骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

このプロトコルに示差遠心分離を使用する利点は、リットルまで簡単に拡張できるため、一次線維芽細胞からエキソソームを単離するのに理想的であることです。精製されたエキソソームは、さまざまな疾患モデルから単離されたさまざまな細胞タイプおよび組織から得ることができます。エクソソームは診断バイオマーカーとして使用できます。

その手順を実証するのは、ディアンサ・ファン・デ・ヴレッケルト、の科学者です ダッツォ研究所 まず、マウスの筋肉の重さを量り、次にそれらを10センチの皿に移します。バイオセーフティフードの下で作業し、メスで筋肉を細かく刻み、細かいペーストを作ります。細かく刻んだ筋肉ペーストを50ミリリットルのチューブに移し、組織1ミリグラムあたり3.5倍の容量で消化液を加えます。

摂氏37度で45分間インキュベートします。完全な解離を助けるために、懸濁液を5ミリリットルのピペットで10分ごとに完全に混合します。.消化液を不活化するには、細胞懸濁液に20ミリリットルのDMEM Completeを加えます。

50ミリリットルのチューブに載せた70マイクロメートルのナイロン製セルストレーナーにピペットで通し、さらに5ミリリットルのDMEM Completeでセルストレーナーを洗浄します。細胞懸濁液を300gで室温で10分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、ペレットを10ミリリットルのDMEM Completeに再懸濁します。

細胞を10センチメートルの皿に播種し、摂氏37度、二酸化炭素5%、酸素3%のインキュベーターに皿を置きます。骨格筋線維芽細胞培養物は、生理学的な光条件を確保するために、低酸素レベルに維持する必要があります。骨格筋の酸素レベルは約2.5%です細胞が100%の合流に達した後、さらに1日間培養し、PBSですすぎ、1ミリリットルのトリプシン溶液を加えます。

細胞を10分間インキュベートした後、10ミリリットルのDMEM Completeを加えてトリプシン化を停止します。細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移し、細胞を300gで室温で10分間遠心分離します。次に、ペレットを20ミリリットルのDMEMコンプリートに再懸濁し、細胞を15センチメートルの皿に播種します。

培養した線維芽細胞から馴化培地を15ミリリットルのチューブに集めます。馴化培地を300gで10分間遠心分離し、生細胞をペレット化します。上清を新しい50ミリリットルのチューブに移し、チューブを2, 000gで10分間遠心分離することにより、死細胞をペレット

次に、上清を38.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、チューブを10, 000gで30分間遠心分離して、オルガネラ、アポトーシス体、および膜片を除去します。エキソソームをペレット化するには、上清を38.5ミリリットルの超透明チューブに移し、100, 000gで1.5時間超遠心分離します。上清を慎重に捨て、約1ミリリットルの馴化培地を残します。

エキソソームペレットを洗浄し、最大30ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁します。エキソソームを再び100、000gで1.5時間遠心分離します。精製を完了するには、エキソソームペレットを乱さないように注意しながら、ピペッティングで上清を取り除きます。

エキソソームペレットのステップは緩く、簡単に取り外すことができます。したがって、PBS上清の除去は、200マイクロリットルのピペットを使用して非常に慎重に行う必要があります。ペレットを氷冷PBSに再懸濁し、線維芽細胞の15cm皿あたり25マイクロリットルを使用します。

最後に、BCA Protein Assay Kitとマイクロプレートリーダーを使用して、562ナノメートルのタンパク質濃度を測定します。このプロトコールは、エキソソームを精製するための再現性が高く、一貫性のある方法です。透過型電子顕微鏡は、これらのエクソソームの比較的均一なサイズを示しています。

エキソソームライセートのイムノブロットは、タンパク質発現の標準的なパターンを示し、LDHおよびカルネキシンタンパク質汚染物質が存在しないことを示しています。エキソソームはショ糖密度勾配によって分離され、個々の画分はAlix、CD9、およびCD81に対する抗体を用いたウェスタンブロットでプローブされました。エクソソームは一貫して3〜6の画分で沈降しました。

単離および濃縮された生理活性エキソソームは、電子顕微鏡や質量分析分析、機能研究のためのin-vitroおよびin-vivo取り込み実験に使用できます。このプロトコールは、低分泌細胞からのエキソソームの単離に適しており、ヒト線維性疾患におけるエキソソームの関与を調査するために適用できます。