Name: 腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶレーザー微小切除法による神経膠腫の異質性解析。マウスモデルからの組織を用いて、腫瘍浸潤領域のmRNA発現を正確に分析し、治療標的の同定に貢献する。

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研究は国立衛生研究所(NIH/NINDS)助成金によってサポートされました:R37-NS094804、R01-NS105556、R21-NS107894からM.G.C.;(NIH/ニンズ)P.R.L.に R01-NS076991、R01-NS096756、R01-NS082311 を付与します。(NIH/NIBI): R01-EB022563;(NIH/NCI)U01CA224160;ミシガン大学ローゲルがんセンター、チャドタフ財団、リアのハッピーハーツ財団、M.G.C.とP.R.L.生物医学グラントF046166、M.G.C.国立衛生研究所、UL1 TR002240ミシガン臨床健康研究所(MICHR)、博士後期翻訳学者プログラム(PTSP) ミシガン大学フォーベがん研究所へのプロジェクトF049768、失明防止研究研究から医師科学者賞(RPB)、NIH(AK)のNEIからR01 EY022633を付与し、RPBから眼科と視覚科学科への無制限の助成金。本研究では、ビジョン研究コア(P30 EY007003)とがんセンター研究コア(P30 CA046592)を活用しました。AKは、A.アルフレッド・タウブマン医学研究所のウィリアム・デビッドソン夫人・エマージング・スカラー賞の支援を受けています。

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</ol>

この論文の著者は、すべての潜在的な利益相反を宣言しません。

神経膠腫の不均一性と侵略の根底にある分子メカニズムを理解することは、新しい治療標的13を発見するために非常に重要である。本稿では、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)に続いて、微小化解析を行い、それに続いて神経膠腫の不均質性と浸潤の分子景観を解析するための詳細かつ最適化された方法を説明する。
レーザー捕捉マイクロディション(LMD)は、腫瘍内の異なる領域または単一細胞を同定するために使用することができ、腫瘍14の空間的文脈を維持する分子パターンをさらに分析する特定のサンプルを提供する。この技術は、固形腫瘍15における空間転写体を分析するために用いられる他の方法と比較して、信頼性が高く、低価格である。遺伝子組み換えマウス腫瘍モデルまたは頭蓋内埋め込み型モデルの神経膠腫の不均一性と浸潤をLMDを用いて分析した。これらのモデルは、ヒトグリオーマの顕著な特徴を再現し、神経膠腫の不均一性および浸潤10,12</...

神経膠腫は中枢神経系の最も積極的な原発腫瘍である。彼らは非常に侵襲的で異質な1です。腫瘍の細胞および分子成分の分析は、新たな治療標的を明らかにする。
現在利用可能なさまざまな方法の中で、凍結脳腫瘍組織のレーザー捕捉マイクロ解剖(LMD)は、腫瘍組織からの離散解剖学的領域または特異的細胞集団の単離を可能にする費用対効果の高い、信頼性の高い技術であり、その分子プロファイル22,33を研究する。LMDは、選択した単一細胞または多細胞構造のmRNA遺伝子発現プロファイルの解析を可能にする4,5。54LMDは、腫瘍進行中に起こる分子事象に関する深い機械的な知識を得るために利用することができる。腫瘍組織の処理の改善は、組織形態およびRNA品質6の最適な光学分解能を得るために必要である。パラホルムアルデヒド固定は形態学的解析に最適な選択肢ですが、これらの条件下でRNAの品質が影響を受けて分解されるため、RNA-seq解析のRNA品質が低下します。凍結組織切片の使用は、細胞膜を破壊し、細胞内に穴を生成する可能性のある氷の結晶形成を回避し、RNA-Seq分析7のための最良の選択肢であり続ける。
ここでは、LMD用の凍結マウス脳腫瘍組織を処理するための最適化されたセクション固定および染色方法について述べている。氷の結晶が組織に形成されるのを防ぐために、我々は30%スクロースの溶液をマウスに浸透させた。この溶液は、極性水分子間の相互作用を破壊し、氷の結晶の形成を防ぎ、組織形態を維持します。組織染色は、腫瘍内の細胞または解剖学的に異なる領域の特定の集団を分化し、得るために必要である。RNAの完全性を維持するために、無害な染料で組織を固定し、染色することが不可欠です。以前に示されているヘマトキシリン/エオシン(H&E)を用いた組織の染色は、RNAの完全性を低下させる 8.エタノール、クレシルバイオレット4%、エオシンY 0.5%溶液で目的の組織を固定し、染色しました。クレシルバイオレットは、細胞核を濃い青色で染色する酸性の色素です。エオシンYは、細胞の基本的な成分を染色する好塩基性染料であり、細胞質と他の細胞構造8との区別を提供する。どちらの色素もエタノールに溶け、RNAの品質を低下させない。組織の損傷を避け、細胞構造の高い光学解像度を維持するために、我々はLMD9の前に組織切片を取り付けた。

<table><tbody><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Biolegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), Serum free</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>CorningPCR チューブ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6530</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12</td><td>Gibco</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laser Microdissection (LMD) System</td><td>ライカ</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Normocin - Antimicrobial Reagent</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Peel Away Disposable Embedding Molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>PEN Membrane Glass Slide (2 & micro;m)</td><td>Lieca</td><td>1150518</td><td></td></tr><tr><td>Pinpoint Solution</td><td>Zymo Research</td><td>D3001-1</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Research Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050s</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian</td><td>Takara Bio</td><td>634411</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-730-571</td><td></td></tr></tbody></table>

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

神経膠腫は、その侵襲性および不均一性を特徴とする原発性脳腫瘍である。例えば、偽官麻痺、微小血管増殖、間葉形転換および壊死などの特定の組織学的パターンは、高級神経膠腫の組織学的不均一性を特徴付ける。我々の研究室は、オンコストリームと名付けられた間葉細胞の高密度の存在が腫瘍悪性腫瘍と相関することを実証した。私たちは、グリオーマの成長と侵略の根本となるメカニズムを理解するためのユニークなアプローチを開発しました。ここでは、レーザー捕捉マイクロディション(LMD)およびRNAシーケンシングを利用して、腫瘍内の異種多細胞構造(すなわち、間葉領域または腫瘍浸潤領域)の微分mRNA発現を解析する包括的なプロトコルについて説明する。この方法は、良好な組織組織組織学およびRNA完全性を維持する。灌流、凍結、埋め込み、切り離し、染色は、形態を保存し、高品質のレーザーマイクロ解剖サンプルを得るために最適化されました。結果は、30%スクロースを使用するグリオーマを担うマウスの灌流が良好な形態およびRNAの質を提供することを示している。さらに、4%クレシルバイオレットと0.5%のエオシンで腫瘍切片を染色すると、RNAの完全性を維持しながら、良好な核染色および細胞染色が行われます。記載された方法は、感受性と高度に再現性が高く、様々な腫瘍モデルにおける腫瘍形態学を研究するために利用することができる。要約すると、固体腫瘍内の異種多細胞構造の分子的特徴を研究するために、シーケンシングのための形態およびRNAの質を維持するLMDを行う完全な方法を説明する。

当研究室では、睡眠美容トランスポザーゼシステムを用いて遺伝子操作マウスモデル(GEMM)を生成しました(図1A)。このシステムは、新生児マウスの神経前駆細胞のゲノムに特異的な遺伝的変化を組み込む。これらの変化した前駆細胞は内因性グリオーマ腫瘍を形成する。腫瘍を発生させるために使用されたプラスミド配列は次の例: (1) 睡眠美容トランスポゾン用 pT2C-LucPGK-SB100X ルシメラーゼ発現、(2)NRAS発現に対するpT2-NRASSV12、(3)p53ノックダウンおよびGFPタンパク質発現のためのpT2-shp53-GFP4、および(4)ATRXノックダウンのためのpT2-shATRx-GFP4。プラスミドを、前に説明した11日齢の新生児の前室に注入した。プラスミド取り込みおよび腫瘍形成をインビボ生物発光イメージングシステムを介してモニタリングした。腫瘍を持つマウスが腫瘍の負担の徴候を示すと、彼らは犠牲にされた。腫瘍は、神...

レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

このプロトコルは、レーザーマイクロディションとRNAシーケンシングを使用して、間葉細胞の蓄積領域や腫瘍浸潤領域などの腫瘍内不均一性のmRNA発現を分析します。この方法は、高品質のレーザーマイクロディスセクションサンプルの取得を容易にするために、良質の組織組織組織学とRNA完全性を維持するために最適化されています。この方法は、感度が高く、非常に再現性があります。様々な腫瘍モデルにおける腫瘍形態および不均一性を研究するために利用することができる。凍結した脳腫瘍組織のレーザー顕微鏡切除は、細胞集団の離散的な解剖学的領域を腫瘍組織から分離して分子プロファイルを研究するための費用対効果の高い、信頼性の高い技術である。LMDは、腫瘍進行中に起こる分子事象に関する深い機械的知識を得るために利用することができ、新しい治療標的を明らかにすることができる。マウス腫瘍の負担の生体発光は、1回10〜6回、7番目の光子の10倍の間のシグナルに達する。肝臓と肺が完全に血液を取り除くまで、安楽死腫瘍を持つマウスの循環系を通して酸素化されたタイロード溶液を洗い流す。さらに15分間、チロード溶液に溶解した30%スクロース溶液を動物に浸透させ続ける。灌流の成功を評価するために、首、尾、脚が循環の終わりに硬くなっていることを確認します。その後、標準的なプロトコルに従って脳を収穫し、新鮮な30%スクロース溶液で一晩脳を保存します。凍結保存の準備のために、冷たいイソペンタン-2-メチルブタンで瓶を満たし、液体窒素で満たされた容器に瓶を入れます。溶剤が冷えている間に、脳をろ過用紙の上で乾かし、脳をラベル付きのクリオマールルドに入れる。クライオモルドの中心に最適な温度切断媒体の約5ミリリットルで慎重に、所望の向きで型に脳を置きます。きれいな鉗子を使用して、すぐに30〜40秒間冷やしたイソペンタン-2-メチルブタンにクリオマールルドを置きます。切断媒体が固まったら、クライオモリをドライアイスに移し、クリオマールを包み、凍結した脳組織をアルミニウム箔で覆い、マイナス80°Cの貯蔵を行います。凍結した脳腫瘍組織切片を取得するには、まず、マイナス20度とマイナス24度の間のクライオスタットの温度を設定し、30〜60分間クライオスタットチャンバーにサンプルブロックを入れる。サンプルが平衡している間、100%エタノールでチャンバーとナイフホルダーを洗浄し、RNaseクリーニング溶液でセクションブラシをスプレーします。サンプルの準備ができたら、金型を取り出し、新しい切断媒体を使用して凍結した組織ブロックをクライオスタットの検体ディスクに取り付けます。ブロックをディスクホルダーに入れ、ブロックをナイフブレードに合わせます。Rnaseフリーブラシの1つを使用して脳の10マイクロメートルのセクションを取得し、組織片を切断面に慎重に平らにしてアンカールします。脳組織の切片をスライドに取り付けるには、ラベル付きRNaseフリーのPENガラススライドの正に帯電した側をセクションに滑らかに押し込み、スライドをチャンバー内の収納ボックスに入れます。すべてのスライドが収集されたら、保管ボックスをマイナス80°Cに置きます。レーザーマイクロ解剖前に切断媒体を溶解するには、スライドを30秒連続的に降水エタノール浸漬し、その後に0.5%eosin Y溶液で20秒間、5秒間の結晶紫色溶液染色を行います。エオシンYインキュベーションの終わりに、フィルターペーパーを使用してスライドを乾燥させてブロックし、順次上昇エタノール浸漬でスライドを脱水します。60秒のエタノール浸漬後、スライドをキシレンの容器に3分間リンスします。次に、RNaseフリー水で調製した取り付け媒体にサンプルを取り付ける前に、RNaseフリー表面のスライドを室温で10秒間乾燥させます。10~20秒後、顕微鏡顕微鏡の微細解剖プラットフォームにスライドを移します。レーザーキャプチャマイクロディシセクションの場合は、レーザーをオンにする前に電源を入れます。次に、コンピュータの顕微鏡コントローラをオンにして、レーザーキャプチャマイクロ解剖ソフトウェアを起動します。顕微鏡コントロールパネルで、10倍の倍率を選択します。レーザー制御の下で、組織解剖のためのレーザーパラメータを設定し、120ヘルツのレーザー周波数と100%のレーザー電流を選択して正確なレーザーマイクロ解剖を行い、速度を10に設定し、絞りを10マイクロメートルに設定します。次に、電源を 53 に設定します。セクションの後に組織をキャプチャする組織コレクターをロードし、2番目のアンロードボタンをクリックします。空のコレクターを、チューブあたり30マイクロリットルのライシスバッファーを含むDNaseおよびRnaseフリーの0.5ミリリットルPCRフラットヘッドチューブに交換してください。コレクターをマシンに戻し、続行をクリックして続行します。加工した標本を顕微鏡に積み込み、レーザーマイクロ解剖ソフトウェアで「アンロード」をクリックします。サンプルをスライドホルダーの上に上げ、スライドホルダーをステージに置きます。[続行] をクリックして続行し、[シェイプの切り取り] ウィンドウで [切り取り] を選択します。顕微鏡コントロールを使用して対象領域を見つけ、対象領域の周囲に輪郭を描きます。次に、デスティネーションコレクタチューブを選択し、[切り取り開始]をクリックして組織の微細解剖を進めます。関心のある領域がすべて解剖されたら、コレクタチューブをホルダーからドライアイスに移し、下流処理になるまで下流にします。優れた形態およびRNA完全性を有する組織を獲得するために、様々な灌流アプローチが評価された。関心のある領域を解剖するには、RNAの無害な染料で組織を染色する必要があります。その後、タイロード溶液と30%スクロースを有する腫瘍を持つマウスの灌流は、30%スクロース中で一晩のインキュベーションを行うと、マウス組織の形態およびRNA完全性の保存をもたらす。パラホルムアルデヒド組織の固定は、高品質の組織形態をもたらすが、RNAの完全性は悪影響を受けます。タイロード溶液インキュベーション、またはタイロード溶液+30%スクロース溶液インキュベーションを使用するなどの他のアプローチは、RNAの品質に影響を与えませんが、組織形態の分解能が低下することが観察されます。組織が実装媒体と一緒に取り付けられていない場合、セクションは脱水状態になり、水に溶解した15%の実装媒体を用いた組織サンプルの取り付けが高品質の組織形態を維持しながら形態が悪化する。レーザーキャプチャマイクロディスセクション顕微鏡イメージングは、解剖のための腫瘍組織の選択を可能にする。この関心領域選択により、各組織サンプル内の対象領域をRNA完全性解析に解剖することができます。高品質の腫瘍組織形態とRNAの完全性を維持することは非常に重要です。タイローデ溶液および30%スクロースの一晩保存と30%スクロース灌流は、LMDの組織形態を有意に改善する。迅速なライオマ固定、ガン溶液による染色および取り付けは、RNA品質を維持し、組織内での亀裂の形成を防ぐための重要なステップです。RNAの品質管理と転写分析の両方に適切な量のRNAを得るために、組織面積当たりの腫瘍全体を少なくとも2.5倍から6平方マイクロメートルに切除することをお勧めします。LMDは、神経膠腫の不均一性と浸潤を調節する分子シグナル伝達経路の分析を可能にし、前臨床グリオーマモデルにおける将来の翻訳発達のための新たな潜在的標的を明らかにすることができる。

laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、3Dオルガノタイプ共培養モデルのレーザー解剖をミクロン単位の精度で説明しています。3D器官型モデルでは、線維芽細胞などの間質成分をがん上皮細胞と3次元共培養します。3Dモデルは、浸潤とがん-間質の相互作用を生理学的に近い条件で研究できるようにする実験ツールとして機能します。...

レーザーマイクロダイセクション:3D器官型培養モデルから浸潤する結腸直腸癌細胞を分離する技術

出典: Parker, J. J., et al. 抗侵襲薬の腫瘍細胞遊走と患者特異的効果を研究するためのヒト神経膠芽腫器官型スライス培養モデル。J. Vis. 経験。(2017年)このビデオでは、共焦点顕微鏡による緑色蛍光タンパク質 (GFP)...

タイムラプス走査共焦点顕微鏡を使用した神経膠芽腫組織における腫瘍細胞遊走のイメージング

合成からのレーザーマイクロダイセクション細胞や間質、組織工学大腸癌モデルの分子プロファイリングは、浸潤性前面に腫瘍細胞および癌関連の間質細胞との間の界面に特徴的な生物学を特徴付け、分析する新規かつ操作可能なアプローチを表しています。...

大腸癌細胞の3次元モデルにおける侵襲性腫瘍微小環境の分子プロファイリングと<em&gt;生体外</em&gt;線維芽細胞

神経膠芽腫（GBM）の現在のex vivoモデルは、ヒト腫瘍浸潤の生理学的に関連する研究のために最適化されていない。ここでは、我々は、新鮮なヒトGBM組織からの器官型スライス培養物の生成および維持のためのプロトコールを提示する。経時顕微鏡法および定量的細胞移動分析技術の説明が提供される。...

腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。...

患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学

ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤を用いた三次元(3D)侵入アッセイにおけるグリオーマ癌細胞移動に対する移行抑制剤の効果は、高分解能共焦点顕微鏡によって特徴付けられる。...

高分解能共焦点顕微鏡による3D腫瘍スフェロイド侵入に対する移動性阻害剤の効果の特徴

プロテオミクス調節不全は、びまん性浸潤性神経膠腫の蔓延に重要な役割を果たしますが、いくつかの関連タンパク質は未同定のままです。デジタル空間処理(DSP)は、浸潤性神経膠腫の浸潤および遊走に寄与する可能性のある候補タンパク質の発現差を特徴付けるための効率的でハイスループットなアプローチを提供します。...

成人型びまん性浸潤神経膠腫における微小環境のキャラクタリゼーションのためのディジタル空間プロファイリング

脊椎動物の脳組織に侵入する膠芽腫(GBM)細胞における微小管動態のライブイメージングを可能にする技術を報告する。蛍光タグ付きGBM細胞の透明なゼブラフィッシュ脳への同所性注射と高解像度の生体内イメージングを組み合わせることで、 in situ...

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

このプロトコルは、レーザーマイクロダイセクションを使用して組織学分解細胞集団を濃縮するための、染色された薄い組織切片画像から病理学的に確認された関心領域を人工知能駆動でセグメンテーションするためのハイスループットワークフローを記述します。この戦略には、関心のある細胞集団を示す境界をレーザー顕微鏡に直接転送することを可能にする新しいアルゴリズムが含まれる。...

腫瘍微小環境のマイクロスケールプロテオミクス分析のための工業化された人工知能誘導レーザーマイクロダイセクション

口腔粘膜下線維症組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、形態学的および空間的情報を含むマルチオミクスデータの解析のために、関心のある組織学的領域から細胞を正確に抽出することを可能にします。...

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによる口腔粘膜下線維症サンプルからの形態学的および空間的情報による細胞の分離

新たに診断され再発した腫瘍から生成された患者由来の磁気膠腫を用いて、3次元膠芽腫移動モデルを提示します。このプラットフォームは、患者特有の移動動態の可視化と治療効果の評価を可能にします。このアッセイは移動後に多重化され、タンパク質の局在化や発現パターンを評価することができます。...

磁気ナノ粒子媒介の球状定在を用いた低酸素条件下での再現可能な3D膠芽腫移動アッセイ

学ぶレーザー微小切除法による神経膠腫の異質性解析。マウスモデルからの組織を用いて、腫瘍浸潤領域のmRNA発現を正確に分析し、治療標的の同定に貢献する。

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

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