Name: 細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶTRAP法によるシロイヌナズナの細胞型特異的遺伝子発現解析。GFP標識リボソームを用いてポリソームRNAを精製し、側根形成における細胞間通信を解明する強力な技術です。

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このプロジェクトの初期段階で、チューリッヒ遺伝ダイバーシティセンターのジャン=クロード・ウォルサーに重要な専門家のアドバイスをしてくれたことに感謝します。フェルメール研究所での研究は、スイス国立科学財団(SNSF)からSNF教授助成(PP00P3_157524)とR'EQUIP機器助成金(316030_164086)によって支援されました。

著者らは開示するものは何もない。

RPL18ローカリゼーションパターンの検証 TRAP実験のデータの誤解釈を避けるために重要なのは、タグ付きリボソームサブユニットの適切な発現パターンです。従って、RPL18へのエピトープタグとしてのGFPの組み込みは、所望の発現パターンの検証を非常に優雅に可能にし、連続して、同じ組織からポリソーム分画のプルダウンを可能にする。適切なプロモーターパターンを保証するためのより侵襲的なアプローチは、GUS染色を必要とするJiaoおよびMayerowitz 2010と、抗FLAG抗体58、59,59による免疫染色に依存するTianら 2019年に続く。
T-DNAトランスジェニックラインはサイレンシングを起こしやすくなり、シグナル強度が低下したり、発現する種子の割合が低下したりするため、各世代の局在パターンを確認することを強くお勧めします。構成に組み込まれたGFPタグを使用すると、これらの頻繁な制御は顕微鏡観察によって容易に行われる。...

次世代シーケンシング技術の応用の増加によって、発生生物学における空間分解能が増強される可能性があります。現代の研究は、単一細胞レベル,,1、2、3、42ではないにしても、特殊な細胞タイプに組織1を解剖することを目的としています。34この処理のために、過去 50 年間に多数の異なる方法が考案されています (図1A)5、6、,7,、8 、9、109、11、12、13、1414、15.
植物科学の多くのツールは、動物研究で開拓された技術の適応されています。これは、ここで詳しく紹介する方法には当てはまらない。2005年、タンパク質翻訳の強力な背景を備えたBailey-Serres Labは、その後の親和性精製のためにリボソームタンパク質の設計に着手しました。したがって、スクロース勾配を有する超遠心分離に基づく時間と労力を要するポリソームプロファイリングを回避することができ、1960年代17、18,18年以来リボソームの翻訳を評価するために使用された。この方法は、その後、翻訳リボソーム親和性精製(TRAP)16と呼ばれている。植物の翻訳研究に成功した後、Heimanらの動物19と他の人のためのTRAPを適応させた酵母20、ショウジョウバエ21、ゼノプス22およびゼブラフィッシュ23、24,24への応用を拡張した。
モデルシステムの遺伝子改変はTRAPの前提条件であり、その適用を遺伝的変換に適した種に限定しますが、この異議を、特別な関心を持ち、無傷の組織/器官25から分離することが非常に困難な細胞のサブセット(例えば、マウス脳内の高度に分岐した樹状細胞または感染した植物組織の真菌性催眠細胞)に同時に利用することができます。植物では、全ての細胞が、静水性骨格26の基礎となる細胞壁を介して所定の位置に保持される。このマトリックスから植物細胞を解放するために、科学者たちはレーザー捕捉マイクロディション(LCM)27を介して周囲の組織から細胞を物理的27に切断するか、または細胞壁28の酵素消化を行った。後者の細胞の中でも、いわゆるプロトプラストは、目的の集団が蛍光標識され、蛍光活性化細胞選別(FACS)7を介して分離することができる7。LCMは通常、試料を固定してワックスに埋め込む必要があり、最終的にはRNA29の品質が低下する。FACSベースの方法は高品質のRNAを生み出すが、プロプロトバテナのプロセス自体が遺伝子発現30の違いを導入し、改変された厚い二次細胞壁を有する組織は治療が困難であると悪名高い。さらに、植物における多くの発達過程は機械的に伝達される信号に依存すると仮定され、したがって細胞壁の完全性は最も重要である31。核のレベルで動作することによって細胞単離を回避するためのショートカットを使用する2つの方法は、蛍光活性化核選別(FANS)および特定の細胞タイプ(INTACT)でタグ付けされた核の単離である。TRAPのように、彼らは細胞型特異的プロモーターを使用して核をマークし、その後、並べ替えまたはプルダウンを介して濃縮され、それぞれ8,8、15。これらすべてのアプローチの主要な課題は、組織中の細胞のサブセットから十分なRNA材料を得るということです。TRAP は細胞RNAのほんの一部しか捕捉しなかね、サンプル収集は大きなボトルネックです。したがって、特に、低入力量から高品質のデータを生成するためには、機密性の高いライブラリ準備プロトコルが必要です。
その設立以来、TRAPはDNAマイクロアレイと組み合わせて使用されているか、または、シーケンシングコストが近年大幅に低下したため、RNA-seq1010、32、3332,33が使用されている。Sablokら34でレビューされた多数の研究の質問が既に解明されています。我々は、特定の細胞タイプを標的に異なるプロモーターを組み合わせる場合、この技術は非常に汎用性が高いため、今後数年間でより多くの報告が続くと確信しています。最終的には、これは誘導可能な方法でも行われ、多くの生物的および無生物的ストレス要因に対する植物の反応を調査することと組み合わされる可能性があります。さらに、安定したトランスジェニックラインが利用できないところでは、毛深い根発現系もトマトおよびメディカゴ35,36,36でTRAPを行うためにもうまく使用されている。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60919/60919fig1b.jpg"> 図1:リボソームアフィニティー精製(TRAP)の翻訳は、「オミックス」分析ポートフォリオを補完します。A.分析精度のレベルを上げると、単一細胞または細胞内の分解能まで、多くの方法またはそれらの組み合わせによって達成できます。このスキームは、植物および動物分野で現在利用可能なツールの概要を示します。細胞分解能での組織の収集は、LCMやFACSのようなプロトコルによって達成され、標準のトランスクリプトームまたはポリソームプロファイリング/翻訳分析に結合されます。TRAPとINTACTは、エピトープタグに基づいているため、組織捕捉とRNAの分離の両方を統合します。しかしながら、INTACTサンプルは細胞核のみを構成し、したがって、トランスクリプトーム分析の特別な場合を構成する。小さなウサギのアイコンは、動物分野で新たに開発された方法を示しています:SLAM-ITseqとFlura-seqは、寛容な酵素を発現する細胞内の改変ウラシル塩基を持つ新生RNAの代謝ターゲッティングに依存していますが、Slide-seqは、細胞範囲内の位置情報を提供するDNAバーコード付きコーティングガラススライドを使用しています。特定の細胞内区画で RNA をサンプリングするために、APEX-seq では近接標識アプローチが続きます。特に、分解能の向上にはトランスジェニック材料(アスタリスク)の生成が必要なことが多く、モデル種に対してこれらの方法が主に使用される。TRAPは、細胞壁(CW)やメカニックシグナリング、およびCWマトリックスから放出することが困難な細胞種を含む植物科学研究に特に適しています。B. TRAP手順の詳細なウェットラボステップ:異なる細胞タイプ(例えば根内胚葉)でGFPタグ付きリボソームタンパク質を発現する苗は、7日間ペトリ皿で栽培され、根材料はスナップ凍結によって収穫される。全RNA制御サンプルは、遠心分離によって破片をペレットする前に、均質化された粗抽出物から収集されます。磁性抗GFPビーズをクリアした抽出物に添加して、免疫沈降を行います。インキュベートと3つの洗浄工程の後、ポリソーム関連RNA(TRAP/ポリソームRNA)はフェノール-クロロホルム抽出を介して直接得られます。LCM:レーザーキャプチャマイクロディスセクション、FACS/ファン:蛍光活性化細胞/核選別、 APEX-seq:工学的アスコルビンペルオキシダーゼに基づく方法、INTACT:特定の細胞型にタグ付けされた核の単離、SLAM-ITseq:チオール(SH)結合アルキル化組織中のRNAの代謝シーケンシングに対する、Flura-seq:フルオロシル標識RNAシーケンシング(フルオロシル標識RNAシーケンシング Biorender.com)を<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60919/60919fig1blarge.jpg" target="_blank">クリックしてください。</a>
この記事の目的は、TRAP メソッドの詳細な説明を提供し、重要な手順を強調し、可能なライブラリ準備方法のガイダンスを提供することです。
一般的なTRAP実験は、基本的に次のステップで構成されます(図1Bも参照):(1)リボソームタグ構造のクローニング、トランスジェニックラインの生産と選択、種子の成長と増量、ストレス適用/処理(オプション)および組織収穫を含む植物材料の調製。(2)粗抽出物の組織均質化および除去、ビーズ洗浄および免疫精製、および洗浄工程を含む免疫精製;(3) RNA抽出および品質評価(4)図書館の準備。
シロイヌナズナルートは、モデルプラント37,38として導入されて以来、38植物開発を研究するモデルシステムとなっています。ここでは、TRAPの適用は植物側面根開発の文脈で紹介される。植物では、全体の根系の蓄積は、このプログラムの実行に依存し、したがって、生物の生存のために非常に重要である39.シロイヌナズナシスでは、横根はxylem血管の隣に存在するペリサイクル組織に由来し、したがってxylem極ペリサイクル(XPP;図2Cを参照)40と呼ばれます。根の奥深くに位置する一部のXPP細胞は、創始者の細胞の同一性を獲得し、局所ホルモンの引き金に基づいて、反クリン41を腫脹して分裂させることによって増殖し始める。しかし、硬質細胞壁マトリックスの存在により、このプロセスは周囲の組織に機械的なストレスを与えます。特に、上方の内皮は、根根成長軸42、43、44,43,の邪魔であるように影響を受ける。実際、新たに形成されたプリモジウムは、上層の内皮細胞(図2C2)を介して成長する必要がありますが、皮質および表皮細胞は、プリモジウムが最終的に45、46,46を出現させるために脇に押し出されるだけです。私たちの研究室での最近の研究は、内皮が積極的にペリサイクルの増殖に対応するために貢献していることを示しています。内皮ホルモンシグナル伝達の標的遮断は、XPP細胞47における非常に最初の分裂を阻害するのに十分である。したがって、ペリサイクル-子宮内皮通信は、シロイヌナズナの横根開発のための非常に初期のチェックポイントを構成する。しかし、このクロストークがどのように行われるかは分かっていません。この謎を解明するために、XPP細胞と内皮細胞を標的とするTRAP-seqアプローチを選択しました。横根プログラムの細胞を濃縮するために、オーキシンアナログ(1-ナフタレ酢酸、NAA)48を外因的に適用することによってホルモントリガーを模倣し、同時に側根形成の48初期段階を時間的に解決することを可能にした。

<table><tbody><tr><td>滅菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剤、13%</td><td>Sigma</td><td>71696</td><td></td></tr><tr><td>ビー</td><td>カーVWR</td><td>214-1172/74/75</td><td></td></tr><tr><td>磁器プレート付きデシケーター(DURAN)</td><td>Sigma/Merck</td><td>Z317454-1EA/Z317594-1EA</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, p.a.</td><td>ハネウェル社</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl、37%</td><td>Roth</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Plate Growth + Harvesting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS salts、基礎塩混合物、細胞培養用 MES バッファー</td><td>Duchefa</td><td>M0254</td><td></td></tr><tr><td>寒天植物</td>を含む <td>Applichem/Panreac</td><td>A2111.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ルビス スイス</td><td>5-SA モデル</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>フルカ</td><td>60370</td><td></td></tr><tr><td>マイクロポア/サージカル テープ</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>NAA</td><td>デュチェファ</td><td>N0903</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ 120x120 mm</td><td>グライナー バイオワン</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>VWR/Swann-Morton</td><td>233-5454</td><td></td></tr>組織<tr><td>、中性、2層、</td><td></td><td></td><td>お好みのサプライヤー</td></tr> <tr><td>Immunoprecipitation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-ビーズ:gtma-100 GFP-Trap_MA</td><td>Chromotek</td><td>例:gtma-100</td><td></td></tr><tr><td>Brij-35</td><td>Sigma</td><td>P1254-500G</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管(遠心分離機)</td><td>ベックマン・コールター</td><td>357001</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Applichem</td><td>C0378-25G</td><td></td></tr><tr><td>綿手袋</td><td>VWR</td><td>113-7355</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド、HPLC グレード</td><td>シグマ</td><td>01810-1G</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>VWR</td><td>E174</td> 納期<td>が長い可能性があります</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー DUALL 23</td><td>KONTES GLASS CO (via VWR)</td><td>SCERSP885450-0023 (セット)</td><td>SCERSP885451-0023 乳棒のみ - SCERSP885452-0023 シリンダーのみ; 長い納期</td></tr><tr><td>Igepal CA-360</td><td>Sigma</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 hexahydrat</td><td>Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>乳鉢と乳棒</td><td>VWR</td><td>470148-960 & 470019-978</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10 837 091 001</td><td></td></tr><tr><td>ポリオキシエチレン-(10)-トリデシルエーテル/PTE</td><td>Sigma</td><td>P2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>Roth</td><td>T143.3</td><td></td></tr><tr><td>RNAZap</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9780/AM9782</td><td>洗浄面用</td></tr><tr><td>Tris, >99.3%</td><td>ロス</td><td>AE15.3</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>フルーカ</td><td>T8787-250ml</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン20</td><td>シグマ</td><td>P9416-100ml</td><td></td></tr><tr><td>RNA抽出</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol、p.a.</td><td>Sigma</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム、HPLC グレード</td><td>Scharlau</td><td>CL02181000</td><td></td></tr><tr><td>EtOH, p.a.</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td></td></tr><tr><td>低保持マイクロ遠心チューブ、1.5 ml</td><td>Eppendorf/Sigma</td><td>Z666548-250EA</td><td>LoBind</td></tr><tr><td>RNase-free DNase set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MiniElute クリーンアップキット</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Library 調製</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 mLチューブ磁気セパレーター</td><td>アブラックス</td><td>PN 472250</td><td></td></tr><tr><td>AMPure ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>インデックスキットA</td><td>イルミナ</td><td>FC-131-2001</td><td></td>インデックスキットD イルミナ FC-131-2004</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ネオジム磁石</td><td>アマゾン/その他</td><td>6 x 1.5 mm 範囲: N42 (NdFeB)</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT キット</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024/1096</td><td><a href="https://emea.support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/nextera_xt_dna_kit/documentation.html" target="_blank">https://emea.support.illumina.com/</a</td></tr><tr><td>>PCR strips</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer v4 kit</td><td>Takara Bioscience</td><td>634892</td><td><a href="https://www.takarabio.com/products/next-generation-sequencing/rna-seq/smart-seq-v4-for-mrna-seq" target="_blank">https://www.takarabio.com/</a></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer</td><td>RNA/DNA品質管理専用機器</td></tr><tr><td>Tapestation</td><td>Agilent</td><td>4200 Tapestation Tapestation</td><td>RNA/DNA品質管理専用機器</td></tr><tr><td>フラグメントアナライザー</td><td>Agilent</td><td>5400 フラグメントアナライザーシステム</td><td>RNA/DNA品質管理専用機器(ハイスループット)</td></tr><tr><td>LabChip</td><td>PerkinElmer</td><td>LabChip GX Touch Nucleic Acid Analyzer</td><td>RNA/DNA品質管理専用機器(ハイスループット)</td></tr><tr><td>Qubit 4 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33239" target="_blank">Q33239</a></td><td>RNA/DNA濃度測定専用装置</td></tr><tr><td>qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GATA23</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: AGTGAGAATGAA AGAAGAGAAGGG; rev: GTGGCTGCGAAT AATATGAATACC</td></tr><tr><td>GH3.3</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: CAAACCAATCCT CCAAATGAC; rev: ACTTATCCGCAA CCCGACT</td></tr><tr><td>LBD29</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: TCTCCAACAACA GGTTGTGAAT; rev: AAGGAGCCTTAG TAGTGTCTCCA</td></tr><tr><td>UBC21</td><td>Microsynth</td><td></td><td>fwd: TGCGACTCAGGG AATCTTCT; rev: TCATCCTTTCTT AGGCATAGCG</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5270</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5038</td><td></td></tr><tr><td>miscellaneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 ml, Cellstar</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 ml, Cellstar</td><td>Greinerbio-one</td><td>210261</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ 1 ml</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ 10 & マイクロ;l</td><td>Axygen</td><td>TF-10-R-S</td><td></td></tr><tr><td>フィルター チップ 100 & マイクロ;l</td><td>Axygen</td><td>TF-100-R-S</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ 20 & マイクロ;l</td><td>Axygen</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ 200 & マイクロ;l</td><td>Axygen</td><td>TF-200-R-S</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ 1.5 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma</td><td>P4170-100MG</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシング会社</td><td>Novogene</td><td></td><td><a href="http://en.novogene.com" target="_blank">en.novogene.com</a></td></tr></tbody></table>

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(trap)の翻訳

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

本稿では、リボソーム親和精製(TRAP)法と連続して最適化された低入力ライブラリ調製を通じて、異なるシロイヌナナの根細胞型から翻訳データを取得するための実践的な指示を与える。
原料として、適切なプロモーターを用いることで、細胞型特異的な方法でGFPタグリボソームタンパク質RPL18を発現する植物ラインを採用しています。免疫精製とRNA抽出の前に、組織は凍結され、組織の完全性を維持し、同時に高い時間分解能で時系列研究を実行することができます。特に、細胞壁構造はそのまま残っており、これは、異なる細胞集団を単離するために組織をプロトパロントに依存する蛍光活性化細胞選別ベースのアプローチのような代替手順の大きな欠点である。さらに、レーザー捕捉マイクロ解剖ベースの技術のように組織固定は必要なく、高品質のRNAを得ることができます。
しかし、細胞の亜集団からのサンプリングと、ポリソーム関連RNAの単離のみがRNAの収量を著しく制限します。したがって、RNA-seqによるデータ取得を成功させるためには十分に感受性の高いライブラリ調製方法を適用する必要がある。
TRAPは、多くの発達プロセスが細胞壁関連および機械的シグナル伝達経路を伴うため、植物研究に理想的なツールを提供します。特定の細胞集団を標的とするプロモーターの使用は、臓器と単一細胞レベルの間のギャップを埋めており、その結果、解像度の低下や非常に高いコストに苦しんでいます。ここでは、トラップを適用して、横根形成における細胞細胞通信を研究する。

品質評価のために、上記の手順は、いくつかの中間ステップで調査する必要があります:プランタの発現パターン検証、分離された多ソームRNAの品質管理、および最終ライブラリの品質管理。既知のマーカー遺伝子を用いたqRT-PCRは、加えて、処置条件に対する応答を確認するか、または実験条件を微調整するために行うことができる。
GFP信号分布の共焦点解析 内皮およびXPP発現パターンの両方を確認するために、pELTP::GFP-RPL18およびpXPP::GFP-RPL18の同種線を共焦点顕微鏡で分析した。図2Aおよび図2Bは、細胞壁を輪郭を描くためにヨウ化プロピジウム(マゼンタ)で対抗されたGFP信号(緑...

リボソームアフィニティー精製(TRAP)を翻訳すると、臓器や組織の最小限の処理で開発プログラムを解剖する可能性があります。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識リボソームサブユニットを標的とした細胞から高品質のRNAを生成します。qRT-PCR や RNA-seq などのダウンストリーム解析ツールは、組織および細胞の種類特異的発現プロファイルを明らかにします。

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

TRAPを使用すると、細胞分解能での発達処理を調査することができます。細胞型特異的プロモーターを使用してタグ付きリボソームサブユニットを駆動し、そこからポリソームRNAを分離することができます。このプロトコルは高品質のRNAを生成しますが、非常に限られた量で、したがって、高品質のRNAライブラリを確実に生成するために超低入力に特化した方法が必要です。TRAPは、多くの発達プロセスが細胞壁関連および機械的シグナル伝達経路に依存しているため、植物研究に理想的なツールです。TRAPを用い、横根形成における細胞細胞通信を研究する。良質のRNAを得ることが予想ほど単純ではないことが判明したので、このステップバイステップのビデオ命令がTRAPの適用性を高め、この強力な技術を促進するのに役立つことを願っています。伝播されたホモ接合ラインを殺菌するために、12で12センチメートルの平方ペトリ皿に種子の300マイクロリットル未満を均等に広げ、60リットルの乾燥剤に皿を積み重ねる。一晩のガス滅菌後、種子を50ミリリットルの貯蔵チューブに集める前にガスを蒸発させます。めっきする前に、殺菌した種子を0.1%寒天で希釈し、1皿当たりのインビベッドシードミックスを1ミリリットル得る。シードミックスをプレートするには、正方形のペトリ皿の蓋を使用して、プレートごとに3列の種子を植えるラミネートテンプレートホルダーを作成し、空の寒天プレートをテンプレートホルダーに入れます。3列のプレートに1ミリリットルの種子を均等に分配します。そして、種子が乾燥するまで、層流の積み重ねに加工されたプレートを置きます。種子が寒天の表面にくっついてきたら、蓋を閉め、マイクロポアテープで各プレートを密封します。関心のある薬剤を用いたシロイヌナズナの根の外因性治療のために、1.5〜2センチメートル幅、長さ10センチメートルのティッシュペーパーを調製する。10マイクロモルNAAにティッシュペーパーを浸し、ピンセットを使用して根の各列にティッシュペーパーを塗布します。その後、気泡を軽く押し出し、余分な液体をプレートから空にしてから、プレートに時間でラベルを付けます。適切な実験エンドポイントで、鉗子を使用して根を取り外すことなく各プレートからティッシュペーパーストリップを慎重に取り除き、外科用ブレードを使用してシュートルート接合部に沿って1行につき1回、1回のストロークで切断します。ピンセットを使用して各行のルートに沿ってスワイプし、3つのバンドルでルートを収集します。そして、スナップ凍結のために、液体窒素で満たされた50ミリリットルのチューブに根を空にします。処理ごとにすべての根試料が採取されたら、チューブ蓋を使用して余分な液体窒素をデカントし、根がこぼれるのを防ぎます。そして、80°Cの貯蔵のために、Doer容器にチューブを置きます。組織研削および均質化の場合は、標準的なラボグローブの下に綿手袋を着用し、ポリソーム抽出バッファにPMSFを追加します。液体窒素を含むモルタルに組織サンプルを空にし、冷却された害虫を使用して、すべての材料が白い粉末として現れるまで慎重に組織を粉砕します。すべての組織が粉砕されたら、サンプルにポリソーム抽出バッファーの5ミリリットルを追加し、すぐにバッファーが凍結する前に粉末と凍結組織断片を混合します。混合物が移すことができるとすぐに、氷の上のガラスホモジナイザーにスラリーを空にし、モルタルと害虫をすすぐポリソーム抽出バッファーの追加の2ミリリットルを使用します。抽出物が均質になるまでスラリーを手動で粉砕します。次に、粗根エキスを氷上の50ミリリットル遠心分離管に注ぎ、次のサンプルを実例通りに処理します。RNAの総回収のために、各粗サンプルの200マイクロリットルのアリコートを、個々のクリーンで、事前に冷却された、標識されたマイクロ遠心分離管に移します。細胞壁、破片、大きなオルガネラを除去するには、サンプルを遠心分離し、上澄み物を新鮮で冷却済みの円錐形チューブにデカントして2番目の遠心分離を行います。チューブが回転している間、サンプルあたりの磁気GFPビーズのアリコート60マイクロリットルは、1.5ミリリットルのチューブに。そして、上清除去を容易にするために、磁気スタンドにチューブを置きます。次いで、1回の洗浄液1ミリリットルでビーズを2回洗浄し、サンプル当たり60マイクロリットルの洗浄バッファーでビーズを再懸濁します。遠心分離の直後に、クリアした上清をラベル付き15ミリリットルチューブにデカントし、各サンプルに60マイクロリットルの洗浄ビーズを加える。次に、すべてのサンプルを氷のバケツに水平に置き、揺れで2時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、氷上の磁気スタンドにビーズを集め、残りのポリソーム抽出バッファーにPMSFを加えます。上清を捨て、サンプルに約5ミリリットルのポリソーム抽出バッファーを加え、サンプル内のビーズを緩やかな傾きで再中断します。サンプルを氷の上のシェーカーで15分間揺らし、続いて磁石に新鮮な洗浄バッファーを入れた2回の洗浄を行います。最後の洗浄後、1ミリリットルの洗浄バッファーでサンプルを1.5ミリリットルのチューブに移します。そして、磁気スタンドにビーズをもう一度集めて、上清のすべてを取り除きます。次に、すべてのサンプルが処理されるまでチューブを氷の上に置きます。ラボ用品の再調整については、まず、すべての機器を化学廃棄物にリンスします。乳鉢、害虫、ホモジナイザーを石鹸で手洗いしてから、各器具を十分に洗い流します。次に、装置を熱安全容器に入れ、220°C以上で材料を一晩焼きます。リムとヒュームフード付きのオートクレーブトレイにチューブを置く前に、外気剤ですべての遠心管を洗剤できれいに磨きます。液体ジエチルパイロカーボネート1ミリリットルと脱イオン水溶液1リットルを3〜18時間チューブに注ぎます。次に、オートクレーブ内のチューブのトレイを殺菌する前に溶液を集めます。ここでは、GFP信号を有する代表的な植物を示す。ヨウ化プロピジウムでの逆染色は、細胞壁の輪郭を示す。線は、内皮の局在パターン、およびxylem極ペリサイクルに対応しています。ポリソームRNAから得られたこれらの代表的な測定では、ほとんどのサンプルは分解をほとんど示さなかったが、RNAの完全性の数は9から10までである。これらのグラフでは、正常に準備されたライブラリの痕跡を観察することができ、スケールダウンされた反応量にもかかわらず、手順の堅牢性を強調することができます。ゲノムスパンデータセットが作成される前に、パイロット実験からTRAP RNAを定量的なRTPCRでプローブし、治療の成功および/または実験条件、ならびに組織特異性を検証することができます。この分析では、3つのオーキシン応答性遺伝子の試験は、治療の2時間後に成功したホルモン誘導を確認した。シーケンシングデータから取り出した組織特異的マーカー遺伝子プロファイルは、細胞型特異性を確認した。RNAを扱うときは、良い練習のアドバイスに従ってください。滅菌ベンチで作業し、RNA除去溶液で機器を洗浄し、手袋を着用し、汚染されたらすぐに交換してください。手順中に使用されたすべての有毒化学物質およびガス、特にフェノール-DEPC塩素ガスおよび液体窒素を適切に処理し、廃棄してください。オミック研究のポートフォリオでは、TRAPは重要なニッチを占めており、特に発生生物学において、多くの生物学的質問に答えるためにすでに使用されており、TRAPは大きな可能性を秘めています。

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Developmental Biology

発生生物学

植物材料から、特定の種​​類の細胞を単離する方法が示されている。この手法は、特定の細胞型、細胞の解離と蛍光活性化細胞選別に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマーカーラインを採用しています。さらに、成長のセットアップがの治療を容易にするここで確立されている...

植物プロトプラストの蛍光活性化細胞選別

の細胞特異的な分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;蛍光活性化細胞選別を使用した葉

Translating Ribosome Affinity Purification...

のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

結晶性セルロースは、植物の細胞壁の重要な構成要素です。しかし、細胞分解能での定量化は技術的に困難です。...

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

我々は、RNA精製と組み合わせてリボソーム中の増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)のEC特異的遺伝的タグを介して、マウス脳、肺および心臓組織における血管内皮細胞(EC)からリボソーム結合mRNAを精製するアプローチを提示する。.

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

簡単な実験ツールを使用して、シロイヌナズナとメディカゴの根系アーキテクチャ(RSA)を調べます。小植物はメッシュ上で水耕栽培され、アートブラシを使用して広げられ、RSAが明らかになります。画像はスキャンまたは高解像度カメラを使用して撮影され、ImageJで分析されて形質をマッピングします。...

植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル

ハイスループットscRNA-seqメソッドの実現可能性と有効性は、植物研究におけるシングルセル時代の到来を告げるものです。ここでは、シ ロイヌナズ ナの根の特定の細胞タイプを単離し、その後のトランスクリプトームライブラリの構築と解析を行うための堅牢で完全な手順を紹介します。...

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

ここでは、原形質膜受容体キナーゼの膜輸送イベントを研究するために、一般的に使用されるいくつかの方法を紹介します。この原稿では、植物材料の調製、薬理学的処理、共焦点イメージングのセットアップなど、詳細なプロトコルについて説明しています。...

気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

このプロセスは、シ ロイナ ナの蛍光標識核およびクロマチンマーカーラインと共焦点顕微鏡を用いて、シロイ ナナ...

シロイナ根における発生および環境ストレスにおける核形状とクロマチン動態の定量的ライブセルイメージング

学ぶTRAP法によるシロイヌナズナの細胞型特異的遺伝子発現解析。GFP標識リボソームを用いてポリソームRNAを精製し、側根形成における細胞間通信を解明する強力な技術です。

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

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