Name: EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学ぶ EYFP-CENP-Aのユビキチン化部位を質量分析で同定する手法。K124R変異体を用いてセントロメア機能と細胞生存に必須な翻訳後修飾を解明し、タンパク質安定性のメカニズム理解に貢献します。

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南京大学モデル動物研究センターのChao-Jun Liに質量分析に感謝します。ヤンミニ・ダラル、深川達夫、そして南京大学・グリーヒー小児がん研究所のモデル動物研究センターの研究者の皆さんに、有益な議論、実験指導、試薬をありがとうございました。ドン・W・クリーブランド,ダニエレ・ファキネッティ,ヤンミニ・ダラル,ミン・ブイ,グスタボ・W・レオーネ,ジョン・トンプソン,ローレンス・S・キルシュナー,アムルタ・アシュテカール,ベン・E・ブラック,グレニス・A・ログドン,田先健二,ドーン・S・チャンドラーに試薬の寛大な贈り物に感謝します。Y.N. 江蘇省「二重一流」建設基金、江蘇省自然科学基金(SBK2019021248)、江蘇省第16回シックス・ビッグ・タレント・ピークス・ファンド(TD-SWYY-001)、江蘇省「外国人専門家百人財プログラム」基金(SBK2019010048)、国立自然科学財団(3666年)この研究の一部は、NCI助成金R21 CA205659によってサポートされました。

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

ここでは、EYFPタグ付けがCENP-A K124R変異タンパク質8の異なるリジンでのユビキタス化を誘導することを示唆するEYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタンスを同定するための質量分析分析の方法を説明した。結果として、質量分析によりCENP-Aのリジン56(K56)に対応するEYFP-CENP-A K124Rのリジン306(K306)のユビキタンスを同定しました。ここで説明する質量分析法は、以前にCENP-A WT-Flag12のリジン124(K124)のユビキタスサイトを同定した模擬法である。12したがって、この方法は、異なるタグおよび他のセントロメアキネトコレタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。LC-MS/MSに基づく質量分析は、広い範囲のタンパク質の潜在的な翻訳後修飾(PTM)を同定するために一般に受け入れられています。いくつかのアッセイ/分析(すなわち、インビボのユビキタス化アッセイ、コロニー成長アッセイ、質量分析)からなる組み合わせ方法は、標的タンパク質のユビキタス化の機能的役割を特定...

ほとんどの真核生物では、スピンドル微小管は、セントロメアと呼ばれる各染色体の単一領域に付着する必要があります。キネトコレは、セントロメアに位置するタンパク質の複合体です。セントロメアとキネトコレタンパク質の動きのタイミングとキネトコレスとセントロメレスの構造を研究することは、染色体不安定性(CIN)および癌進行を理解するために重要です。重要な問題は、染色体の位置と中心の機能(すなわち、セントロメアの同一性)がどのように決定され、それらが正確な染色体分離にどのように関与しているかである。ほとんどの種では、CENP-Aと呼ばれる特定のヒストン様タンパク質を含む特殊なヌクレオソームの存在がセントロメア同一性を定義する。そこで、CENP-Aが中心同一性の非DNA指標(エピジェネティックマーク)であることを提案する。CENP-Aがヒトのセントロメア同一性をどのように定義するかを解明することが重要です。
ホリデイ接合認識タンパク質(HJURP)は、CENP-A特異的シャペロンであり、CENTP-Aを中心核組中11、2、32,3に沈着させる。我々は、リジン124(K124)およびセントロメレローカリゼーション4のCENP-A ubiquityationに、CUL4A-RBX1-COPS8 E3リガーゼが必要であることを以前に報告している。また、我々の結果は、新たに合成されたCENP-Aのセントロメア募集には、既存のユビキタスCENP-A5が必要であることを示した。したがって、CENP-Aのユビキタス化は細胞分裂間の二量体化によって継承されることを示唆するモデルが提供された。
我々の調査結果及びYuらのそれとは対照的に、CENP-Aとその中心局在化に関する否定的な結果が最近発表された6.記事は、リジン124(K124)に対するCENP-A修飾は、K124Rの突然変異がCENP-Aの局在性に影響を及ぼさなかったことを示す否定的な結果に基づいて、ヒトセントロメレの確立、維持、および長期機能に欠かせないと主張した。しかし、彼らの結果と結論には議論の余地が十分にあり、我々はすでに彼らの前の出版物7にどのような問題があるかを説明しました。彼らは内因性CENP-Aのサイズよりもはるかに大きな分子量を持つCENP-Aとタンパク質を融合させることに注意を払う必要があります:例えば、彼らは〜30 kDa強化黄色蛍光タンパク質(EYFP)を〜16 kDa CENP-Aに融合し、RPE-1 CENP-A-Fノックアウト中のEYFP-CENP-A K124R融合タンパク質を分析しました。K124ユビキチンは、構造予測4に基づいてHJURPに直接結合するとは考えられていないが、モノユビキチンの添加はCENP−Aのタンパク質の立体構造に影響を与えると予測される。CENP-Aの立体構造は、大きな融合タンパク質の存在によって変化する可能性があり、この立体構造変化は、ユビキサリ化の喪失によって引き起こされる構造変化を隠す可能性がある。我々は、大型タンパク質の融合が、EYFP-CENP-A K124R変異体におけるK124以外のリジンでのユビキスチン化を誘導し、別の部位におけるこのユビキタス化が、元のK124R単一変異型を阻害/マスクすることを示唆する。大きなタグタンパク質を有するCENP-A K124R変異タンパク質(EYFP)の異なるリジンにおいてユビキタンスが起こるという証拠は、我々の前の出版物8で報告された。EYFPタグはEYFP-CENP-A K124Rの別のリジン部位のユビキチン化を誘導し、EYFP-CENP-A K124R変異体がHJURPに結合することを発見した。その結果、別の部位でのこのユビキタス性は、元のK124R単突然変異表現型を阻害/マスクし、EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体の両方がセントロメア局在化を示した(pBabe-EYFP-CENP-A WTおよびK124R変異体をpBabe-EYFP対照と共に使用し、比較した)。この結果は、Flagタグ付きまたはタグなしCENP-A K124R変異体が致死的であるが、モノウビキチン融合によって救出できることを示し、CENP-Aのユビキタス化が細胞生存に不可欠であることを示唆した。
近年、多くの研究では、IN IN 9、10、11の両方で、CENP-Aタンパク質および他のセントロメアキネトコレタンパク質の翻訳後修飾(PTM)を同定するための異なるアッセイ,10を11開発している。9クロマチンの機能を調節する主要なメカニズムであるヒストンタンパク質のPTMに類似した、中心クロマチン成分のPTMはまた、全体的な構造と中心の機能を調節するために不可欠なメカニズムに関与しています。CENP-A PTM部位の大部分はCENP-A含有ヌクレオソームに特異的であるが、それらのいくつかはヒストンH3で保存されているが、これらの残基の修飾が中心基質特異的な機能に寄与することを示唆している。リン酸化、アセチル化、メチル化、およびユビ価化を含むCENP-AのPTMは、以前に報告された9であり、CENP-Aがそのアミノ末語およびC末語ヒストンフォールドドメイン上の様々なPTMおよびその組合せ配列を受けていることを示唆した。複数の機能におけるCENP-Aの変更の重要性は、我々を含む多くのグループによって明らかにされた。これらの機能は、セントロメアでのCENP-A沈着、タンパク質安定性、およびCCAN(構成中心性関連ネットワーク)9の募集を伴う。しかし、CENP-A PTMの限られた研究と所見は、直接的または間接的にその機能を調節する正規のヒストンの1つと比較される場合に前形化される。これらのCENP-A PTMを特定するための方法論に焦点を当てた技術報告書も制限されています。
CENP-Aの積み重ねには、細胞分裂5の間の二量体化によって継承され、細胞生存率8に不可欠なCENTP-A沈着にはCENP-Aのユビメンテーションが必要であるため、CENP-Aのユビキタス性を同定する方法は、将来的には、中心の機能活性、位置、構造を研究するために不可欠である。そこで、ここでは、EYFPタグ付けがCENP-A K124R変異タンパク質8中の異なるリジンでのユビキタス化を誘導することを示唆するEYFP-CENP-A K124R変異体のユビキタス性を同定するための質量分析分析について説明する。他の制御アッセイおよび分析のプロトコル(免疫蛍光分析、コロニー成長アッセイ、インビボのユビキタスアッセイ)も提示され、主要な質量分析分析の結果を適切に議論する。

<table><tbody><tr><td>Equpiments/Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml タンパク質低結合チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td>質量分析用</td></tr><tr><td>10cm細胞培養皿</td><td>BIOFIL/JET, China</td><td>700224</td><td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td></tr><tr><td>6 well Cell Culture Cluster</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>6-well cultureプレート</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO</td><td>-</td><td>質量分析用真空乾燥ペプチド用卓上真空濃縮器</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &mu;m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120</td><td>質量分析用液体クロマトグラフィー(RPLC)カラム</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x 油浸レンズ</td><td>ライ</td><td>カ LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X 油浸レンズ</td></tr><tr><td>HCX PL APO 63x 油浸レンズ</td><td>ライカ</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X 油浸レンズ</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF トランスファーメンブレン</td><td>EMD ミリポア</td><td>IPVH00010</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>ライカ DM IRE2 電動蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>電動蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>ライカ EL6000 コンパクト光源</td><td>ライカ</td><td></td><td>蛍光励起用外部光源</td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス (22 mm x 22 mm)</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>カバーガラス (22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>モデル V16-2 ポリアクリルアミドゲル電気泳動装置</td><td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td><td>31071010</td><td>ゲル電気泳動装置 I より大きなSDS-PAGEゲル</td></tr><tr><td>を適用する nanoLC.2D</td><td>Eksigent Technologies</td><td>-</td><td>質量分析用液体クロマトグラフィーシステム</td></tr><tr><td>NuPAGE 4%-12% Bis-Trisタンパク質ゲル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>NP0335BOX</td><td>質量分析</td></tr><tr><td>用の市販の4%-12% Bis-Trisタンパク質ゲルオリンパス FLUOVIEW FV3000 共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>-</td><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ ダウンロード/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>ORCA-R2 デジタルCCDカメラ</td><td>浜松</td><td>C10600-10B</td><td>CCDカメラ</td></tr><tr><td>PAP ペン</td><td>結合部位</td><td>AD100.1</td><td>免疫蛍光染色組織における撥水バリア用</td></tr><tr><td>培養皿 10CM</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td>10 cm 組織培養皿</td></tr><tr><td>ゲルランニング用垂直電気泳動 (ビッグサイズ)</td> <td>中国 駿義</td><td>JY-SCZ6+</td><td>ゲル電気泳動装置 II より大きな SDS-PAGE ゲル (洋平研究室、PE23)</td></tr> <tr><td>VWR マイクロスライド、つや消し</td><td>VWR インターナショナル</td><td>48312-013</td><td>マイクロスライド</td></tr> <tr><td>Primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗CENP-A抗体</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>マウスモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗CENP-B抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>マウスモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>ウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗GAPDH</td>ウサギポリクローナル抗体 <td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>ウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>ANTI #76 (自家製抗体)</td><td></td><td>ウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗HA (3F10)</td><td>Roche</td><td>11815016001</td><td>ラットモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗HJURP</td><td>Proteintech Group</td><td>15283&ndash;1-AP</td><td>ウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>抗ユビキチン</td><td>ベチル研究所</td><td>A300-317A-1</td><td>ウサギポリクローナル抗体</td></tr><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad タンパク質アッセイ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>500-0006</td><td>タンパク質濃度の測定用市販タンパク質アッセイ試薬 I (0.1% SDSと互換性あり)</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>ソニケーター</td></tr><tr><td>ブランソン 超音波ソニケーター マイクロチップ ステップ、ソリッド、ねじ式 9.5 mm</td><td>VWR サイエンティフィック プロダクツ</td><td>33995-325</td><td>超音波処理用ディスラプターホー</td></tr>ンブラン<tr><td>ソン超音波超音波発生器マイクロチップテーパー6.5 mm</td><td>VWRサイエンティフィックプロダクツ株式会社</td><td>33996-185</td><td>超音波処理用マイクロチップ</td></tr><tr><td>バッファー A1</td><td>-</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl、pH 7.4、50 mM NaCl、0.5% ノニデット P-40、0.5% デオキシコール酸、0.5% SDS、1 mM EDTA、完全 EDTA-free プロテアーゼ阻害剤試薬 完全 EDTA-free プロテアーゼ阻害剤</td></tr>試薬 <tr>完全<td>EDTA-free プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td>バッファー A1</td></tr><tr><td>クマシー ブリリアント ブルー R-250</td><td>BBI ライフサイエンス</td><td>用CAS 6104-59-2</td><td>質量分析用クーマシーブルー溶液</td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット溶液 (2.3% クリスタルバイオレット、0.1% オキシ酸アンモニウム、20% エタノール)</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>コロニー染色用</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>核染色用</td></tr><tr><td>DMEM: F12 中型</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM: F12 中</td></tr><tr><td>型ウシ胎児血清、認証済み、熱不活化、米国原産</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS(ウシ胎児血清)</td></tr><tr><td>高グルコースDMEM(Dulbecco'修正されたイーグル」Life</td> <td>Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>High-glucose DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfection reagent I for chemical transfection</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Transfection reagent II for chemical transfection</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Fixationreagant</td></tr><tr><td>無脂肪粉乳(カーネーション粉ミルクの代替品として承認</td>)<td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871(再注文番号190915;Lot# 90629)</td><td>脱脂脱脂乳</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>還元血清培地</td></tr><tr><td>p-フェニレンジアミン</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン、ストレプトマイシンの封入用;Liquid</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicillin-streptomycin</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, 水中</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン [PEI]; 1.0 mg/ml</td><td>Polysciences</td><td>23966&ndash;2</td><td>化学トランスフェクション用トランスフェクション試薬 III</td></tr><tr><td>プロテインAセファロースCL-4Bビーズ</td><td>GE Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td><td>プロテインAセファロースCL-4Bビーズ、pQCXIP-EYFP-CENP-Aを用いたin vivoユビキチン化アッセイ用</td></tr><tr><td>ウェスタンブロットストリッピングバッファーの復元</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>ウェスタンブロットストリッピングバッファーI</td></tr> シー<tr><td>ケンシンググレードトリプシン</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>質量分析用</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>超高感度化学発光(ECL)基質</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>滅菌組織培養グレード水</td></tr><tr><td>ウェスタンブロットストリッピングバッファー II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-メルカプトエタノール)</td><td>-</td><td>-</td><td>Western Blot Stripping Buffer II</td></tr><tr><td>Secondary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG Life Technologies</td><td>/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>蛍光色素標識二次抗体 (Affinity-purified secondary antibody)</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW software</td><td>Olympus-Sofware</td><td></td> <td>C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>Analysis FV31S-DT software</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>ソフトウェアC2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ ダウンロード/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td><td></td> <td>Olympus-Sofware</td> <td>C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ ソフトウェア/cellsens/)</td></tr><tr><td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td><td>LI-COR Biosciences-Software</td><td></td> <td>D</td></tr><tr><td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>イムノブロット検出用化学発光イメージャー</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 赤外線イメージングシステム</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>-</td><td>イムノブロット検出用赤外線イメージングシステム</td></tr><tr><td>OpenCFU saftware</td><td>-</td><td>-</td><td>コロニーカウント用 (http://opencfu.sourceforge.net/)</td></tr><tr><td>Openlab version 5.5.2.サイエンティフィックイメージングソフトウェア</td><td>Improvision/PerkinElmer-Software</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>A ProteinPilotソフトウェアバージョン4.5</td><td>AB SCIEX</td><td>-</td><td>ソフトウェアF 質量分析分析用</td></tr><tr><td>Quantity One 1-D解析ソフトウェア</td><td>Bio-Rad-Software</td><td></td> <td>E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ System</td><td>AB SCIEX-Mass</td><td></td> <td>spectrometry instrument</td></tr><tr><td>Volocityバージョン6.3 3D画像解析ソフトウェア(Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer</td><td>-</td><td>ソフトウェアB1</td></tr><tr><td>Volocityバージョン6.3 3D画像解析ソフトウェア(Volocity Quantification)</td><td>PerkinElmer</td><td>-</td><td>ソフトウェアB2</td></tr></tbody></table>

eyfp タグ付き cenp-a (eyfp-cenp-a) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

キネトコレスとセントロメアの構造とダイナミクスを研究することは、染色体不安定性(CIN)および癌進行を理解する上で重要である。染色体の位置と中心の機能(すなわち、セントロメアの同一性)がどのように決定され、正確な染色体分離に参加しているかは、根本的な問題である。CENP-Aは、中心性同一性の非DNA指標(エピジェネティックマーク)であることが提案されており、細胞分裂間の二量体化によって継承されたCENTP-A沈着にはCENP-Aのユビキテレンスが必要であり、細胞生存能に不可欠である。
ここでは、CENP-A K124R変異タンパク質におけるEYFPタギングのために異なるリジンでのユビキタス化が誘導されることを示唆する、EYFP-CENP-A K124R変異体のユビ分量を同定するための質量分析分析について述べている。EYFP-CENP-A K124Rにおけるリジン306(K306)のユビキタス化が同定され、これは、質量分析を通じてCENP-Aのリジン56(K56)に相当する。GFP/EYFPの使用、またはタンパク質の機能を分析するツールとしての高分子量タンパク質のタグ付けについて注意点が説明されています。現在の技術的限界は、ユビキタスバンドの検出、部位特異的なユビキタス性の同定、および細胞全体の周期の間に生きている細胞または特定の単一細胞におけるユビキタス化の視覚化についても議論されている。
ここで提示される質量分析法は、異なるタグおよび他のセントロメアキネトコレタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。いくつかのアッセイ/分析からなるこれらの組み合わせ方法は、ユビキタスの機能的役割を特定することに興味を持っている研究者に推奨される可能性があります。

EYFP-CENP-A K124変異体は、ユビエキタリミン、HJURPとの相互作用、およびセントロメア局在化の欠陥を示さない細胞致死性を示す。ここでファキネッティらによって報告されたシステム(2017)66は再構成された:1つの破壊を運ぶ二倍化ヒト(RPE-1)細胞と1つの'floxed'CENP-Aアレル(CENP-A-/F)、EYFP-CENP-AはpBabe-EYFPウイルスベクターから発現した。CENP-A-/F CENP-Aこのシステムでは、CENP-A-/Fアレルからの内因性CENP-Aの発現は、クレリコンビナーゼ6によって破壊される可能性がある。内因性CENP-Aの喪失を救うEYFP-CENP-A WTまたはK124R変異体(図1A)の遺伝子構築物は、レトロウイルス集積が行われたときに安定的に発現した。CENP-A-/Fア...

CENP-Aのユビキタスは、細胞分裂間の二量体化によって受け継がれ、細胞の生存率に不可欠なセントロメレでのCENP-A沈着にとって重要な要件です。ここでは、EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) タンパク質のユビキタス性を同定するための質量分析分析について説明します。

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

この方法により、EYFPタグ付きCENP-Aタンパク質のユビキタス性を同定することが可能になります。また、異なるテストおよび他のタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。この主な利点は、重要な生物学的意義を有するEYFP CENP-A K124Rのユビキタスサイトを同定するために使用することができるということです。これは、機能性タンパク質の広い範囲の翻訳後修飾を調査するために拡張することができます。まず、抗GFP抗体と結合したプロテインAビーズを調製する。25マイクロリットルのタンパク質Aビーズを、バッファーA1を少なくとも3回洗浄してエタノールを除去する。その後、バッファー A1 を使用して 50% ビーズ溶液を作ります。2マイクロリットルの抗GFP抗体をビーズに加えます。次に、バッファ A1 をネットビードボリュームの 20 倍に追加します。4~18時間、摂氏4度でエンドツーエンド回転を行います。回転の最適な持続時間は、免疫沈降の効率に基づいて経験的に決定されなければならない。回転後、100回gでビーズを遠心分離し、バインドされていない上清を取り除きます。バッファーA1を加えてビーズの50%溶液を作り、免疫沈降反応ごとにこの溶液の25マイクロリットルを使用します。免疫沈降を行うために、超音波処理および凍結/解凍を介して緩衝液A1中の細胞をライスする。タンパク質濃度を測定し、異なるIPサンプル間のタンパク質量を正規化します。次に、SDS ページで実行する各チューブからサンプルの 5% を削除します。残りのライゼートを抗GFP抗体に結合した25マイクロリットルのプロテインAビーズと混合し、4〜18時間摂氏4度でエンドツーエンドの回転を行います。バッファーAに細胞をライシングし、前述のように免疫沈降を行った後、EYFP CENP-Aのユビキタス性を確認し、ユビキタス化されたEYFP CENP-Aの位置を正確に決定するために、全免疫沈降剤の10%を保持します。質量分析分析には、他の 90% を使用します。市販の4-12%Bis-Trisタンパク質ゲルで質量分析サンプルを実行します。次に、クマシーブルー染色を行い、質量分析のために50〜70キロダルトンゲル領域を切除します。各ゲルスライスを小さくスライスし、0.5ミリリットルの低タンパク質結合チューブに入れる。25ミリモルの重炭酸アンモニウムで50%アセトニトリルの100マイクロリットルでゲル片を洗います。10〜15分間ボルテックスします。その後、それらをスピンダウンし、上清を捨てます。最後の洗浄後、ベンチトップ真空濃縮器でゲル片を30分間乾燥させます。マイクロリットルシーケンシンググレードのトリプシンあたり10ナノグラムの10マイクロリットルを加え、ゲル片を5分間水分補給させます。その後、25ミリモルル重炭酸アンモニウムを追加し、ゲル片を覆い、一晩で摂氏37度でそれらを消化するのに十分です。翌日、消化した上清をクリーンな0.65ミリリットルシリコンチューブに移し、50%アセトニトリルと5%のギ酸溶液を加えます。10分間、サンプルを渦に入れます。その後、それをスピンダウンし、抽出チューブに上清を転送します。サンプルを2マイクロリットルに再び濃縮します。その後、3%アセトニトリルと2%ギ酸溶液の8マイクロリットルを加えます。15分間ボルテックスし、30分間16,000回gでスピンダウンします。液体クロマトグラフィーシステムと質量分析装置を併用して、LC-MS/MSでMSデータ取得を行います。逆相液体クロマトグラフィーカラムにサンプル8マイクロリットルを注入し、原稿の指示に従って60分で2〜80%の溶媒Bの勾配でペプチドを分離します。データ依存取得モードを使用して質量分析データを収集します。デスクトップ上の質量分析データを分析する商用ソフトウェアを開きます。新しい検索を開始するには、上部メニューの LC ボタンをクリックします。次に、[追加] ボタンをクリックして、元の MS 生データ ファイルをアップロードします。データベース検索方法としてパラゴン法でヒトタンパク質IDを選択し、元のMS生データファイルをUniProt homo sapiensデータベースに対して検索します。消化酵素としてトリプシンを選択し、原稿の指示に従ってパラメータの残りの部分を設定します。結果のファイル名を入力し、メニューの右側にある[名前を付けて保存]ボタンをクリックします。次に、検索結果を保存するフォルダを選択し、[保存] ボタンをクリックします。プロセスボタンをクリックして検索を開始します。検索が終了すると、入力した検索名を持つデータが、選択したフォルダに自動的に保存されます。特定のペプチドのMS/MSスペクトルを取得するには、ソフトウェアFで検索結果を開き、トップメニューのタンパク質リストのタンパク質をクリックし、中央のメニューでペプチドをクリックします。このペプチドのMS/MSはメニューの下部に表示されます。MS/MS スペクトルをエクスポートして保存するには、スペクトルをコピーして適切なファイル形式に貼り付けます。内因性CENP-Aの喪失を救うEYFP CENP-A野生型またはK124R変異体の遺伝子構築物は、レトロウイルス集積が行われたときに安定的に発現した。内因性CENP-Aの発現は、クレリコンビナーゼの誘導の7日後には検出されなかった。EYFP CENP-A野生型およびK124Rタンパク質発現の両方が、初期の内因性CENP-Aタンパク質と同様のレベルであることが判明した。EYFP CENP-A野生型およびK124R変異体はいずれも、内因性CENP-Aの残りの発現の破壊後7日でセントロメア局在化を示した。EYFP CENP-A野生型およびK124R変異体は、フラグ付きタグ付きまたはタグなしCENP-A野生型およびK124R突然変異体の場合とは異なり、HJURPとのユビキタス化および相互作用を示した。細胞生存率は、残存する内因性CENP-Aアリールの破壊の14日後にコロニー成長アッセイを行うことにより評価した。EYFP CENP-A野生型およびK124R変異体の両方が、残存する内因性CENP-Aアレーレの破壊の14日後に同様の数の救出されたコロニーを示した。IP質量分析法は、CENP-AマイナスF細胞のEYFP CENP-A K124Rのリジン306でのユビキタス性を明らかにした。これらの結果は、大きなタンパク質の融合が、元のK124R単一変異型表現型を阻害するCENP-AのK124R以外のリジンでのユビキタンス化を誘導することを示唆した。このプロトコルを試す場合、市販の4%12%Bis-Trisタンパク質ゲルを使用して質量分析サンプルを実行します。ゲル部分に適切なトリプシンを加え、すべての酵素が吸収されるまで水分補給します。低分子量タグ付けまたはプロービング技術は、実際にはユビキタスを視覚化し、生物レベル全体で空間的時間的タンパク質のユビキタスシグナル伝達を調査するために必要です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

FRETの定量分析（フェルスター共鳴エネルギー転移）信号を含む新規な方法は、酵素反応速度論を研究するために記述されている。...

SENP1プロテアーゼキネティクス決定のための定量的なFRET（フェルスター共鳴エネルギー移動）の分析

この原稿は、出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）において、動原体タンパク質、Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出について説明します。...

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

ここでは、ヒト細胞内の内因性および外因性のセントロメア-動糖体タンパク質を検出し、固定(パラホルムアルデヒド、アセトン、またはメタノール固定)の使用による間接免疫蛍光染色により、セントロメア-キネトコアでのこれらのタンパク質レベルを定量するプロトコールを報告します。...

内因性の免疫蛍光分析および外因性セントロメア、動原体タンパク質

複数の調査、ターゲット蛋白質の翻訳後修飾を内因性は非常に挑戦的なすることができます。ここで説明したテクニックを活用開発特定 PTM ターゲットでターゲットのアセチル化、ユビキチン化、sumo 化 2/3、およびチロシンのリン酸化の変更を検出する親和性のマトリックス最適化された換散バッファーとフィルター システム1...

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1...

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。...

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。...

疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

学ぶ EYFP-CENP-Aのユビキチン化部位を質量分析で同定する手法。K124R変異体を用いてセントロメア機能と細胞生存に必須な翻訳後修飾を解明し、タンパク質安定性のメカニズム理解に貢献します。

EYFP タグ付き CENP-A (EYFP-CENP-A) のユビキタス性を同定するための質量分析分析

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