Name: ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学ぼう、水素重水素交換質量分析（HDX-MS）を用いてランチペプチド生合成酵素の構造動態を解析する方法。近天然条件下でタンパク質の機能的に重要な領域を同定し、ペプチド天然物生合成のメカニズム解明に貢献します。

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この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会、ケベック自然とテクノロジー、カナダイノベーション財団、マギル大学のスタートアップ資金によって支援されました。

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<li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li>
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<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
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開示するものは何もありません。

このプロトコルで提示されるHDX-MSワークフローは、タンパク質中の構造的に動的な要素の空間分布をマッピングし、これらのダイナミクスが摂動(リガンド結合、酵素変異生成など)にどのように変化するかを調査するための非常に堅牢なプラットフォームを提供します。HDX-MSは、立体構造ダイナミクスの調査に一般的に使用される他の構造生物学アプローチに対して、いくつかの明確な利点を有する。最も顕著なのは、少量のタンパク質のみが必要です。ここに記載されているワークフローを用いて、1 μMタンパク質の1 mLサンプルは、5つの交換時間ポイントを含むHDX反応を3倍にするのに十分な材料を提供します。さらに、対象となるタンパク質にサイズ制限は事実上なく、タンパク質複合体はHDX-MSアプローチにも同様に適しています。サイズ制限は、ペプチドペプチドをクロマトグラフィー的に分解できる程度、およびm/zおよびイオン移動性寸法でのみ制限されます。このように、多くのタンパク質/タンパク質複合体に対して、HDX-MSはタンパク質とタンパク質相互作用の相互作用の相互作用、リガンド結合部位、立体構造ダイナミクス、およびアロステリックネットワークに関する貴重な情報を提供します...

タンパク質は、フェムト秒スケールの結合振動から、何秒間にわたって起こり得るタンパク質ドメイン全体の再配置に至るまで、時間スケールで異なる立体構造をサンプリングする構造的に動的な分子である1。これらの立体構造変動は、しばしば酵素/タンパク質機能の重要な側面です。例えば、リガンド結合によって誘導される立体構造変化は、触媒に必要な活性部位残基を組織し、連続的な運動機構で基質結合部位を定義し、反応性中間体を環境から遮蔽するか、またはアロステリックネットワークを介して酵素機能を調節することによって、酵素機能を調節するために非常に重要である。最近の研究では、立体構造ダイナミクスは進化を通して保存することができ、保存された分子運動への摂動は基質特異性の変化および新しい酵素機能の出現と相関することができることを示している2,3。
近年、水素-重水素交換質量分析(HDX-MS)は、リガンド結合や変異形成などの摂動にタンパク質の立体構造の景観がどのように応答するかを調査する強力な技術として急速に出現している4、5、6、7。典型的なHDX-MS実験(図1)では、目的のタンパク質をD2Oで調製したバッファーに入れ、溶媒交換可能なプロトンを重水素に置換する。ペプチド結合のアミド部分の交換速度は、pH、局所アミノ酸配列、およびアミド8の局所構造環境に強く依存する。水素結合相互作用に関与しているアミド(αヘリックスやβシートに存在するものなど)は、バルク溶媒にさらされているタンパク質の非構造化領域のアミドよりもゆっくりと交換します。したがって、重水素の取り込みの程度は、酵素の構造の反映である。立体構造が動的な酵素、またはリガンド結合時に構造的な転移を起す酵素は、測定可能なHDX応答をもたらすと予想されるであろう。
構造化アミドの遅い為替レートの機械化基準を図25,8,9に示します。HDXを受けるためには、特定の酸/塩基化学機構を介してHDX交換を触媒する溶媒分子が交換可能なアミドにアクセスできるように、まず一時的に展開された立体構造をサンプリングする必要があります。最終的に、化学為替レート(kchem)と折り畳み速度(kオープンおよびkクローズ)の相対マグニチュードは、実験5,8で測定されたHDXレートを決定する。この単純な運動モデルから、重水素取り込みの程度が基礎となる立体ダイナミクス(kopenとk close)を反映することは明らかです。ほとんどのHDX-MS実験は、交換反応に続いて、目的のタンパク質がペプチドに消化され、各ペプチドによる重水素取り込みが質量7の増加として測定されるボトムアップワークフローで行われる。このように、HDX-MSは、酵素立体構造ダイナミクスへの摂動をペプチドの局所空間スケールにマッピングすることを可能にし、摂動が目的の酵素の異なる領域のダイナミクスをどのように変化させるかを評価することを可能にする。
タンパク質構造力学を解明するためのHDX-MSアプローチの利点は数多くあります。まず、この方法は、第四級構造10の系において少量の天然タンパク質またはタンパク質複合体に対して実施することができる。ボトムアップHDX-MSワークフローが目的のタンパク質配列をカバーする十分な数の確実に同定されたペプチドを提供する限り、アッセイに使用される酵素調製物が高度に精製される11,12である必要さえありません。さらに、HDX-MSは、単一分子蛍光研究13で用いられるような部位特異的タンパク質標識を必要とせずに、近い在来条件下での立体構造ダイナミクスに関する情報を提供することができ、また、調査できるタンパク質またはタンパク質複合体(核磁気共鳴[NMR]分光法などのアプローチを困難にする)にサイズ制限はない。最後に、時間分解HDX-MS法は、X線結晶学15、16、17、18で研究することが困難である本質的に障害を持つタンパク質を研究するために使用することができる。HDX-MSの主な制限は、データが低い構造分解能であるということです。HDX-MSデータは、立体ダイナミクスが変化している場所を指し示し、結合された立体構造の変化を明らかにするのに役立ちますが、観察された変化を駆動する正確な分子メカニズムに関する多くの洞察を提供することはあまりありません。電子捕獲解離法とタンパク質HDX-MSデータの組み合わせにおける最近の進歩は、交換部位を単一アミノ酸残基19にマッピングする約束を示しているが、HDX-MSデータによって転送される構造モデルを明確にするために、生化学的および構造的研究をフォローアップすることが依然としてしばしば必要である。
以下、HDX-MSアッセイの開発のための詳細なプロトコルが20を提示される。以下に示すサンプル調製プロトコルは、一般的に、水性バッファーに良好な溶解性を示す任意のタンパク質に適用できる必要があります。より特殊なサンプル調製方法およびHDX-MSワークフローは、洗浄剤またはリン脂質21、22、23、24の存在下でのアッセイが必要以上にタンパク質に対して利用可能である。HDX-MS データ収集のインストゥルメンタル設定は、液体クロマトグラフィー システムに結合された高分解能の四重極時間質量分析計について説明されています。同様の複雑性と分解能のデータは、市販の液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)システムの中から収集できます。市販のソフトウェアパッケージを用いたデータ処理の重要な側面も提供される。また、より広範な HDX-MS コミュニティ12の推奨事項と一致するデータ収集と分析のガイドラインも示します。本記載のプロトコルは、HalM2の動的構造特性を研究するために用いられる、抗菌ペプチド天然物20の多段階成熟を触媒するランチペプチド合成酵素である。我々は、HDX-MSを用いて、これまでの特徴付けが排除された基質結合部位およびアロステリック特性を明らかにする方法を示す。タンパク質HDX-MSに関する他のいくつかのプロトコルが近年25,26で公開されている。現在の作業と共に、これらの以前の貢献は、読者に実験計画のいくつかの柔軟性を提供する必要があります。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k 遠心ろ過装置 (ミリポア)</td><td>ミリポア シグ</td><td>マ UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>サーモフィッシャー</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>グアニジン-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャー</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>塩化</td><td>カリウムBioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>カリウム</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP塩酸塩</td><td>TRCカナダ</td><td>T012500</td><td>ペプチドは、要求に応じて合成されました</td></tr><tr><td>材料名/機器名</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>version 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>version 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>version 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>version 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml;dinger</td><td>バージョン 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>材料名/装置名</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/説明</td></tr><tr><td>装置および装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 分析カラム</td><td>Waters</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard プレカラム</td><td>Waters</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX システム</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microtip pH 電極</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH カラムまたは Pepsin solumn</td><td>Waters</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Waters SynaptG2-Si</td><td>ウォーターズ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(hdx-ms)プラットフォーム

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

水素重水素交換質量分析(HDX-MS)は、酵素の立体構造変化と酵素基質相互作用の生物物理特性解析に対する強力な方法です。その多くの利点の中で、HDX-MSは少量の材料しか消費せず、酵素/基質標識を必要とせずに近い天然条件下で行うことができるので、大きな酵素および多タンパク質複合体に対しても酵素立体構造ダイナミクスに関する空間的に解決された情報を提供することができます。この方法は、D2Oで調製した緩衝液への目的の酵素の希釈によって開始される。これは、重水素(N-D)とのペプチド結合アミド(N-H)中のプロチウムの交換を引き起こす。所望の交換時点で、反応アリコートがクエンチされ、酵素がペプチドにタンパク質化され、ペプチドが超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)によって分離され、各ペプチドの質量の変化(重水素に対する水素交換による)がMSによって記録される。各ペプチドによる重水素の取り込みの量は、そのペプチドの局所水素結合環境に強く依存する。酵素交換重水素の非常に動的な領域に存在するペプチドは非常に迅速に存在するのに対し、整然とした領域に由来するペプチドは、はるかにゆっくりと交換を受ける。このようにして、HDXレートは局所的な酵素立体構造ダイナミクスについて報告する。異なるリガンドの存在下で重水素の取り込みレベルへの摂動は、リガンド結合部位をマッピングし、アロステリックネットワークを同定し、酵素機能における立体構造ダイナミクスの役割を理解するために使用することができる。ここでは、ランチペプチドと呼ばれるペプチド天然物の生合成をより深く理解するためにHDX-MSを使用した方法を説明します。ランチペプチドは、従来の構造生物学のアプローチでは研究が困難な大規模で多機能な構造動的酵素によって翻訳後に修飾される遺伝的にコードされたペプチドです。HDX-MSは、これらのタイプの酵素の機械特性を調査するための理想的で適応可能なプラットフォームを提供します。

タンパク質分解消化の品質とサンプル注射の各セットのワークフローの再現性を評価する必要があります。したがって、HDX-MSアッセイを行う前に、目的のタンパク質のタンパク質分解、逆相液体クロマトグラフィーと気相イオン移動度を用いたペプチドの分離、およびMSを用いたペプチドの検出に有効な条件を確立することが不可欠です。この目的のために、対象となるタンパク質(重水素の不在時に採取した)の参照サンプルをまず調査する必要がある(セクション3)。 図3A-C のクロマトグラフィーデータは、HalM2ランチペプチド合成酵素の3つの参照サンプルに対するイオンクロマトグラム(TIC)の合計を示しています。TIC は、質量スペクトルスキャンに含まれるすべての m/z 値におけるすべてのイオンカウントの合計における時間依存変化です。 図 3D-Fに、3 ~ 8 分の間の TIC の詳細なビューを示します。 図 3<s...

ランチペプチド合成酵素は、ペプチド天然物の生合成中に多段階反応を触媒する。ここでは、ランチペプチド合成酵素の立体ダイナミクス、ならびにペプチド天然物生合成に関与する他の同様の酵素を研究するために使用できる、連続的なボトムアップ、水素重水素交換質量分析(HDX-MS)ワークフローについて述べています。

ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

このプロトコールは、タンパク質のコンフォメーションダイナミクスに関する特別に分解された情報を提供することができます。これは、目的のタンパク質の機能的に重要な領域を特定するのに役立ちます。この技術は、ネイティブに近い条件下でタンパク質のコンフォメーションダイナミクスを調査します。反応ごとにナノモル量の材料を使用したタンパク質標識の必要はありません。まず、500マイクロリットルのチューブで、トリプリケートで目的のタンパク質の非重水素化参照サンプルを調製します。チューブごとに適切な量のクエンチバッファーでサンプルをクエンチし、pHメーターの読み取り値を2.5にします。サンプルを液体窒素で急速凍結し、分析まで摂氏マイナス80度で保存します。次に、ボトムアップ液体クロマトグラフィー質量分析ワークフローを使用して、標準プロトコルに従って、プロチアトレーション酵素リファレンスサンプルを分析します。生の質量分析データを適切なプロテオミクスソフトウェアプログラムで分析する。Libraries and Protein Sequence Databanksに移動して、目的のタンパク質のアミノ酸配列をインポートします。目的のタンパク質配列の名前を入力し、タンパク質配列をFASTA形式でインポートします。ライブラリメニューで処理パラメータを定義するには、データ取得タイプとしてエレクトロスプレーMSEを選択します。「Lock Mass for Charge 2」フィールドで、グルカン 1 ファイバー no peptide B の 2 プラスイオンのマスターチャージ比に 785.8426 を入力し、「Finish」をクリックします。ワークフローパラメータを定義するには、検索タイプとしてエレクトロスプレーMSEを選択します。「Workflow and Database search」クエリの見出しの下で、「Databank」フィールドで作成したデータベースタンパク質を選択し、プライマリー消化試薬を非特異的に変更します。固定修飾試薬フィールドをクリアするには、コントロールボタンを押したまま[Carbamidomethyl]をクリックし C.To 出力ディレクトリを指定し、[Options]、[Automation Setup]、[Identify E]の順に選択し、[apex 3D]および[peptide 3D]出力と[ion accounting output]ボックスをオンにします。そして、目的のディレクトリを指定します。参照されたサンプルデータを処理するには、マイクロタイタープレートを右クリックして新しいプレートを作成します。1つのウェルを左クリックし、他の3つのウェルにドラッグして、参照されたサンプルごとに1つのウェルを強調表示します。次に、右クリックして [生データの追加] を選択します。ウィンドウで、参照されている 3 つのファイルが含まれているディレクトリに移動し、3 つのファイルすべてを同時に選択します。「次へ」をクリックし、定義済の処理パラメータを選択します。「次へ」を再度クリックし、定義したワークフロー・パラメーターを選択します。次に、[完了]をクリックします。生データ、処理パラメータ、およびワークフローパラメータがプレート上の各ウェルに割り当てられると、ウェルは青色に変わります。ウェルを選択し、右クリックして [最新の生データを処理] を選択します。データの処理を追跡するには、ウィンドウの右下隅をクリックします。実行するジョブが表示されない場合は、処理が完了し、マイクロタイタープレートのウェルが緑色に変わります。ウェルを右クリックし、[ワークフロー結果の表示]を選択します。参照されるデータ ファイルごとに個別のウィンドウが開きます。データを調べて、参照されたサンプルデータ中の質量分析シグナルの大部分が、目的のタンパク質のin silico消化から予測されたペプチドに正常にマッピングされたことを確認します。一致したペプチドは、出力スペクトルで青色で表示されます。「okay」フィルターをダブルクリックし、カバー率が99%より大きいことを確認します。Proteomic Softwareの出力を水素重水素交換処理ソフトウェアにインポートして、追加のしきい値を設定します。そして、データをクリックしてPLGSの結果をインポートします。「追加」アイコンをクリックし、適切なディレクトリに移動して、処理されたデータファイルを選択します。[次へ]をクリックし、連続するイオンの最小値を 2 以上に設定します。質量誤差は5ppmです。そして、ファイルのしきい値を3に設定し、[完了]をクリックします。水素重水素交換反応を行うには、500マイクロリットルのチューブにバッファーを分注します。そして、簡単に遠心分離して、すべてのクエンチバッファーを各チューブの底に移します。急冷した溶液の入ったチューブを氷の上に置きます。次に、すべての重水素化反応成分を別の1.5ミリリットルチューブに予め混合します。次に、反応混合物を摂氏25度の温度制御されたウォーターバスに移し、10分間インキュベーションします。重水素化反応成分に酵素を添加して交換反応を開始します。反応内容物をピペッティングで上下させて十分に混合します。適切な実験交換時間時点で、各水素重水素交換反応から50マイクロリットルのアリコートを取り除きます。そして、個々の500マイクロリットルチューブ内の氷冷クエンチバッファーの1アリコートで反応を迅速かつ均一に混合します。その後、液体窒素で瞬間凍結するためにチューブにすぐにキャップをします。分析の準備が整うまで、サンプルを摂氏マイナス80度で保管します。凍結サンプルを解凍した後、重水素化されていない参照サンプル用に開発されたのと同じボトムアップ液体クロマトグラフィー質量分析ワークフローを使用して、重水素化酵素参照サンプルを分析します。重水素化サンプルのLCMSデータを収集した後、以前に作成した水素重水素交換プロジェクトにデータをインポートしてデータ処理を行います。そして、「新規状態」と「新規曝露」をクリックして、分析に関連する生化学的状態と重水素曝露時間をそれぞれ定義します。「新規 Raw」をクリックして、分析する水素重水素交換データ・ファイルを選択します。また、インポートされる各生データファイルに適切な交換時間と生化学的状態を割り当てます。データの解析と可視化を行うには、ペプチドリストの最初のペプチドを選択し、ビューメニューからスタックスペクトルプロットを開きます。マウスをクリックして、必要に応じてスティックを割り当てたり、割り当てを解除したりして、データに適切な同位体分布が配置されていることを確認します。そして、各同位体ピークが割り当てられていること。各充電状態のスティック割り当てを確認するには、積み上げスペクトル プロット ウィンドウの上部にある充電状態を切り替えます。[Views] メニューでペプチド重水素取り込み値の標準偏差を確認するには、カバレッジマップを選択します。これは、目的のタンパク質のアミノ酸配列に沿ってマッピングされたペプチドリスト内の各ペプチドを表示します。相対標準偏差に従ってペプチドを色付けし、相対標準偏差が高い外れ値のペプチドをマップで視覚的に検索します。カバレッジマップで外れ値のペプチドをクリックすると、スタックスペクトルプロットとデータビューアウィンドウにターゲットペプチドが表示されます。対象データに対象差を表示し、マップ上で右クリックして差分データをCSVファイルにエクスポートします。目的のタンパク質の差分、状態データ、およびPDBファイルをDeuterosにインポートします。そして、99%信頼区間を選択し、合計を有効にしてデータを処理します。次に、pi mol で Export Uptake and Export を選択し、PyMOL ソフトウェアで目的のタンパク質の PDB 構造に有意な交換差の領域をマッピングするための PyMOL スクリプトを生成します。Hal-M2 ラムダペプチド合成酵素の 3 つの参照サンプルのこれらの代表的なトータルイオンクロマトグラムは、質量スペクトルスキャンに含まれるすべての質量電荷比値におけるすべてのイオンカウントの合計の時間依存的な変化を示しています。トータルイオンクロマトグラムプロファイルの形状と強度は類似している必要があります。Hal-M2のタンパク質分解消化が再現可能であることを示しています。また、3つの参照サンプルすべてで同様の効率を示します。特定の時間間隔での質量スペクトルも同様である必要があります。類似のペプチドが各サンプル内に存在し、C18カラムから同様の時間にほのめかしているという信頼性を提供します。重水素交換サンプル中のペプチドの大部分は、同位体分布がより高い質量電荷比値に向かって明らかなシフトを示すはずです。例えば、これらのデータは、酸クエンチ、ペプシン消化、および液体クロマトグラフィー質量分析データ収集の過程で、重水素標識のかなりの部分が維持されていたことを示しています。実証されたように酵素の生化学的特性を特性評価した後、このような代表的な水素重水素交換質量分析結果を生成することができます。Hal-A2前駆体ペプチドのHal-M2 AMP、PMP複合体への結合を説明するため。水素重水素交換反応は、一貫した方法で調製および急冷する必要があります。また、検出された多数のペプチドの重水素交換値を決定する際には、系統的でなければなりません。水素重水素交換質量分析は、ペプチドレベルの情報と動的なタンパク質構造変化を提供します。水素重水素交換の機能的関連性は、Meter Genesisで検証する必要があります。そして、直交的な活性アッセイ。

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ペプチド生合成酵素を調べた水素重水素交換質量分析(HDX-MS)プラットフォーム

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