リゾ脂質含有温度感受性リポソームのマイクロ流体生産

このプロトコルは、千鳥ヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体装置を用いて、熱感知リポソームを調製するための最適化されたパラメータを提示する。また、リポソームへのドキソルビシンとインドシアニングリーンの共封、および制御/誘発薬物放出のためのドキソルビシンの光熱誘発放出も可能になる。

マイクロ流体は、調整可能なナノ粒子サイズのリポソームを調製するための新たな技術であり、再現性とスケーラビリティが高い。このプロトコルは、ドキソルビシンなどの化学療法薬と、インドシアニングリーンなどの蛍光色素と共に負荷を与える低温感受性リポソームの出力を通じて連続的な高い生産を可能にする。細胞製剤は、主に、脂質膜水和および押出などのトップダウンアプローチを使用する。

臨床応用のための大きく、再生可能なバッチを準備することは挑戦的なままである。マイクロ流体の主な利点は、連続的かつ自動化された方法で動作しながら、空間と時間の制御性の高い小さな液体体積を処理する能力です。カルビン・チョンとの手順を実証することは、私の研究室の博士研究員である広龍馬とアマリア・ルイスです。

シリンジポンプを組み立てるには、ポンプ間ネットワークケーブルを使用して、セカンダリシリンジポンプのコンピュータポートをマスターシリンジポンプのネットワークポートに接続します。PC を使用してネットワーク ケーブルをポンプで送り、マスター ポンプのコンピュータ ポートをコンピュータの RS-232 シリアル ポートに接続します。スタッグヘリンボーンマイクロミキサーマイクロ流体デバイスを組み立てるには、ナットとフェルールを使用して、デバイスの各入口と出口にチューブを接続します。

次に、2 番目のナットとフェルールとユニオン アセンブリを使用して、両方の入口のチューブの端子を女性のルアーに変換します。ポンプ制御ソフトウェアを設定するには、シリンジポンプの設定ボタンを使用して、マスターシリンジポンプとセカンダリシリンジポンプのアドレスをそれぞれAd:01とAd:02に割り当て、コンピュータ上でポンプ制御ソフトウェアを開きます。2つのシリンジポンプは自動的に検出され、次にビープ音が鳴ります。

HSW Norm-Ject 5cc の直径を 12.45 ミリメートルに割り当てるには、12.45 を選択します。ポンプ1の場合は毎分0.25ミリリットル、ポンプ2の場合は毎分0.75ミリリットルにレートを設定します。5 ミリリットルを超える任意の値にボリュームを設定し、両方のポンプの注入モードを選択します。

次に、[設定] をクリックして設定を確定します。LTSL10またはLTSL10 ICG脂質混合物を調製するには、1つの5ミリリットルのルアーロックシリンジを使用して、脂質混合物の1ミリリットルを引き出し、別の5ミリリットルのルアーロックシリンジを使用して、少なくとも3ミリリットルの硫酸アンモニウム溶液を引き出します。シリンジのバレルフランジをポンプのシリンジリテーナーにスライドさせ、装填されたシリンジを直立した位置にシリンジポンプに取り付け、シリンジのプランジャーフランジをポンプのプッシャーブロックに取り付け、加熱テープと温度プローブの反対側を、脂質溶液を含むシリンジの周りのサーモスタットで包みます。

加熱テープの端部を水溶液を含むシリンジに包み、脂質混合物を含むシリンジをエタノール入口に接続し、硫酸アンモニウム溶液を含むシリンジを水性入口に接続します。必要に応じてシリンジから気泡を取り除くためにプランジャーの位置を調整し、注射器の温度が約51度に達するまで10秒間隔で加熱テープを差し抜きます。サーモスタットが適切な温度を示している場合は、ポンプ制御ソフトウェアですべてを実行してシリンジポンプを実行し、流体の流れに気泡や漏れが含まれずであることを確認します。

リポソームサンプルをバイアルに集め、いずれかの注射器がほとんど空のときに注入を一時停止または停止します。収集したリポソーム溶液を摂氏60度水浴で1〜1/2時間アニールしてから、37°Cで少なくとも4時間、240ミリモル硫酸アンモニウムの1リットルに対して透析用透析用の透析管に溶液を移した。その後、精製リポソームを摂氏4度で保存します。

膜貫通pH勾配によるリポソームの遠隔ローディングの場合、HBSの25ミリリットルをサイズ排除クロマトグラフィーカラムの上部にロードし、すべての溶離体がカラムを流れるようにします。透析したリポソームを1ミリリットルのカラムに積み込みます。すべての脂質溶液がカラムを通過したら、1.5ミリリットルのフレッシュHBSをカラムに加えます。

すべてのバッファーがカラムを通過したら、3 ミリリットルのフレッシュ HBS をカラムに追加し、溶出液を収集します。次に、BIJUバイアル内の1:20 DOX:リン脂質モル比を1ミリリットルのバッファー交換リポソーム溶液に添加し、バイジュバイアルで37°Cの水浴にバイアルを1〜1/2時間入れます。ロード後、ちょうど実証したようにサイズ排除クロマトグラフィーによってリポソームを精製する。

レーザー加熱誘発リポソーム内容物のトリガー放出については、水浴を摂氏37度に設定します。温度が安定したら、クリアな96ウェルプレートの各ウェルにDOXロードリポソームの200マイクロリットルを追加し、底を水に沈めた水浴にプレートを置きます。次に、レーザーシステム電流を2.27アンペアに設定し、レーザーシステムコリメーターを96ウェルプレートの表面の上に垂直に5センチメートル配置します。

レーザーのスイッチを入れ、光ファイバー温度プローブを使用して1分間に1回温度を監視します。5分と10分で、10マイクロリットルのDOXが透明な96ウェルプレートの各ウェルからリポソームをロードし、190マイクロリットルのHBSを黒い96ウェルプレートの3つの個々の井戸に加えた。完全な薬物放出を評価するには、170マイクロリットルのHBSと20マイクロリットルのHBSと20マイクロリットルの10マイクロリットルを黒い96ウェルプレートの3つの個々のウェルに混ぜ合わせます。

次に、プレートリーダー上のDOX蛍光強度を測定します。LTSL4のマイクロ流体生産は、多数の閉じ込められた気泡によって示されるゲル状粘性溶液をもたらし、LTSL10の調製は透明な非粘性液体の形成をもたらす。51°Cで調製したLTSL10の動的散乱測定は、実験の成功を示す予想されるZ平均直径および分散性を示す。

しかし、LTSL10を摂氏20度で調製すると、より大きく、より分散したリポソームが得られ、最適でない製品が得られます。従来の押出による脂質膜水和法により調製されたLTSLは、50〜80%のDOXカプセル化効率をアニール処理で示し、マイクロ流体によって調製されたLTSL10は、DOXのリモートローディングの成功および膜貫通pH勾配の存在を示す平均85%の平均に対するDOXカプセル化効率の有意な増加をもたらす。LTSL10のDOX放出プロファイルは温度感受性であると判断された。

LTSL10は、摂氏42.6度でピークを迎える摂氏41.6度の発症を伴う比較的広い相転移を有する。ICG負荷の効率は、初期ICG濃度およびサンプルのサイズおよび分散度に依存する。また、近赤外レーザーによるLTSL10 ICG照射は、DOXの放出を引き起こす光熱加熱を誘導する。

この手順を試みる場合、液体の混合、したがってリポソームの形成が再現性を保つように安定した流体流れを確保することが重要である。リポソームアニールおよび透析は、高い積載量の安定したリポソーム製剤を確保するための2つの重要なステップである。インビボ検査は、LTSL10の生体分布、薬物放出、および抗癌活性を評価するために行うこともできる。

当社のプロトコルは、薬物送達用途のためのコレステロールを含まないリゾ脂質含有熱感受性リポソームのマイクロ流体生産に成功するために使用することができます。