td></tr><tr><td>12.54 g/L KH2PO4</td><td>スペクトル化学</td><td>P1380</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;50 マイクロ;g/mL アンピシリン</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>100 mM イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)の原液&nbsp;</td><td>INALCO</td><td>INA-1758-1400</td><td>0.2 & micro を使用してろ過。m親水性PVDFシリンジフィルター。</td></tr><tr><td>0.1 Mジチオスレイトール(DTT)の原液&nbsp;</td><td>TCI</td><td>D1071</td><td>0.2 &micro を使用してフィルタリング。m親水性PVDFシリンジフィルター。</td></tr><tr><td>pH = 7.4 の 10 mM トリス酢酸</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>S30 ライセート緩衝液 (1.5 L)</td></tr><tr><td>14 mM 酢酸マグネシウム</td><td>Merck</td><td>1.05819.0250</td><td></td></tr><tr><td>60 mM 酢酸カリウム</td><td>Carlo Erba</td><td>470147</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>TCI</td><td>D1071</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL/L 2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ステップ 1 に必要な機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL 滅菌三角フラスコ</td><td>Thermo Scientific</td><td>50-154-2846</td><td>2 フラスコ</td></tr><tr><td>2 L 滅菌三角フラスコ(バッフル付き)</td><td>KIMAX-KIMBLE</td><td>25630</td><td>フラスコ 2</td></tr><tr><td>フラスコ フロアインキュベーターシェーカー</td><td>MRC</td><td>TOU-120-2</td><td>ラボ用シェーカーインキュベーター 450x450mm、400rpm、70 &deg;C</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004270</td><td>(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. 少なくとも13,000 x gを有効にする必要があります。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;* 4°Cに予冷。</td></tr><tr><td>高圧ホモジナイザー</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>4°Cに予冷。</td></tr><tr><td>-80oC冷凍庫</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み1.5mLプラスチックチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120086</td><td>できれば-20°Cに予冷してください。</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>TECAN</td><td>IN-MNANO</td><td>Infinite M200 pro</td></tr><tr><td>96ウェル透明プレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済みメスシリンダー</td><td>コーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み遠心分離管</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120086</td><td>-20°Cに予冷することが望ましいです。</td></tr><tr><td>滅菌されたピペットチップ</td><td>コーニング</td><td></td><td>できれば-20°Cに予冷されています。</td></tr><tr><td>砕いたアイスバケツ</td><td>Bel-Art</td><td>M18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>小型液体窒素タンク</td><td>NALGENE</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>B. ステップ3に必要な試薬(油溶液中の脂質調製):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)</td><td>リポイド</td><td>556400</td><td>粉末</td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>シグマ</td><td>C8667</td><td>粉</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>バイオラボ</td><td>3082301</td><td></td></tr><tr><td>鉱油</td><td>シグマ</td><td>M5904</td><td></td></tr> <tr><td>ステップ2<</ストロング>に必要な軽油装置 /ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>科学産業</td><td>SI-0256</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブロック</td><td>TECHNE</td><td>FDB03AD</td><td>80°C. に予熱 制御された温度を有効にする必要があります。&nbsp;</td></tr><tr><td>2 mLスクリューネックガラスバイアルCSI</td><td>Analytical Innovations</td><td>VT009M-1232</td><td>大規模な場合は、50 mLのファルコンを使用し、ロータリーエバポレーターを使用してクロロホルムを蒸発させます。</td></tr><tr><td>9mmスクリューキャップ</td><td>CSI 分析イノベーション</td><td>C395R-09LC</td><td></td></tr><<tr><td>strong>C. ステップ3(内部および供給反応混合物)に必要な試薬:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Spectrum</td><td>H1089</td><td>1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH緩衝液</td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td> <td>Frutarom</td><td>55290</td><td></td></tr><tr><td>1 M 酢酸マグネシウム</td><td>メルク</td><td>1.05819.0250</td><td>コーファクターと負電荷安定器。</td></tr><tr><td>1 M 酢酸カリウム</td><td>Carlo Erba</td><td>470147</td><td>負電荷安定剤。</td></tr><tr><td>5.2 M 酢酸アンモニウム</td><td>メルク</td><td>1.01116.1000</td><td>負電荷を安定させます。</td></tr><tr><td>50% (w/v) ポリエチレングリコール 6000 (PEG)</td><td>Merck</td><td>8.07491.1000</td><td>高分子の濃度を増加させます。</td></tr><tr><td>0.5 M 3-ホスホグリセリン酸 (3-PGA)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td>二次エネルギー源。</td></tr><tr><td>50 mM アミノ酸混合物 I</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td>アミノ酸添加物. 含まれるもの: アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、スレオニン、バリン</td></tr><tr><td>50 mM アミノ酸混合物 II</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td>アミノ酸添加物. 含まれるもの:トリプトファン、フェニルアラニン、チロシンの3つの天然アミノ酸のそれぞれ50 mM。</td></tr><tr><td>100 mM アデニン三リン酸 (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A3377</td><td>ヌクレオチドおよびエネルギー源。</td></tr><tr><td>50 mM グアニジン三リン酸 (GTP)</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td>ヌクレオチドおよびエネルギー源。</td></tr><tr><td>100 mM ウリジン三リン酸 (UTP)</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>226310010</td><td>ヌクレオチド添加剤。</td></tr><tr><td>100 mM イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>INALCO</td><td>INA-1758-1400</td><td>遺伝子発現誘導.</td></tr><tr><td>2 M ショ糖</td><td>J.T. Baker</td><td>1933078</td><td>密度勾配の生成。</td></tr><tr><td>2 M Glucose</td><td>Sigma</td><td>16301</td><td>密度勾配の生成。</td></tr><tr><td>H2O 超純水 (UPW)</td><td>Bio-Lab</td><td>2321777500</td><td>DNase &RNase free</td></tr><tr><td>S30-T7 lysate</td><td>_</td><td>_</td><td>ステップ 1 で調製しました。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;転写のソース&translation components. -80 &deg;c、使用直前に砕けた氷の上で解凍します。&nbsp;</td></tr><tr><td>選択されたDNAプラスミドのストック</td><td>_</td><td>_</td><td>要求されたタンパク質の配列が含まれています. T7プロモーター</td></tr><tr><td><ストロング>D.ステップ4(合成細胞の準備)に必要な機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フロアインキュベーターシェーカーまたはサーモ</td><td>ミキサーMRC</td><td>TOU-120-2</td>ラボ<td>シェーカーインキュベーター450x450mm、400rpm、70°;C</td></tr><tr><td>PHMTグラントバイオ&nbsp;</td><td>PSC18</td><td>サーモミキサー</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004270</td><td>(75003629) - TX-400 4 x 400mL スイングバケット ローター. 15 mL サイズのチューブに適しています。 できればスイングバケット. 少なくとも 1000 x g. 4°Cに予冷する必要があります。</td></tr><tr><td>テーブル遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td>(75003424) - 24 x 1.5/2.0mLローター、ClickSeal. 付き Eppendorf vials. に適しています 4°Cに予冷されています。</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>サイエンティフィックインダストリー</td>ズ <td>SI-0256</td><td></td></tr><tr><td>砕氷バケツ</td><td>Bel-Art</td><td>M18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL スクリューネックガラスバイアル</td><td>CSI Analytical Innovations</td><td>VT009M-1232</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 15 mL プラスチックチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み 1.5 mL プラスチックチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済みピペットチップ</td><td>コーニング</td><td></td><td>オートクレーブ滅菌済み。</td></tr></tbody></table>

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

合成細胞の構築のためのボトムアップアセンブリアプローチは、細胞模倣環境で細胞プロセスを分離し、調査するための効果的なツールです。さらに、無細胞発現系の開発は、タンパク質の産生、転写、翻訳プロセス(DNA→RNA→タンパク質)を制御された方法で再構成する能力を実証し、合成生物学を活用しています。ここでは、コレステロールが豊富な脂質ベースの巨大なユニラメラ小胞(すなわち、安定したリポソーム)の中に強力な細菌リゼートを産生し、カプセル化する、無細胞発現系を調製するためのプロトコル(すなわち、安定リポソーム)を説明する。プロトコルは、活性細菌リセートの生産を含む合成細胞の成分を調製するための方法を説明し、続いて、油中水エマルジョン移動法に基づく合成細胞の詳細なステップバイステップ調製を行う。これらは、タンパク質の異なるタイプを生産するための高い汎用性を持つシンプルで手頃な方法で合成細胞の数百万の生産を容易にします。得られた合成細胞は、単離された環境でのタンパク質/RNA産生および活性を調査し、指示された進化において、また体内での治療タンパク質のオンデマンド生産のための制御薬物送達プラットフォームとして使用することができる。

脂質小胞内にBL21大腸菌を用いたS30-T7 CFPSシステムをカプセル化することにより、合成細胞の調製のためのプロトコルを提示する。各段階のイメージを含む準備プロセスの概略説明を図 2に示します。合成細胞調製プロセスの成功は、各段階の適切な性能に依存し、異なるパラメータによって影響を受けます。プロトコルは、特定のタンパク質の生産に対応するように調整する必要があります。
T7プロモーター下のモデルタンパク質スーパーフォルダーグリーン蛍光タンパク質(sfGFP)とレニラルシファーゼを発現するプラスミドをCFPSバルク反応および合成細胞に導入し、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、顕微鏡検査および分光法を含む異なる方法を用いてタンパク質産生を評価した(図3)。ウェスタンブロット分析によるsfGFP-His6タグ付きタンパク質(〜27kDa32)の生産の検証を図3...

このプロトコルは、RNAおよびタンパク質生産合成細胞のボトムアップ調製のための方法、材料、装置およびステップを記述する。合成細胞の内部水質コンパートメントには、脂質二重層内に封入されたS30細菌リセート(すなわち、安定リポソーム)を含み、油中水エマルジョン移動法を用いた。

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

タンパク質産生合成細胞は、高度な薬物送達のための合成細胞ベースの治療法と同様に、生命の起源を研究するための汎用性の高いプラットフォームを提供します。この方法は、RNAおよびタンパク質発現のためのシンプルで手頃な価格であり、体内で直接オンサイト治療タンパク質の生産に適用することができます。このシステムは、代謝疾患やタンパク質置換から癌、糖尿病に至る幅広い疾患の治療に使用できます。この複数ステッププロトコルには、定義された停止点があります。初めて実行する場合は、数日間にわたって作業を分割することをお勧めします。合成細胞製造のためのプロトコルは、細胞を含まないS30-T7リセートの調製から始まります。次に、膜脂質と細胞栄養溶液は、内部環境をシミュレートし、タンパク質の生産をサポートするために準備されます。最後のステップは、合成細胞自体の調製です。100ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコで重複したスターター培養を準備します。各フラスコに、アンピシリン1ミリリットル当たり50マイクログラムを添加したLB培地5ミリリットルを加え、単一の大腸菌コロニーで接種する。250 rpm と 37°C で床インキュベーター シェーカーで一晩培養を育てる。次に、500ミリリットルの結核培地を含む2リットルのバッフル・エルレンマイヤーフラスコを調製し、1ミリリットルのアンピシリン当たり50マイクログラムを補う。5ミリリットルのスターター培養で各2リットルフラスコを接種する。フラスコを250rpmと37°Cのシェーカーに入れます。分光光度計を使用して培養物を定期的に監視し、0.8~1のOD600まで培養を成長させます。T7 RNAポリメラーゼの発現を誘導するには、各フラスコに100ミリモルIPTGの3ミリリットルを加え、0.6ミリモルに達する。OD600が約4になるまで培養を続けます。培養物が所望の光学密度に達した後、各エルレンマイヤーフラスコから250ミリリットルの殺菌された遠心分離管に懸濁液を移す。チューブを摂氏4度で10分間7,000倍に遠心します。上清を捨てます。必要に応じて攪拌機を使用して、各ペレットを250ミリリットルの冷たいS30溶液緩衝液で再懸濁する。摂氏4度で10分間、7,000倍gの遠心分離機。上清を捨て、冷たいS30ライセートバッファーの15ミリリットルですべてのペレットを再懸濁します。ガーゼパッドを使用して懸濁液をフィルターします。次のステップに進む前に、ライセートを保存するために必要な1.5ミリリットルバイアルでチップを予冷します。懸濁液を2回均質化する。細胞破損のための4つの棒の空気圧の15,000 PSIの働く圧力を使用する。ホモジネートを収集します。均質化懸濁液の10ミリリットルあたり0.1モルDTTの100マイクロリットルを加える。24、摂氏4度で30分で700回gでサスペンションを遠心分離する。DTTとクロロホルムは刺激性と有害に分類されるため、注意して扱う必要があります。プロトコルで後述するクロロホルムは、ヒューム抽出のある領域で使用する必要があります。ライセート活性を維持するには、迅速にステップを実行します。あらかじめ冷却されたバイアルに上澄み液の200マイクロリットルのアリコートを入れ、すぐに液体窒素でそれらを凍結します。バイアルは、将来の使用のためにマイナス80°Cで保存してください。別々にクロロホルムでPOPCとコレステロールを溶解します 1 ミリリットルあたり 100 ミリグラムの最終濃度.各バイアルを別々に渦。2ミリリットルのガラスバイアルにコンポーネントを組み合わせます。コレステロール-クロロホルム溶液50マイクロリットル、POPC-クロロホルム溶液50マイクロリットル、ミネラルオイル500マイクロリットルを加えます。バイアルをボルテックスし、クロロホルムを蒸発させ、化学フードで摂氏80度で約1時間加熱する。合成細胞製造段階を開始する前に、原稿に記載されているように外液、プレインナー、および給餌液を調製する。その後、15ミリリットルのチューブに外側溶液の1.2ミリリットルを入れ、最初のガラスバイアルから500マイクロリットルの脂質油中溶液の層をゆっくりと追加します。室温でチューブを20分間インキュベートします。内部溶液の調製を確定するには、S30-T7溶解液およびDNAプラスミドを添加して、氷上で100マイクロリットルの最終体積に混ぜます。500マイクロリットルの脂質油中溶液を用いて、2ミリリットルのガラスバイアルに溶解液とプラスミドを使用して100マイクロリットルの内部溶液を加えます。ピペットは1分間激しく上下し、レベル5でさらに1分間渦巻きします。得られたエマルジョンを砕いた氷の上で10分間インキュベーションした後、15ミリリットルチューブの油相の上にエマルジョンをゆっくりと加える。チューブを100倍gと摂氏4度で10分間遠心分離します。その後、400倍gと摂氏4度で10分間遠心分離機。遠心分離の終わりまでに、ペレットはチューブの底部で観察可能であるべきです。ペレットを抽出するには、まず余分な油層を除去する。次に、約400マイクロリットルの外側溶液でトリミングされたピペットチップをロードし、ピペットチップを使用してペレットを採取し、ピペットチップが油相を通過する際に外側溶液を放出する。ピペットチップを拭き、ペレットをきれいな1.5ミリリットルのチューブに移します。ペレットを1,000倍gと摂氏4度で10分間遠心します。上清を取り除き、100マイクロリットルの供給溶液でペレットを再懸濁します。タンパク質発現の場合は、振盪することなく摂氏37度で2時間の懸濁液をインキュベートします。モデルタンパク質sfGFPおよびレニラルシメラーゼを発現するプラスミドを無細胞タンパク質合成、CFPSバルク反応、および合成細胞に導入した。タンパク質の産生は、いくつかの方法を用いて評価した。ウェスタンブロット分析は、CFPSバルク反応と合成細胞内部の両方でsfGFP His6産生を検出した。精製されたsfGFP His6は陽性対照として使用した。ブライトフィールドとGFPフィルターを備えた蛍光顕微鏡は、sfGFPを産生している合成細胞を示しています。フローサイトメトリーを用い、sfGFP産生合成細胞を分析した。活性合成細胞集団の計算は、赤色ヒストグラムで表される陰性DNAサンプルで定義されるsfGFP蛍光強度閾値に基づいていた。合成細胞を産生するsfGFPの平均蛍光強度は、活性合成細胞集団から算出し、陰性DNA試料に正規化した。活性合成細胞の直径分布はsfGFP信号に基づいて算出した。ルシメラーゼ活性を発光測定で定量した。この方法は非常に汎用性が高く、溶解物の起源、脂質組成および内部溶液濃度を変化させることによって異なる標的タンパク質に対して最適化することができる。蛍光マーカータンパク質を産生する合成細胞のFACS分析を行い、活性合成細胞の画分の定量値を提供することができる。ウェスタンブロット分析はタンパク質の産生を測定するであろう。

preparing-protein-producing-synthetic-cells-using-cell-free-bacterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Wiegand、DJ、 et al。 急速に増殖する細菌ビ ブリオナトリゲンを用いた無細胞タンパク質の発現。 J. Vis. Exp. (2019)。このビデオでは、 Vibrio natriegens 粗ライセートに基づく細菌の無細胞タンパク質発現システムを使用して、in...

細菌粗細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質発現

この5日間のプロトコルは、すべての手順、機器、およびベースの効率的な内在大腸菌ゼロからTX-TLの無細胞発現系を作成し、実行するために必要な追加ソフトウェアの概要を説明します。試薬を用いて、プロトコルは8セットアップ時間以下の反応、収集、およびプロセスデータをとる。...

実装するためのプロトコルエシェリヒア·コリに基づくTX-TLの無細胞発現系

面上、バイオチップの無細胞遺伝子発現実験を行うため遺伝子長 DNA...

多段鎖変位リソグラフィーを用いた遺伝子の機能的な面を固定化

このプロトコルの詳細手順、コスト、および大腸菌を生成に必要な装置・細胞抽出液をベースし、4 日間以内の in...

大腸菌の無細胞タンパク質合成のベース: 堅牢な柔軟性とアクセス可能なプラットフォーム技術のためのプロトコル

このプロトコルは、小麦無細胞系およびリポソームを用いた二重層透析法による高品質のプロテオリポソームの効率的な無細胞生産法を記載する。この方法は、膜タンパク質の機能解析、創薬標的のスクリーニング、および抗体開発に適した手段を提供します。...

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

このプロトコルは、 エシェリヒア大腸菌...

細菌無細胞リザートの迅速、手頃な価格、および単純な生産

この研究は、 大腸菌(E.coli )からの細胞抽出物の調製とそれに続く無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を24時間未満で記載する。無細胞自己誘導(CFAI)プロトコルの説明は、研究者の監督を減らし、得られる細胞抽出物の量を増やすために行われた改善を詳述する。...

無細胞自己誘導ワークフローを使用した24時間以内に細胞から無細胞タンパク質合成へ

ここに提示するのは、エシェリヒア・コリBL21...

線状DNAテンプレートを用いたエキソヌクレアーゼ欠損細胞抽出物からの無細胞タンパク質合成(英語)

本プロトコルは、細胞外膜結合小胞内にパッケージされた、典型的に不溶性またはジスルフィド結合含有タンパク質を含む組換えタンパク質の細菌産生のための詳細な方法を記載する。これは、応用バイオテクノロジーや医学など、科学研究の多様な分野に適用できる可能性があります。...

大腸菌からの組換えタンパク質充填小胞の最適生産と分析

このプロトコルは、合成細胞の構築に使用される無細胞タンパク質合成(CFPS)システムについて説明しています。主要なステージの概要と、さまざまなマイクロコンパートメントでの代表的な結果を示します。このプロトコルは、合成細胞コミュニティの多様な研究室のベストプラクティスを確立し、合成細胞開発の進歩を促進することを目的としています。...

合成細胞を構築するための無細胞タンパク質合成システム

学ぶ 細胞を含まないS30-T7リゾートを用いた合成細胞の調製法。リポソームとエマルジョン移動でバクテリア抽出物を封入し、治療用タンパク質の現場生産プラットフォームを構築する。

細胞を含まない細菌抽出物、リポソーム、エマルジョン移動を用いた合成細胞の調製

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