Name: 鉄レドックス種(Fe(II)、Fe(III)の定量化のためのキャピラリー電気泳動誘導結合プラズマ質量分析(CE-ICP-MS)のセットアップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: 学ぶCE-ICP-MSによる鉄レドックス種（Fe(II)、Fe(III)）の高速定量法。神経変性疾患やがんにおける鉄依存性細胞死（フェロプトーシス）のメカニズム解明とバイオマーカー探索に応用可能です。

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VVは、ゲッティンゲン大学医療センターの壁内研究助成金(フォルシュングスフェルデルン)とエルゼ・クレナー・フレゼニウス・スティフトゥンのエルゼ・クレナー研究プログラムによって支えられた。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

鉄はOSの進行において顕著な役割を果たすため、ミトコンドリア機能障害やFTPを促進するため、Ce-ICP-MSベースの同時Fe(II)/Fe(III)の種分化法が本稿で紹介され、その応用は細胞のライゼで例示されています。この方法は、短い分析時間とメリットの数値(LOQ、精度、回復)は、特に神経変性および癌研究において鉄酸化還元種化に関連するサンプルに適しています。LCに基づく以前の方法と比較して、このCEベースの方法は、カラムバッチとLCカラム変更後に以前に観察された再現性の問題から実質的に独立しています。各実行前のキャピラリー調製は<4分で、サンプルあたりの分析時間は3分まで適度な食分です。CZEの移動時間は、分子の電荷とサイズとは別に、サンプルプラグの導電率に依存し、サンプル自体が伝導率に大きく影響する場合に移動時間の変動やシフトを引き起こします。このような移行時間の変化は、毛細管電気泳動においてよく知られている。これはCZE-immanentの問題であり、文献21、22,22から知られている。標準およびSH-SY5Y細胞ライセートは、中程度で均質な導電性を有していた。その結果、移行時間は、精度の高い変更しか示さなかった。しかし、高い導電性を有するサンプルの場合、長時間の移動時間は最大5分観察される可能性がある。したがって、明確な種の識別には標準の追加が推奨されます。
鉄酸化還元の種分化における重要な問題は、サンプル調製88,13の間の種の安定性(すなわち、Fe(II)/(III)平衡の維持)である。不適切なpHやキレート性の化学物質、サンプルに接触する酸素(空気)や深い冷凍貯蔵の中断などの不適切な貯蔵条件は、Fe(II)/(III)バランスを容易に変更することができます。そこで、SH-SY5Y細胞ライセートの調製のために、キレート剤を一切含まないリシス緩衝液を選択し、生理学的pH、サンプル調製中の不活性ガスオーバーレイ、サンプル容器内および即時深凍結でこれらのサンプルに適用した。
文献では、Fe(II)を監視する半定量的アプローチを見つけることができます。酸化ストレスにおける鉄の役割を理解しやすくするために、いくつかの研究グループは、Fe(II)特異的プローブを開発し、鉄鉄の異常な上昇を半定量的に監視し、可視化しました。ただし、重要なのは、このようなプローブは Fe(III) を考慮せず、定量化せず、単に "もっと" または "より少ない" Fe(II)を報告します。現在までに、少数のバイオマーカーのみが、OSとFPTを決定するために利用可能であり、同時にFe(II)/Fe(III)レドックス種23、24,24を定量する信頼性の高い方法の欠如のためである。これを念頭に置いて、提示された方法は、Fe(III)とFe(II)の両方を1回の実行で迅速に定量化することを促進するものであり、鉄依存分子プロセスに関する洞察を深める有望なツールになるかもしれない。

今日では、鉄媒介酸化ストレス(OS)が、アルツハイマー病やパーキンソン病、癌,1、2、3、42などの神経変性脳障害において特に複数の疾患において重要な役割3を4果たすことが最も1明らかである。OSはレドックス・カップルのFe(II)/Fe(III)の状態とバランスと密接に関連しています。Fe(III)は酸化還元不活性である一方、Fe(II)は、ヒドロキシルラジカル産生および膜脂質過酸化反応から続く5,H2O2分解を触媒することによって強力に活性酸素種(ROS)を生成する。2分子レベルでは、Fe(II)生成ROSおよびペルオキシドリン脂質は、タンパク質、脂質およびDNA7、8,8の完全性に対する強力な攻撃である。このような有害な細胞機能障害は、ATP含有量9の低下を伴うミトコンドリア機能不全を誘導し、フェロプトシス(FPT)10,11として知られるプログラムされた壊死10,11細胞死を引き起こすことさえできることが実証された。従って、定量的Fe(II)/(III)酸化還元種分化は、広い範囲の酸化還元関連疾患において重要である。
化学種分化は、一般的に生物学的役割および代謝の微量元素の研究のための確立されたツールであり、一般的な77、88だけでなく、神経変性状態12、13、14、15、16、17で。12,13,14,15,16,17文献に含まれるFe-Redox種分化法は、典型的には液体クロマトグラフィー(LC)分離に基づく。文献の一部は、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)を要素選択的検出器として使用している。ただし、通常の LC 作業では、実行の間に過度のパージ時間が必要でした。さらに問題となるのは、LC カラムのバッチ間の変動により、各カラム変更後に溶出条件の再最適化を余儀なくされた。これらの問題は、ハイスループットを妨げている。許容できる信頼性を得るためには、さらに時間が必要であり、メソッドを再び徹底的に評価します。
これらの欠点を回避するために、毛細血管電気泳動誘導結合プラズマ質量分析法(CE-ICP-MS)に基づくFe(II)/Fe(III)酸化還元法の方法をここで提示します。CEはLC18と比較して様々な利点を提供しています。毛細血管には定常段階がないため、バッチ ID に依存しません(ほぼ)。エージまたはブロックされると、それらはすぐに置き換えられ、通常は変更されないパフォーマンスを示します。サンプル間のパージとクリーニングのステップは効果的で短く、サンプルごとの分析時間も短いです。
提示された方法は、メリットの良い数字と信頼性があります。原理の証明として、この方法はヒトドーパミン作動性神経芽細胞腫(SH-SY5Y)細胞リセートに適用され、癌研究19と同様に神経変性において重要なサンプルタイプである。

<table><tbody><tr><td>CE キャピラリー</td><td>CS-クロマトグラフィー サービス、ランガーヴェーエ、ドイツ</td><td>105180-25</td><td></td></tr><tr><td>CE システム</td><td>PrinCe 技術</td><td>0005.263</td><td>モデル PrinCe 760</td></tr><tr><td>円錐形スーパークリア チューブ 15 ml</td><td>Analytics-shop.com アルトマン アナリティク</td><td>PEN0777704</td><td></td></tr><tr><td>コニカル スーパークリア チューブ 50 ml</td><td>Analytics-shop.com アルトマン アナリティク</td><td>PEN0777694</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2 * 4H2O</td><td>Merck</td><td>103861</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Merck</td><td>803945</td><td></td></tr><tr><td>Fluidflex Silikon HG-Schlauch</td><td>ProLiquid</td><td>4001106HG</td><td></td></tr><tr><td>溶融シリカキャピラリー OD 360 & マイクロ;メートル、ID 50 &マイクロ;m</td><td>Chromatographie Service GmbH</td><td>105180-25</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸、1 M</td><td>Merck</td><td>1101652500</td><td>腐食性</td></tr><tr><td>ICP-MS</td><td>Perkin Elmer</td><td>N814003</td><td></td></tr><tr><td>Luer、3ウェイメス</td><td>BioRad</td><td>7318229</td><td></td></tr><tr><td>Luer、コーンオス</td><td>neoLab Migge</td><td>2-1895</td><td></td></tr>ル<tr><td>アー、オス</td><td>neoLab Migge</td><td>2-1880</td><td></td></tr><tr><td>Peakfitピーク評価ソフトウェア</td><td>Systat</td><td>PeakFit 4.12</td><td></td></tr><tr><td>Ptワイヤー</td><td>カールロス</td><td>0737.1</td><td></td></tr><tr><td>PVCチューブ</td><td>ProLiquid</td><td>6000002</td><td></td></tr><tr><td>RIPAバッファー</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>水酸化テトラメチルアンモニウム、25 %</td><td>メルク</td><td>814748</td><td></td></tr>腐食性タイ<tr><td>ゴンチューブ R-3607</td><td>ProLiquid</td><td>3700203A</td><td></td></tr></tbody></table>

鉄レドックス種(fe(ii)、fe(iii)の定量化のためのキャピラリー電気泳動誘導結合プラズマ質量分析(ce-icp-ms)のセットアップ

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

鉄代謝のジホメオスタシスは、癌およびいくつかの神経変性状態を含む多数の疾患の病態生理学的枠組みに説明される。過剰な鉄は遊離酸化活性Fe(II)をもたらし、酸化ストレス(OS)やフェロプト(FPT)として知られている脂質過酸化による死のような細胞内の壊滅的な効果を引き起こす可能性があります。したがって、Feの全定量ではなく鉄鉄(Fe(II))と鉄(Fe(III))の定量的測定が、これらの有害なプロセスをより詳しく調べるための鍵となります。Fe(II)/(III)の決定は、脳脊髄液(CSF)のような関連するサンプルの速いレドックス状態シフトと低濃度によって妨げられる可能性があるため、迅速に分析し、定量(LOQ)の低限界を提供する方法が利用可能であるべきです。キャピラリー電気泳動(CE)は、高速Fe(II)/Fe(III)分離の利点を提供し、酸化還元バランスを妨げるか、または検体の固着を引き起こす可能性のある静止相なしで動作します。CEは、検出器として誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)と組み合わせることで、検出感度と選択性をさらに向上させます。提示された方法は、バックグラウンド電解質として20 mM HClを使用し、+25 kVの電圧を使用します。ピーク形状と濃度検出限界は、導電率-pHスタッキングによって改善される。56[ArO]+の還元+のために、ICP-MSは反応ガスとしてNH3で動的反応セル(DRC)モードで動作させた。 56この方法は、3 μg/Lの検出(LOD)の限界を達成し、積層のために、分離を妨げることなく、LODを改善することなく、より高い注入量が可能であった。ピーク面積に関するキャリブレーションは、最大150μg/Lのリニアで、測定精度は2.2%(Fe(III))~3.5%(Fe(II))であった。移動時間精度は両方の種について<3%であり、ヒト神経芽細胞腫(SH-SY5Y)細胞の1:2希釈ライセートで決定された。標準添加による回収実験では、97%のFe(III)と105%のFe(II)の精度が明らかになりました。CSFのような実際のバイオサンプルでは、移動時間は様々な導電率(すなわち、生理性)によって変化する可能性があります。これにより、ピーク識別は標準添加により確認される。

標準およびキャリブレーションの測定 移行時間は、単一の標準注入によって解明された:Fe(III)標準は、移行時間の118 sで監視され、Fe(II)標準は136 sの移行時間で監視された。検出限界は、ベースラインノイズを基準とする3σ基準を用いて計算し、標準濃度の50μg/L.LOD(Fe(II)は 3.1μg/L、LOD(Fe(III)は 3.2μg/Lであった。Fe(III)の直線性は高濃度でも証明されたが、Fe(II)の較正曲線の傾きは減少した。Fe(II)/(III)の測定に関連するバイオサンプルは通常Fe濃度が低いため、150 μg/Lの上限値で十分であると考えられました。より高濃度の場合には、サンプルをそれに応じて希釈してもよい。ピーク高さの口径測定は600 μg/Lまで点検され、テストされた範囲全体に線形性を示した。これは図 2に示します。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61055/61055fig2v2.jpg"> 図2:Fe(III)とFe(II)のキャリブレーション曲線(ピーク高さ)を示します。両方のFeレドックス種のピーク高さ関連キャリブレーションは、ca.161 *Xの傾きに線状です この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61055/61055fig2v2large.jpg" target="_blank">図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
SH-SY5Y細胞ライセートの解析 SH-SY5Y細胞リセートの分析は、幾分高い導電性のために鉄の酸化還元種のわずかに遅い移動を示した。Fe(III) は移行時間の 124 s で監視され、Fe(II) は移行時間の 158 s で監視されました。SH-SY5Y細胞ライセートの移動時間精度は、Fe(III)の場合は2%、Fe(II)では3%であった。この方法を用いた定量的Fe(II)およびFe(III)測定では、Fe(III)濃度が330μg/L、Fe(II)濃度が84μg/Lで、Fe(II)/Fe(III)比は0.25になります。図3に、それぞれ56のFe選択的電フェログラムが示されている。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61055/61055fig3v2.jpg"> 図3:SH-SY5Y細胞ライセートのFe特異的電解液56。Fe(III)は、123 sが58025 cpsのピーク高さに達し、158 sでFe(II)から明確に分離され、22800 cpsに達すると<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61055/61055fig3v2large.jpg" target="_blank">、この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。</a>

この鉄の酸化還元の種分法は、毛細管電気泳動誘導結合プラズマ質量分析とサンプルスタッキングを1回の実行で短い分析と組み合わせることに基づいています。この方法は、多様な組織および生体流体サンプルにわたる鉄の酸化還元種を迅速に分析し、定量の低い制限を提供します。

鉄レドックス種(Fe(II)、Fe(III)の定量化のためのキャピラリー電気泳動誘導結合プラズマ質量分析(CE-ICP-MS)のセットアップ

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

過剰な鉄は、フェロプトシスとして知られている脂質過酸化による酸化ストレスや細胞死など、細胞内で壊滅的な影響を引き起こす可能性のある遊離酸化活性鉄2プラスをもたらす。鉄と鉄の定量測定は、これらの有害なプロセスに対するより深い洞察を得るための鍵となります。このCE-ICP-Ms技術は、鉄-酸化還元種を定量化するために必要な高速分析と低定量限界の両方を提供します。まず、低い自己吸引容積のネブライザーを選択し、自家製のインターフェイスをマウントするための適切な部品を準備します。下の3方向ルアーバーの左端をオスコネクタに接続し、オスコネクタを上部3ウェイルアーの中央接続に接続して、2つの3ウェイメスルアーコネクタをオスコーンルアーコネクタと接続します。次に、白金線の上に1センチメートルのチューブを置き、1センチメートルのシリコーンチューブを使用して、オスのルアーコネクタの最初のチューブとノズルを接続します。アセンブリをねじ回転により、下部 3 方向ルアー コネクタの中間接続に固定します。1センチチューブをCEキャピラリーの出口に押し込み、端部から8〜9センチメートルの位置に置き、シリコンチューブでオスのルアーコネクタのノズルに接続します。上部 3 方向 T コネクタのバーを通してアセンブリ全体を配置し、オスのルアー コネクタとメスの 3 方向ルアー コネクタの左端をねじ回転で固定します。その後、オスのルアーコネクタのノズルで25センチメートルのシリコーンチューブを固定し、下部3ウェイルアーコネクタからバーの底部にアセンブリ全体を固定します。1センチのシリコーンチューブを、ネブライザーの端に5ミリメートルしっかりと押します。2番目の男性のルアーコーンコネクタは、チューブの突出部分に差し込まれている間。突き出たCEキャピラリーのインターフェース部分をネブライザーのオスコーンに移動し、オスコーンとネブライザーキャピラリーのより広い部分を慎重にキャピラリーに挿入します。必要に応じて、左手の男性ルアーを緩め、付属のチューブを持つルアーを必要な位置に移動し、それを再インストールすることによって、突き出たキャピラリーの長さを調整します。上の女性の三方のルアーコネクタは、雄のコーンにしっかりとフィットする必要があります。セットアップが完了したら、ICP-Ms を使用して続行します。校正曲線は、鉄3種と鉄2種の酸化還元種のために作成された。検出限界は鉄2の1リットル当たり3.1マイクログラム、鉄3の1リットル当たり3.2マイクログラムであり、直線性は1リットル当たり150マイクログラムまで実証された。SH-SY5Y細胞リサテの分析は、幾分高い導電性のために鉄の酸化還元種のためのわずかに遅い移動を示した。鉄3と鉄2の測定濃度は、それぞれ1リットル当たり330マイクログラム、1リットル当たり84マイクログラムであった。鉄の2対3の比率が0.25になります。このプロトコルの最も重要なステップは、マウントされたインターフェイスを介して突き出たCE毛細管の慎重な挿入とネブライザー毛細管に関連する適切な位置です。ここで提示した方法は、鉄依存分子プロセスに対する洞察を深める有望なツールとなり得る。慎重に設計された研究は、鉄2プラス、鉄3プラス定量が神経変性および癌疾患の文脈で鉄媒介致死的損傷のリスクがある組織を特定する潜在的なバイオマーカーとして役立つかどうかを検証するために必要です。

setup-capillary-electrophoresis-inductively-coupled-plasma-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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学ぶCE-ICP-MSによる鉄レドックス種（Fe(II)、Fe(III)）の高速定量法。神経変性疾患やがんにおける鉄依存性細胞死（フェロプトーシス）のメカニズム解明とバイオマーカー探索に応用可能です。

鉄レドックス種(Fe(II)、Fe(III)の定量化のためのキャピラリー電気泳動誘導結合プラズマ質量分析(CE-ICP-MS)のセットアップ

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