Name: リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いたリゾ脂質含有温度感受性リポソームの作製法。ドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封入と光熱トリガー放出による制御薬物送達を実現します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は、前立腺癌英国(CDF-12-002フェローシップ)、および工学物理科学研究評議会(EPSRC)(EP/M008657/1)に資金を提供してくれたことに感謝します。

1. 機器のセットアップ
<ol><li>次のようにシリンジポンプとSHMを組み立てます。<ol>
<li>ポンプネットワークケーブルを使用して、二次シリンジポンプの「コンピュータへ」ポート(ポンプ02、水溶液用)をマスターシリンジポンプの「ネットワークへ」ポート(ポンプ01、エタノール脂質溶液用)に接続します(図1、黄)。</li>
		<li>コンピュータの「RS232 シリアル」ポートにマスターポンプの「コンピュータへ」ポートを接続し、PC to Pump ネットワークケーブル (図1、青) を使用します。</li>
		<li>ナットとフェルールを使用して、SHMの各入口と出口にチューブを接続します。別のナットとフェルールと組合アセンブリを使用して、両方の入口のチューブの端子をメスルアーに変換します。入口の長いチューブにより、シリンジへの取り付けが容易になります(図2)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ポンプ制御ソフトウェアをセットアップします。<ol>
<li>マスターシリンジポンプと二次シリンジポンプのアドレスを、それぞれ「Ad:01」と「Ad:02」に、注射器ポンプの「セットアップ」ボタンを使用して割り当てます。これは初めて行う必要があります。</li>
		<li>コンピュータでポンプ制御ソフトウェアを開きます。2つのシリンジポンプは自動的に検出され、ビープ音が鳴ります。それ以外の場合は、[ポンプと検索ポンプ]をクリックして接続を更新します。(図3)。</li>
		<li>「HSW ノルムジェクト 5 cc (Dia=12.45)」を選択して、直径を 12.45 (mm) に割り当てます。</li>
		<li>ポンプ01(エタノール脂質溶液)の場合は0.25 mL/分、ポンプ02の場合は0.75 mL/分(水溶液)に割り当てます。流量は総流量(TFR)1mL/分、水対エタノール間流量比(FRR)は3です。</li>
		<li>ボリュームを 5 mL より大きい値に割り当てます。 注: ターゲットの注入量は、チューブの空隙体積を考慮して、ロードされた液体ボリュームよりも大きく設定されています。</li>
		<li>両方のポンプに対して INF (注入) モードを選択します。</li>
		<li>設定を押して設定を確定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. LTSLs を準備する
<ol><li>LTSL10またはLTSL10-ICG脂質混合物を調製する(表1参照)。</li>
	<li>2つの5 mLルアーロックシリンジを用いて、1mLの脂質混合物と少なくとも3mLの(NH4)2SO4溶液を回収する。</li>
	<li>2本の注射器を直立位置のシリンジポンプに取り付け、注射器のバレルフランジをポンプのシリンジリテーナーにスライドさせ、シリンジのプランジャーフランジをポンプのプッシャーブロックに取り付けます(図4)。</li>
	<li>加熱テープの端を水溶液でシリンジに巻きます。加熱テープのもう一方の端とサーモスタットの温度プローブを脂質溶液でシリンジの周りに巻きます。アセンブリプロセスを容易にするために、空のシリンジを配置してこのステップを練習すると便利です(図5A)。</li>
	<li>SHMの対応する入口の女性ルアーアダプターに2本の注射器を接続します。脂質混合物と(NH4)2SO4溶液を含む注射器がそれぞれエタノール入口および水性入口に接続されていることを確認してください。プランジャの位置を調整して、シリンジから気泡を取り除きます(図5B)。 メモ:シリンジがポンプのシリンジリテーナーにしっかりと固定されていることを確認してください。</li>
	<li>10 sの加熱セッションを使用して、加熱テープを使用して51°C以上に注射器を加熱します。サーモスタットに注射器の温度を更新させます。注入中の温度を維持するには、次の手順でこの手順を繰り返します。 注意: 温度のオーバーシュートを防ぎ、サーモスタットが実際の温度を更新できるように、10 s後に加熱テープをオフにします。加熱テープは、温度が非常に迅速に上昇するので、注意して処理する必要があります。連続的に加熱すると、測定温度を更新するためのサーモスタットの時間遅延により、機器およびシリンジが損傷する可能性があります。</li>
	<li>温度が51 °Cを超えたら、ポンプ制御ソフトウェアで[すべて実行]を押してシリンジポンプを実行します(図3)。</li>
	<li>流体の流れが気泡や漏れがないことを確認します。排出口から液体の初期量(約0.5mL)を廃棄物として処分します。 注:この初期廃棄物量は明確ではなく、液体がチューブとSHMを通ってコンセントに移動する流体の体積であるセットアップの内部容積に依存します。</li>
	<li>リポソームサンプルとして残りの液体をマイクロ遠心管またはビジューバイアルに回収します。</li>
	<li>注射器のどちらかの液体がほとんど空の場合は、注入を一時停止/停止します。 注:ポンプは、注射器が空のときに正確に位置を検出しない可能性があるため、手動で停止する必要があります。</li>
	<li>収集したリポソーム溶液を60°Cの水浴に入れ、1.5時間アニールします。 注:このステップは、リポソームへの薬物のロードを可能にするために不可欠です。</li>
	<li>透析チューブにソリューションを転送します。240 mMの1 L(NH4) 2SO4で37°Cで少なくとも4時間の溶液を透析し、精製リポソームを得た。 注: ここでプロトコルを一時停止できます。この工程におけるリポソームはリン脂質の5mMである。精製されたリポソームは4°Cで保存することができる。</li>
	<li>繰り返し使用するためにSHMを洗浄するには、脱イオン水、エタノール、窒素ガスで乾燥してSHMを順次洗い流します。</li>
</ol>3. 膜貫通pH勾配によるLTSLsへのDOXのリモートローディング
<ol><li>サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を用いて、LTSLsの外用緩衝液をHEPES緩衝生理食糸(HBS)に交換し、膜貫通pH勾配を確立する。<ol>
<li>SEC 列の上部に合計 25 mL の HBS を追加して、列を準備します。すべての溶出剤が柱を通して溶出し、溶出剤を処分できるようにします。</li>
		<li>ステップ2.12から調製した1mLの透析リポソームをカラムに加え、溶出した部分を処分する。</li>
		<li>1.5 mLのHBSをカラムに追加し、溶出します。</li>
		<li>3 mLのHBSをカラムに追加し、3 mLの溶出を集めます。 注: ここでプロトコルを一時停止できます。リポソームは、このステップで収集され、リン脂質の1.67 mMにある。バッファー交換リポソームは4°Cで保存することができる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ドキソルビシン(DOX)を使用してLTSLをインキュベートし、LTSLを精製します。<ol>
<li>DOX溶液を1:20 DOX-リン脂質モル比でビジューバイアルに含まれるバッファー交換リポソーム溶液(1.67 mmol)の1 mLに添加します。これは、1 mg/mL DOX溶液(83.4 μmol)の48.4 μLを添加することで達成できます。</li>
		<li>37 °Cの水浴にビジューバイアルを1.5時間入れ、DOXをリポソームに装填できるようにします。</li>
		<li>10 μL のリポソームと 170 μL の HBS と 20 μL の 1% (v/v) トリトン X-100 溶液を黒の 96 ウェルプレートに混ぜます。3つの井戸のために繰り返します。これらの井戸は、DOX含有量を「浄化前」に対応する。</li>
		<li>LTSL10-ICGを調製する場合は、リポソームの40 μLを160μLのDMSOと透明な96ウェルプレートに混ぜます。3つの井戸のために繰り返します。これらのウェルは、ICG含有量が「精製前」に対応する。</li>
		<li>ステップ3.1で説明したリポソーム溶液を精製する。 注: 後で精製するためにカラムを再利用するには、ステップ 3.1.1 を実行する前に、希釈した 0.5 M NaOH 溶液を 1 mL 追加して、フリー DOX からカラムをクリーニングします。赤の無料DOXは、素早く紫色の青と溶け出しを行います。</li>
		<li>精製されたリポソーム溶液の30 μLを150 μLのHBSと20 μLの1%(v/v)トリトンX-100溶液を黒い96ウェルプレートに混ぜます。3つの井戸のために繰り返します。これらの井戸は、DOX含有量「精製後」に対応する。</li>
		<li>LTSL10-ICGの場合、精製されたリポソーム溶液の40μLをDMSOの160μLと透明な96ウェルプレートに混ぜ合わせます。3つの井戸のために繰り返します。これらのウェルは、ICG含有量「精製後」に相当する。</li>
		<li>マイクロプレートリーダー(λex = 485nm、λ = 590 nm)を用いて、精製前(ステップ3.2.3)および(ステップ3.2.5)後のウェルのDOX蛍光強度を測定します。</li>
		<li>精製前後の蛍光強度の比を取り込んで、DOX(DOX EE)のカプセル化効率を算出します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq1.jpg">
</li>
		<li>マイクロプレートリーダー(600〜1000 nm)を使用して、精製前後のウェルのICG吸光度を測定します。</li>
		<li>ICG(ICG EE)のカプセル化効率を算出し、精製前後792nmでの吸光度の比をとり、精製中の希釈倍率(3回)を考慮に入れる。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq2a.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ダイナミック光散乱(DLS)
<ol><li>50 μLのリポソーム溶液(ステップ2.12)を450μLの脱イオン水に添加します。</li>
	<li>DLS機器の内部にキュベットを入れ、メーカーの指示に従って測定を行います。</li>
	<li>各サンプルの3つの測定値の平均Z平均直径と分散度を記録します。</li>
</ol>5. 差動走査熱量測定(DSC)
<ol><li>リポソーム試料の1mL(ステップ2.12)を0.5mL(最終脂質濃度10mM)に遠心フィルターユニットで濃縮した。固定角度ローターを使用して、7500 x gで約15分間スピンします。</li>
	<li>20 μLの(NH4)2SO4溶液とリポソームサンプルを2つのそれぞれのDSCパンに移す。DSCサンプルプレスキットを使用して、DSCハーメチックリッドで鍋を密封します。</li>
	<li>差動走査熱量計を用いて、1°C/分の加熱速度で30°Cから60°Cまでのサンプルを測定してください。</li>
	<li>適切なソフトウェアでデータを分析します。最大勾配点の接線のx切片によって測定される相転移(融点)の発症として相転移温度(Tm)をとる。</li>
</ol>6. ドキソルビシンの放出
<ol><li>湯浴を用いて、HBSを所定の温度(37または42°C)で予熱します。サンプルを焼き抜く氷水浴を準備します。</li>
	<li>微小遠心分離管に1.9 mLのHBSに精製されたDOXを積載したリポソーム(ステップ3.2.5)を100μL加えます。指定温度の水浴にチューブを入れます。</li>
	<li>すぐに200 μLのサンプルをチューブから取り出し、すぐに氷水浴に入れ、その後の薬物放出を急いでください。このサンプルは、初期 (t = 0) の時間点に対応します。</li>
	<li>200 μLのサンプルを、その後の時点(t = 5、10、15、30、60分)に引き出し、すぐに氷水浴に入れ、薬物放出を急いで消します。</li>
	<li>各時点のサンプル50μLと150μLのHBSを黒い96ウェルプレートに混ぜます。プレートリーダーを使用してDOX蛍光強度を測定します。</li>
	<li>ステップ6.5で準備されたランダム選択された井戸に1%(v/v)トリトンX-100の20 μLを加えます。プレートリーダーを使用して、これらのウェルのDOX蛍光強度を測定します。これらの値は、完全リリース (t = ∞; 100% リリース) のタイム ポイントに対応します。</li>
	<li>各時点 (I(t)) の蛍光強度を補間して放出される DOX の割合を計算し、初期 (I(0)) と比較して、完全に解放された値 (I(∞)) と比較してプロットします。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60907/60907eq3.jpg">
</li>
</ol>7. レーザー加熱とリリースのトリガ
<ol><li>水槽の温度を37°Cに設定し、温度を安定させます。</li>
	<li>200 μL の DOX 搭載 LTSL10-ICG ([ICG] = 10 μg/mL) を透明の 96 ウェルプレートに加え、水浴に入れ、底部を水に浸しておいてください。</li>
	<li>レーザーシステムの電流を2.27 Aに設定し、レーザーシステムのコリメータを96ウェルプレートの表面より5cm上に垂直に置きます。 注意: レーザーシステムは、関連するレーザー安全対策に準拠して動作する必要があります。</li>
	<li>レーザーのスイッチを入れ、光ファイバー温度プローブを使用して毎分温度を監視します。</li>
	<li>5分と10分で、透明な96ウェルプレートからレーザー照射リポソーム10μLを引き出し、黒い96ウェルプレートの3つの井戸に対して190 μLのHBSと混合します。</li>
	<li>170 μL の HBS と 20 μL の 1% (v/v) トリトン X-100 溶液を黒の 96 ウェルプレートに 3 つのウェルに対して 10 μL 混合します。これらの井戸は「100%リリース」DOXコンテンツに対応しています。DOX蛍光強度を測定し、ステップ6.7で説明されているようにDOX放出を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Needham, D., Park, J., Wright, A. M., Tong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+characterization+of+the+low+temperature+sensitive+liposome+%28LTSL%29%3A+effects+of+the+lipid+composition+%28lysolipid+and+DSPE-PEG2000%29+on+the+thermal+transition+and+release+of+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Materials characterization of the low temperature sensitive liposome (LTSL): effects of the lipid composition (lysolipid and DSPE-PEG2000) on the thermal transition and release of doxorubicin.</a> Faraday Discussions. 161, 515-534 (2013).</li>
<li>Ickenstein, L. M., Arfvidsson, M. C., Needham, D., Mayer, L. D., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disc+formation+in+cholesterol-free+liposomes+during+phase+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Disc formation in cholesterol-free liposomes during phase transition.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1614 (2), 135-138 (2003).</li>
<li>Valencia, P. M., Farokhzad, O. C., Karnik, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+accelerating+the+clinical+translation+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for accelerating the clinical translation of nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 7 (10), 623-629 (2012).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discovery+of+potent+siRNA-containing+lipid+nanoparticles+enabled+by+controlled+microfluidic+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rapid discovery of potent siRNA-containing lipid nanoparticles enabled by controlled microfluidic formulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (16), 6948-6951 (2012).</li>
<li>Forbes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scale-independent+microfluidic+manufacture+of+liposomes+entrapping+protein+incorporating+in-line+purification+and+at-line+size+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid and scale-independent microfluidic manufacture of liposomes entrapping protein incorporating in-line purification and at-line size monitoring.</a> International Journal of Pharmaceutics. 556, 68-81 (2019).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-a-chip%3A+microfluidics+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Lab-on-a-chip: microfluidics in drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 210-218 (2006).</li>
<li>Capretto, L., Carugo, D., Mazzitelli, S., Nastruzzi, C., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+and+lab-on-a-chip+preparation+routes+for+organic+nanoparticles+and+vesicular+systems+for+nanomedicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidic and lab-on-a-chip preparation routes for organic nanoparticles and vesicular systems for nanomedicine applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1496-1532 (2013).</li>
<li>Cheung, C. C. L., Al-Jamal, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterically+stabilized+liposomes+production+using+staggered+herringbone+micromixer%3A+Effect+of+lipid+composition+and+PEG-lipid+content%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Sterically stabilized liposomes production using staggered herringbone micromixer: Effect of lipid composition and PEG-lipid content.</a> International Journal of Pharmaceutics. 566, 687-696 (2019).</li>
<li>Suh, Y. K., Kang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Mixing+in+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Review on Mixing in Microfluidics.</a> Micromachines. 1 (3), 82-111 (2010).</li>
<li>Jahn, A., Vreeland, W. N., Gaitan, M., Locascio, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Vesicle+Self-Assembly+in+Microfluidic+Channels+with+Hydrodynamic+Focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (9), 2674-2675 (2004).</li>
<li>Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaotic+Mixer+for+Microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chaotic Mixer for Microchannels.</a> Science. 295 (5555), 647-651 (2002).</li>
<li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Synthesis+of+Highly+Potent+Limit-size+Lipid+Nanoparticles+for+In+Vivo+Delivery+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Synthesis of Highly Potent Limit-size Lipid Nanoparticles for In Vivo Delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).</li>
<li>Patra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Under+the+influence+of+alcohol%3A+The+effect+of+ethanol+and+methanol+on+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Under the influence of alcohol: The effect of ethanol and methanol on lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1121-1135 (2006).</li>
<li>Komatsu, H., Rowe, E. S., Rowe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Cholesterol+on+the+Ethanol-Induced+Interdigitated+Gel+Phase+in+Phosphatidylcholine%3A+Use+of+Fluorophore+Pyrene-Labeled+Phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Cholesterol on the Ethanol-Induced Interdigitated Gel Phase in Phosphatidylcholine: Use of Fluorophore Pyrene-Labeled Phosphatidylcholine.</a> Biochemistry. 30 (9), 2463-2470 (1991).</li>
<li>Lu, J., Hao, Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Cholesterol+on+the+in+Lysophosphatidylcholine+Formation+of+an+Interdigitated+Gel+Phase+and+Phosphatidylcholine+Binary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of Cholesterol on the in Lysophosphatidylcholine Formation of an Interdigitated Gel Phase and Phosphatidylcholine Binary.</a> Journal of Biochemistry. 129 (6), 891-898 (2001).</li>
<li>Vanegas, J. M., Contreras, M. F., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+unsaturated+lipid+and+ergosterol+in+ethanol+tolerance+of+model+yeast+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of unsaturated lipid and ergosterol in ethanol tolerance of model yeast biomembranes.</a> Biophysical Journal. 102 (3), 507-516 (2012).</li>
<li>Haran, G., Cohen, R., Bar, L. K., Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+ammonium+sulfate+gradients+in+liposomes+produce+efficient+and+stable+entrapment+of+amphipathic+weak+bases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Transmembrane ammonium sulfate gradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathic weak bases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1151 (2), 201-215 (1993).</li>
<li>Sadeghi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cholesterol+inclusion+on+the+doxorubicin+release+characteristics+of+lysolipid-based+thermosensitive+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Influence of cholesterol inclusion on the doxorubicin release characteristics of lysolipid-based thermosensitive liposomes.</a> International Journal of Pharmaceutics. 548 (2), 778-782 (2018).</li>
<li>Lawaczeck, R., Kainosho, M., Chan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+annealing+of+structural+defects+in+lipid+bilayer+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">The formation and annealing of structural defects in lipid bilayer vesicles.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 443 (3), 313-330 (1976).</li>
<li>Komatsu, H., Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+aggregation+and+fusion+of+small+phosphatidylcholine+liposome%3A+participation+of+interdigitated+membrane+formation+in+their+processes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced aggregation and fusion of small phosphatidylcholine liposome: participation of interdigitated membrane formation in their processes.</a> BBA - Biomembranes. 1235 (2), 270-280 (1995).</li>
<li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+with+grafted+polymers%3A+physicochemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes with grafted polymers: physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li>
<li>Hood, R. R., Vreeland, W. N., DeVoe, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+remote+loading+for+rapid+single-step+liposomal+drug+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic remote loading for rapid single-step liposomal drug preparation.</a> Lab on a Chip. 14 (17), 3359-3367 (2014).</li>
<li>Dalwadi, G., Benson, H. A. E., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+diafiltration+and+tangential+flow+filtration+for+purification+of+nanoparticle+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of diafiltration and tangential flow filtration for purification of nanoparticle suspensions.</a> Pharmaceutical Research. , (2005).</li>
<li>Roces, C., Kastner, E., Stone, P., Lowry, D., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Quantification+and+Validation+of+Lipid+Concentrations+within+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid Quantification and Validation of Lipid Concentrations within Liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (3), 29(2016).</li>
<li>Kim, S. -H., Kim, J. W., Kim, D. -H., Han, S. -H., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced-throughput+production+of+polymersomes+using+a+parallelized+capillary+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Enhanced-throughput production of polymersomes using a parallelized capillary microfluidic device.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14 (3-4), 509-514 (2013).</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

提示されたプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)を用いた低温感受性リポソーム(LTSLs)の調製を記述する。LTSL10製剤は42 °Cの臨床的に達成可能な高体温で5分以内にドキソルビシンの温度誘発バースト放出を可能にする。また、DOXの放出を引き起こした光熱加熱のために、インドシアニングリーン(ICG)を共装することもできる。この方法は、(i)SHM11におけるエタノールと硫酸アンモニウム溶液の迅速で混沌とした混合によって提供される均質化溶媒環境下でのリポソームへのリン脂質の自己集合体に依存する。(ii) DOXローディングに必須の脂質二重層の完全性を維持するためにリポソームのアニーリング;(iii) 硫酸アンモニウムpH勾配によるLTSLsへのDOXの遠隔ローディング17.このプロトコルで利用される装置は市販され、パラメータが最適化されているので、このアプローチは、事前の知識やマイクロ流体の経験のないユーザーのために管理可能です。
プロトコル内で最も重要な手順の 1...

LTSL製剤は、化学療法薬ドキソルビシン(DOX)を送達するために開発された臨床的に関連するリポソーム製品であり、臨床的に達成可能な軽度の温熱療法(T≈ 41°C)1での効率的なバースト薬物放出を可能にする。LTSL製剤は、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)、リソ脂質1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(MSPC;Mは「モノ」)およびPEGylatelated脂質1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000)を表す。相転移温度(Tm≈ 41°C)に達すると、リソリピッドとDSPE-PEG2000が共に膜細孔の形成を促進し、薬物2のバースト放出をもたらす。LTSLsの調製は、主にバルクトップダウンアプローチ、すなわち脂質膜水和および押出を使用する。臨床用途に十分な量と同じ特性を持つ大規模なバッチを再現可能に準備することは依然として困難です。
マイクロ流体はリポソームを調製する新しい技術であり、チューナブルナノ粒子サイズ、再現性、および拡張性3を提供する。製造パラメータが最適化されると、スループットは、ベンチスケール3、4、5で用意されたものと同じ特性で、並列化によってスケールアップすることができます。従来のバルク技術よりもマイクロ流体の主な利点は、小型化を通じて空間と時間の制御性が高い小さな液体量を処理する能力であり、6の連続的かつ自動化された方法で動作しながら、より速い最適化を可能にする。マイクロ流体デバイスを用いたリポソームの製造は、押出や超音波処理などの均質化プロセスが不要であるため、より時間とエネルギー効率が高いボトムアップナノ沈降アプローチによって達成される7。典型的には、脂質(例えばエタノール)の有機溶液(および疎水性ペイロード)は、混和性の非溶媒(例えば水および親水性ペイロード)と混合される。有機溶媒が非溶媒と混合すると、脂質に対する溶解度が低下する。脂質濃度は、最終的に沈殿プロセスが引き起こされる臨界濃度に達する7.最終的に脂質のナノ沈殿物は大きさに成長し、リポソームに近い。リポソームの大きさと均質性を左右する主な要因は、非溶媒と溶媒の比率(すなわち水性-有機流量比;;FRR)とリポソームへの脂質の自己集合中の溶媒環境の均質性を8にする。
マイクロ流体の効率的な混合は、したがって、均質なリポソームの調製に不可欠であり、および異なる用途9に使用されているミキサーの様々な設計。ずれたヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)は、低希釈因子で(mL /分の範囲で)高いスループットを可能にするパッシブミキサーの新世代の1つを表します。これは従来のマイクロ流体流体混合装置8、10に優れている。SHMは、カオスの対流9、11によって流体を迅速に混合するヘリンボーン溝をパターン化しました。SHMの短い混合タイムスケール(< 5 ms、典型的な凝集時間スケール10〜100 ms未満)は、均一な溶媒環境で脂質自己集合が起こり、均一なサイズ分布3、12のナノ粒子を生成することを可能にする。
しかし、マイクロ流体を用いたLTSLsの調製は、コレステロール8の欠如による従来のリポソーム製剤に比べてそれほど簡単ではなく、脂質二重層がエタノール誘発間桁化を受けやすい13、14、15ではない。これまで、リポソームのマイクロ流体生産時に生じる残留エタノールの効果は十分に理解されていなかった。報告された製剤の大半は、本質的に、LTSLsとは異なり、飽和およびコレステロールフリーである(コレステロールまたは不飽和脂質を含む)間桁に耐性である。
本明細書に提示されるプロトコルは、温度誘発放出薬物送達のためのLTSLsを準備するためにSHMを使用する。この方法では、マイクロ流体調製LTSLsをナノサイズ(100 nm)および動的光散乱(DLS)によって均一(分散度<0.2)にすることを確認しました。さらに、LTSL脂質二重層の完全性の検証として、膜貫通アンモニウム硫酸勾配法(遠隔負荷とも呼ばれる)17を用いてDOXを封入した。DOXのリモートローディングでは、リポソームが高いカプセル化効率(EE)を達成するためにpH勾配を維持する必要があり、これはそのままの脂質二重層なしで起こる可能性は低い。この提示された方法では、典型的なマイクロ流体リポソーム調製プロトコルとは異なって、エタノールを除去して遠隔ローディング能力を可能にするために、アニーリングステップが必要である。すなわち、脂質二重層の完全性を回復する。
前述のように、親水性および疎水性ペイロードは、LTSLsの形成中にペイロードを同時にカプセル化するための初期溶液にも導入することができる。概念実証として、有望な光熱剤でもあるFDA承認の近赤外蛍光色素であるインドシアニングリーン(ICG)が最初の脂質混合物に導入され、LTSLsに共装することに成功しました。808 nmレーザーはDOX/ICG搭載LTSLsを照射し、5分以内にDOXの光熱加熱誘発バースト放出を誘発するのに使用される。
すべての機器と材料は、市販され、すぐに使用でき、カスタマイズの必要はありません。LTSLを処方するためのすべてのパラメータが最適化されているので、このプロトコルに従って、マイクロ流体の予備知識を持たない研究者は、熱感知薬送達システムの基礎となるLTSLsを準備することもできます。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC)</td><td>リポイド</td><td>PC 16:0/16:0(DPPC)</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000](DSPE-PEG2000)</td><td>リポイド</td><td>PE 18:0/18:0-PEG 2000 (MPEG 2000-DSPE)</td><td></td></tr><tr><td>1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(MSPC)</td><td>アバンティポーラーリピッド</td><td>855775P-500MG</td><td>Sigma-Adrichによって配布されました。Lyso 16:0 PC (14:0/18:0 PC と混同しないでください、これは MSPC とも呼ばれます)</td></tr><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td></td></tr><tr><td>アダプター、1/4 インチ-28UNF</td><td>IDEX ヘルス &サイエンス</td><td>P-624</td>には<td>2ユニットが必要です。インレット</td></tr><tr><td>アダプター、ユニオンアセンブリ、1/4 "-28UNF</td><td>IDEXヘルス&用サイエンス</td><td>P-630</td>には<td>2ユニットが必要です。(1ユニットにはナット2個とフェルール2個が含まれています)</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム ((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31119-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>Bijou vial</td><td>VWR</td><td>216-0980</td><td>7 mL、透明、ポリスチレンバイアル</td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC801008</td><td>10 kDa MWCO、Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ヘレウス メガフュージ 8R</td><td>HIGHConic III 固定角ローター付き</td></tr><tr><td>キュベット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11602609</td><td>ディスポーザブルポリスチレンキュベット、少量、DLS測定用</td></tr><tr><td>透析キット - Pur-A-Lyzer Maxi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURX12015-1KT</td><td>12-14 kDa MWCO</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>34943-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>DLS 機器</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zetasizer Nano ZS90</td><td></td></tr><tr><td>ドキソルビシン塩酸塩(ドックス)</td><td>アポロサイエンティフィック</td><td>BID0120</td><td></td></tr><tr><td>DSC機器</td><td>TA機器</td><td>TA Q200 DSC</td><td></td></tr><tr><td>DSC Tzero密閉蓋</td><td>TA機器</td><td>901684.901</td><td>DSC測定用</td></tr><tr><td>DSC Tzeroパン</td><td>TA機器</td><td>901683.901</td><td>DSC測定用</td></tr><tr><td>DSCゼロサンプルプレスキット</td><td>TA機器</td><td>901600.901</td><td>DSC測定用</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td>絶対、&ge;99.8%</td></tr><tr><td>FC-808 ファイバー結合レーザー システム</td><td>CNI Optoelectronics Tech</td><td>FC-808-8W-181315</td><td>FOC-01-B ファイバー コリメータが含まれています。</td></tr><tr><td>フェルール、1/4 "-28UNF〜1/16" OD</td><td>IDEX健康&Science</td><td>P-200</td><td>出口用</td></tr><tr><td>光ファイバー温度プローブ</td><td>Osensa</td><td>PRB-G40</td><td></td></tr><tr><td>ガラス 千鳥状ヘリンボーン マイクロミキサー (SHM)</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>ヘリンボーン ミキサー - ガラスチップ</td><td></td></tr><tr><td>加熱テープ</td><td>オメガ</td><td>DHT052020LD</td> 「<td>HTC」や「SRTシリーズ」などの他のシリンジヒーターと交換して、加熱を遅くすることができます。240Vモデルに必要な3ピンプラグへの手動配線</td></tr><tr><td>Indocyanine Green</td><td>Adooq</td><td>A10473-100</td><td>Bioquote Limited(英国)が配布</td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ、5 mL</td><td>VWR</td><td>613-2043</td><td>Hanke Sass Wolf SOFT-JECT 3ピースシリンジ、外径12.45 mm</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td>485 nm(エキシケーション)および590 nm(エミッション)フィルター搭載</td></tr><tr><td>マイクロプレート、96ウェル、ブラック、フラットボトム</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>611F96BK</td><td>マイクロプレートリーダーでの蛍光測定用</td></tr><tr><td>マイクロプレート、96ウェル、透明、平底</td><td>グルニエ</td><td>655101</td><td>吸光度測定用マイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>ナット、1/4 "-28UNF〜1/16" OD</td><td>IDEX Health &科学</td><td>P-245</td><td></td></tr><tr><td>アラジン用ネットワークケーブル、7フィート</td><td>ワールド精密機器</td><td>NE-PC7</td><td>オプション: シリンジポンプは手動で操作できます</td></tr><tr><td>ポンプ制御ソフトウェア - 2 ワールド精密機器用 SyringePumpPro ソフトウェアライセンス</td><td></td><td>SYRINGE-PUMP-PRO-02</td><td>オプション: シリンジポンプは手動で操作できます</td></tr><tr><td>アラジン用ポンプネットワークケーブル、7フィート</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>NE-NET7</td><td>オプション:シリンジポンプは手動で操作可能</td></tr><tr><td>サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム</td><td>GEライフサイエンス</td><td>17085101</td><td>PD-10 脱塩カラムのセファデックスG-25樹脂</td></tr> 塩化<tr><td>ナトリウム(NaCl)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ&ケーブル (DUAL-PUMP-NE-1000)</td><td>ワールド精密機器</td><td>ALADDIN2-220/AL1000-220</td><td></td></tr><tr><td>サーモスタット温度調節器</td><td>インクバード</td><td>ITC-308</td><td>他のシリンジヒーターキット/サーモスタットと交換可能</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>チューブ、ETFE (1/16" OD)</td><td>IDEX Health &Science</td><td>1516</td><td></td></tr><tr><td>USB から RS-232 へのコンバーター</td><td>World Precision Instruments</td><td>CBL-USB-232</td><td>オプション: RS-232 ポートのないコンピューター用</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Grant Instruments Ltd.</td><td>JBノヴァ12</td><td></td></tr></tbody></table>

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

提示されたプロトコルは、ドキソルビシン(DOX)などの化学療法薬をロードすることができる低温感受性リポソーム(LTSLs)の高スループット連続調製を可能にする。これを達成するために、エタノール性脂質混合物および硫酸アンモニウム溶液を、ずらしたヘリンボーンマイクロミキサー(SHM)マイクロ流体装置に注入する。この溶液は、SHMによって迅速に混合され、リポソームの自己集合体に均質な溶媒環境を提供する。収集されたリポソームは、まずアニールされ、次いで透析して残留エタノールを除去する。サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、外部溶液のバッファー交換により硫酸アンモニウムpH勾配を確立します。その後、DOXは高いカプセル化効率(>80%)でリポソームに遠隔負荷されます。得られたリポソームは、Z平均直径100nmのサイズが均一である。それらは穏やかな温熱(42 °C)の存在の封入されたDOXの温度誘発の破裂解放が可能である。また、近赤外線レーザートリガDOX放出のために、インドシアニングリーン(ICG)をリポソームに共装することもできる。マイクロ流体アプローチにより、高スループット、再現性、拡張性に優れたLTSLの準備が可能になります。

マイクロ流体によるLTSLsの調製には、DPPC/MSPC/DSPE-PEG 2000(80/10/10、モル比;)LTSL10)。図7A(左)は、ステップ2.9から、透明で非粘性の液体として、そのまま調製したLTSL10の外観を示す。LTSL10製剤は、LTSL4(DPPC/MSPC/DSPE-PEG 2000、86/10/4、モル比)から開発され、サンプル中に閉じ込められた大量の気泡によって示されるように、ゲル状の粘性サンプルを形成します(図7A;右)。
LTSL10のDLS測定(図7B、赤色)は、LTSL10のZ平均直径および...

このプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体装置を用いて、熱感知リポソームを調製するための最適化されたパラメータを提示する。また、リポソームへのドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封、および制御/誘発薬物放出のためのドキソルビシンの光熱誘発放出も可能になる。

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

マイクロ流体は、調整可能なナノ粒子サイズのリポソームを調製するための新たな技術であり、再現性とスケーラビリティが高い。このプロトコルは、ドキソルビシンなどの化学療法薬と、インドシアニングリーンなどの蛍光色素と共に負荷を与える低温感受性リポソームの出力を通じて連続的な高い生産を可能にする。細胞製剤は、主に、脂質膜水和および押出などのトップダウンアプローチを使用する。臨床応用のための大きく、再生可能なバッチを準備することは挑戦的なままである。マイクロ流体の主な利点は、連続的かつ自動化された方法で動作しながら、空間と時間の制御性の高い小さな液体体積を処理する能力です。カルビン・チョンとの手順を実証することは、私の研究室の博士研究員である広龍馬とアマリア・ルイスです。シリンジポンプを組み立てるには、ポンプ間ネットワークケーブルを使用して、セカンダリシリンジポンプのコンピュータポートをマスターシリンジポンプのネットワークポートに接続します。PC を使用してネットワーク ケーブルをポンプで送り、マスター ポンプのコンピュータ ポートをコンピュータの RS-232 シリアル ポートに接続します。スタッグヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体デバイスを組み立てるには、ナットとフェルールを使用して、デバイスの各入口と出口にチューブを接続します。次に、2 番目のナットとフェルールとユニオン アセンブリを使用して、両方の入口のチューブの端子を女性のルアーに変換します。ポンプ制御ソフトウェアを設定するには、シリンジポンプの設定ボタンを使用して、マスターシリンジポンプとセカンダリシリンジポンプのアドレスをそれぞれAd:01とAd:02に割り当て、コンピュータ上でポンプ制御ソフトウェアを開きます。2つのシリンジポンプは自動的に検出され、次にビープ音が鳴ります。HSW Norm-Ject 5cc の直径を 12.45 ミリメートルに割り当てるには、12.45 を選択します。ポンプ1の場合は毎分0.25ミリリットル、ポンプ2の場合は毎分0.75ミリリットルにレートを設定します。5 ミリリットルを超える任意の値にボリュームを設定し、両方のポンプの注入モードを選択します。次に、[設定] をクリックして設定を確定します。LTSL10またはLTSL10 ICG脂質混合物を調製するには、1つの5ミリリットルのルアーロックシリンジを使用して、脂質混合物の1ミリリットルを引き出し、別の5ミリリットルのルアーロックシリンジを使用して、少なくとも3ミリリットルの硫酸アンモニウム溶液を引き出します。シリンジのバレルフランジをポンプのシリンジリテーナーにスライドさせ、装填されたシリンジを直立した位置にシリンジポンプに取り付け、シリンジのプランジャーフランジをポンプのプッシャーブロックに取り付け、加熱テープと温度プローブの反対側を、脂質溶液を含むシリンジの周りのサーモスタットで包みます。加熱テープの端部を水溶液を含むシリンジに包み、脂質混合物を含むシリンジをエタノール入口に接続し、硫酸アンモニウム溶液を含むシリンジを水性入口に接続します。必要に応じてシリンジから気泡を取り除くためにプランジャーの位置を調整し、注射器の温度が約51度に達するまで10秒間隔で加熱テープを差し抜きます。サーモスタットが適切な温度を示している場合は、ポンプ制御ソフトウェアですべてを実行してシリンジポンプを実行し、流体の流れに気泡や漏れが含まれずであることを確認します。リポソームサンプルをバイアルに集め、いずれかの注射器がほとんど空のときに注入を一時停止または停止します。収集したリポソーム溶液を摂氏60度水浴で1〜1/2時間アニールしてから、37°Cで少なくとも4時間、240ミリモル硫酸アンモニウムの1リットルに対して透析用透析用の透析管に溶液を移した。その後、精製リポソームを摂氏4度で保存します。膜貫通pH勾配によるリポソームの遠隔ローディングの場合、HBSの25ミリリットルをサイズ排除クロマトグラフィーカラムの上部にロードし、すべての溶離体がカラムを流れるようにします。透析したリポソームを1ミリリットルのカラムに積み込みます。すべての脂質溶液がカラムを通過したら、1.5ミリリットルのフレッシュHBSをカラムに加えます。すべてのバッファーがカラムを通過したら、3 ミリリットルのフレッシュ HBS をカラムに追加し、溶出液を収集します。次に、BIJUバイアル内の1:20 DOX:リン脂質モル比を1ミリリットルのバッファー交換リポソーム溶液に添加し、バイジュバイアルで37°Cの水浴にバイアルを1〜1/2時間入れます。ロード後、ちょうど実証したようにサイズ排除クロマトグラフィーによってリポソームを精製する。レーザー加熱誘発リポソーム内容物のトリガー放出については、水浴を摂氏37度に設定します。温度が安定したら、クリアな96ウェルプレートの各ウェルにDOXロードリポソームの200マイクロリットルを追加し、底を水に沈めた水浴にプレートを置きます。次に、レーザーシステム電流を2.27アンペアに設定し、レーザーシステムコリメーターを96ウェルプレートの表面の上に垂直に5センチメートル配置します。レーザーのスイッチを入れ、光ファイバー温度プローブを使用して1分間に1回温度を監視します。5分と10分で、10マイクロリットルのDOXが透明な96ウェルプレートの各ウェルからリポソームをロードし、190マイクロリットルのHBSを黒い96ウェルプレートの3つの個々の井戸に加えた。完全な薬物放出を評価するには、170マイクロリットルのHBSと20マイクロリットルのHBSと20マイクロリットルの10マイクロリットルを黒い96ウェルプレートの3つの個々のウェルに混ぜ合わせます。次に、プレートリーダー上のDOX蛍光強度を測定します。LTSL4のマイクロ流体生産は、多数の閉じ込められた気泡によって示されるゲル状粘性溶液をもたらし、LTSL10の調製は透明な非粘性液体の形成をもたらす。51°Cで調製したLTSL10の動的散乱測定は、実験の成功を示す予想されるZ平均直径および分散性を示す。しかし、LTSL10を摂氏20度で調製すると、より大きく、より分散したリポソームが得られ、最適でない製品が得られます。従来の押出による脂質膜水和法により調製されたLTSLは、50〜80%のDOXカプセル化効率をアニール処理で示し、マイクロ流体によって調製されたLTSL10は、DOXのリモートローディングの成功および膜貫通pH勾配の存在を示す平均85%の平均に対するDOXカプセル化効率の有意な増加をもたらす。LTSL10のDOX放出プロファイルは温度感受性であると判断された。LTSL10は、摂氏42.6度でピークを迎える摂氏41.6度の発症を伴う比較的広い相転移を有する。ICG負荷の効率は、初期ICG濃度およびサンプルのサイズおよび分散度に依存する。また、近赤外レーザーによるLTSL10 ICG照射は、DOXの放出を引き起こす光熱加熱を誘導する。この手順を試みる場合、液体の混合、したがってリポソームの形成が再現性を保つように安定した流体流れを確保することが重要である。リポソームアニールおよび透析は、高い積載量の安定したリポソーム製剤を確保するための2つの重要なステップである。インビボ検査は、LTSL10の生体分布、薬物放出、および抗癌活性を評価するために行うこともできる。当社のプロトコルは、薬物送達用途のためのコレステロールを含まないリゾ脂質含有熱感受性リポソームのマイクロ流体生産に成功するために使用することができます。

microfluidic-production-lysolipid-containing-temperature-sensitive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルは、同質性の高いサブミクロンサイズの脂質小胞を調製するための押出法を説明します。このメソッドは、リポソーム調製のための制御された窒素の流量と圧力制御システムを使用しています。脂質の準備...

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

定義されている物の巨大リポソームに機能的な膜タンパク質を再構成すると、パッチクランプ電気生理学と組み合わせた強力なアプローチである。しかし、従来の巨大リポソーム生産は、タンパク質の安定性と互換性がないかもしれません。私たちは純粋な脂質やイオンチャネルを含む小さなリポソームから巨大リポソームを製造するためのプロトコルを記述します。...

イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

私たちは、保存可能な、可搬型の脂質二重層形成システムを実証します。凍結した膜前駆体を周囲温度にしたときに脂質二重膜は、80％以上の成功率で1時間以内に形成することができます。このシステムは、イオンチャンネルに関連した面倒なプロセスと専門知識を軽減します。...

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

単一鎖両親媒性分子を含むリポソーム、特に脂肪酸、一本鎖両親媒性分子のユニークな化学的性質によるこれらの含まれている diacylphospholipids...

準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

固相担、タンパク質-無料、ダブル リン脂質二重膜 (DLBM) 複雑で動的な脂質ナノチューブ ネットワークに変換することができます、小胞体の 2 D のボトムアップ...

自発的な形成と小胞体のボトムアップ モデル人工脂質ナノチューブ ネットワークの転位

このプロトコルは、リポソームの作製と、蛍光顕微鏡を用いて表面上に固定化し、個々に画像化する方法について説明します。これにより、集団の単一リポソーム間のサイズおよび組成不均一性の定量が可能になる。...

個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ

このプロトコルは、小麦無細胞系およびリポソームを用いた二重層透析法による高品質のプロテオリポソームの効率的な無細胞生産法を記載する。この方法は、膜タンパク質の機能解析、創薬標的のスクリーニング、および抗体開発に適した手段を提供します。...

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

マイクロ流体ベースの脂質ナノ粒子(LNP)生産方法は、RNA送達を含む薬物送達システム(DDS)において注目されている。このプロトコルは、iLiNPという名前の当社独自のマイクロ流体デバイスを使用した製造、LNP(siRNA搭載LNP)生産、およびLNP評価プロセスを記述しています。...

マイクロ流体デバイスを用いたsiRNA搭載脂質ナノ粒子の製造

本プロトコルは、生体適合性リポソームを生成するためのマイクロ流体技術であるオクタノール支援リポソームアセンブリ(OLA)を記載する。OLAは、効率的なカプセル化を備えた単分散のミクロンサイズのリポソームを生成し、即時のオンチップ実験を可能にします。このプロトコルは、合成生物学および合成細胞研究に特に適していると期待されています。...

バイオエンジニアリングのためのオンチップオクタノール支援リポソームアセンブリ

学ぶマイクロ流体デバイスを用いたリゾ脂質含有温度感受性リポソームの作製法。ドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封入と光熱トリガー放出による制御薬物送達を実現します。

リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

さらに動画を探す