Name: ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ ヒトiPS細胞からの小脳オルガノイドのスケーラブルな生成法。使い捨てバイオリアクターを用いた化学的定義条件下での分化誘導と免疫染色による特徴付けのプロトコルを解説します。

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この作品は、フンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア(FCT)、ポルトガル(UIDB/04565/2020)がプログラム・オペラシオナル・リージョナル・デ・リスボア2020、プロジェクトN.007317によって支援されました。 PD/BD/105773/2014からT.P.SとPD/BD/128376/2017からD.E.S.N.へ、FEDER(PORリスボア2020)が共同出資するプロジェクト 2020)とFCTは、PAC精密リスボア-01-0145-FEDER-016394および運動失調研究のための小脳オルガノイドのCEREBEX世代を通じてLISBOA-01-0145-FEDER-029298を付与します。欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラムからも資金が寄せられたのは、助成金協定番号739572(再生精密医療発見センターH2020-WIDESPREAD-01-2016-2017)の下で行われました。

1. 単層培養におけるヒトiPSCの継ぎ手と維持
<ol><li>プレートの準備<ol>
<li>4 °Cで基部膜マトリックス( 材料表を参照)ストックを解凍し、60 μLアリコートを調製します。アリコートを-20°Cで凍らせます。</li>
		<li>6ウェルプレートのウェルをコーティングするには、氷の上に基部膜マトリックスの1アリコートを解凍します。解凍すると、60 μL を 6 mL の DMEM-F12 に加えます。上下にピペットを入れ、穏やかに再中断します。</li>
		<li>希釈した基質膜マトリックス溶液を6ウェルプレートの各ウェルに1mL添加し、RTで少なくとも1時間インキュベートしてから、4°Cで最大1週間保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>EDTAによるiPSCコロニーの通過<ol>
<li>インキュベーター内の6ウェルプレートでiPSCを37°C、湿度95%、CO25%で維持します。 注: このプロトコルでは、3 つの異なる人間の iPSC ラインが使用されました: F002.1A.1321、ヒトエピソーム iPSC ライン (iPSC6.2)22、および市販の iPS-DF6-9-9T.B ( 資料表を参照) 。</li>
		<li>合格する前に、保存されたプレート(ステップ1.1)を室温(RT)で15分間インキュベートし、mTesR1培地を準備する(表1)。</li>
		<li>血清ピペットを使用してプレートから溶液を吸引し、すぐに各ウェルにmTeSR1培地の0.5 mLを加えます。</li>
		<li>使用済み培地をiPSCを含むウェルから吸引し、1ウェルあたり0.5mM EDTAの1mLを使用して1回洗浄します。</li>
		<li>各ウェルに0.5 mM EDTAの1 mLを加え、RTで5分間インキュベートします。</li>
		<li>EDTAを吸引し、mTeSR1培地を加え、P1000マイクロピペットを用いてコロニーをピペット化することにより、ウェルから細胞を除去する。円錐形の管の細胞を集める。 注:3倍以上のピペットセルを上下にしないでください。</li>
		<li>各ウェルに1mLの細胞懸濁液(希釈1:4)を加え、各ウェルに細胞懸濁液を加えた後に1.5mLの培地が含まれるようにします。5%CO2、37°Cで細胞を2インキュベーターに戻す。</li>
		<li>75%~80%の合流が達成された場合、毎日使用済み培地と3日ごとに通過を交換してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>バイオリアクターにおけるヒトiPSCの播種
<ol><li>10 μMのROCK阻害剤Y-27632(ROCKi)を補ったmTeSR1で単層として成長したインキュベートiPSC。6ウェル組織培養プレートから各ウェルに1mLの添加培地を加え、37°C、湿度95%、CO25%で1時間インキュベートします。 注意:ロッキは、アポトーシス23から解離されたiPSCを保護するために使用されます。</li>
	<li>1時間のインキュベーションの後、各ウェルから使用済み培地を吸引し、1×PBS1ウェルあたり1mLで1倍洗浄する。</li>
	<li>6ウェルプレートの各ウェルに細胞剥離培地( 材料表を参照)の1 mLを加え、37°Cで細胞が穏やかな揺れでウェルから容易に切り離されるまで7分間インキュベートします。</li>
	<li>ピペット細胞は、P1000マイクロピペットで上下に、細胞が分離し、単一細胞に解離するまでピペットを使用する。完全な細胞培養培地を各ウェルに2 mL加えて酵素消化を不活性化し、細胞を滅菌状の円錐管に優しくピペットします。</li>
	<li>210×gで遠心分離g機を3分間、上清を取り除く。</li>
	<li>細胞ペレットを培養培地中で再懸濁し(すなわち、mTeSR1は10μMのROCKiを補充)、トリパンブルー色素を用いて血球計でiPSCをカウントする。</li>
	<li>種子15×106個 の単細胞(最大体積100mL)を有する60mLのmTeSR1は、最終的な細胞密度250,000細胞/mLで10μMのROCKiを補った。</li>
	<li>インキュベーターに置かれたユニバーサルベースユニットにiPSCを含む容器を37°C、湿度95%、CO25%に挿入します。 注:バイオリアクターの攪拌は、iPSC凝集を促進するためにユニバーサルベースユニット制御を27rpmに設定することによって24時間維持されます。</li>
</ol>3. 小脳オルガノイドにおけるヒトiPSC由来骨体の分化と成熟
<ol><li>単一セルシードの日を 0 日として定義します。</li>
	<li>1日目に、血清ピペットを用いて1mLのiPSC凝集体試料を採取する。サンプルを採取する前に、凝集体を含むバイオリアクターを用いてユニバーサルベースユニットを無菌流に置くことによって、以前のように攪拌下でバイオリアクターを維持する。超低い取り付け24ウェルプレートにセル懸濁液を入れます。iPSC 由来の集合体が形成されていることを確認します。</li>
	<li>総拡大40倍または100倍の光学顕微鏡で画像を取得し、凝集直径を測定します。</li>
	<li>FIJIソフトウェアを使用して、各画像の集計の面積を測定します。<ol>
<li>を選択して 、分析|メニューバーから「測定」を設定し、「面積」と「OK」をクリックします。</li>
		<li>"ファイル |メニューバーから " を 開いて、保存されたイメージファイルを開きます。ツールバーに表示される線選択ツールを選択し、イメージに表示されるスケール バーの上に直線を作成します。を選択して 、分析 |メニューバーから スケールを設定します。</li>
		<li>「既知の距離」では、μmで画像のスケールバーの広がりを追加します。「長さの単位」を μm として定義します。設定を維持するには、[グローバル] をクリックし、[OK] をクリックします。ツールバーで[楕円の選択]を選択します。</li>
		<li>各集計に対して、楕円形ツールを使用して領域を線引します。を選択して 、分析 | ".集計がほぼ球面であることを考慮して、測定面積に基づいて直径を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61143/61143equ01.jpg"> A を集計の面積として使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>凝集体の平均直径が100 μmの場合、使用済み培地の80%をROCKiなしで新鮮なmTeSR1に置き換えます。凝集体の直径が200~250μmに達したら、使用済み培地をすべてgfCDM(表1)に置き換え、オルガノイドをバイオリアクターの底に落ち着かせる。 注:平均総直径が350 μmを超える場合は、分化プロトコルを開始しないでください。単一セルのシード処理を繰り返します。一般的に、総計が平均直径100μmに達するまでに約1日かかります。</li>
	<li>37°C、湿度95%、および5%CO2でインキュベーターに入れられたユニバーサルベースユニットに凝集体を含むバイオリアクター2を挿入する。</li>
	<li>バイオリアクターの攪拌を25rpmに減らす。</li>
	<li>2 日目に、手順 3.2、3.3、および 3.4 を繰り返して、集計直径を評価します。FGF2の30 μL(最終濃度、50 ng/mL)と60 μLのSB431542(最終濃度、10 μM)を60 mLのgfCDM分化培地(表1)に加える。バイオリアクターからすべての使用済み培地を、補足されたgfCDMに置き換えます。ステップ 3.6 を繰り返します。 注:SB431542は、神経分化を誘導する、間皮間分化を阻害するために重要です。FGF2は、神経上皮組織25の尾体化を促進するために使用される。</li>
	<li>5 日目に、ステップ 3.2、3.3、3.4、および 3.8 を繰り返します。 注: 分化プロトコルの間に集計サイズが大きくなるはずです。しかし、このパラメータは分化の有効性に影響を与える可能性があるため、直径は分化が始まるときにのみ重要です。</li>
	<li>7 日目に、ステップ 3.2、3.3、および 3.4 を繰り返します。希釈FGF2およびSB431542を2/3に:GfCDM分化培地の60 mLにSB431542のFGF2および40 μLのFGF2および40 μLを加える。バイオリアクターからすべての使用済み培地を補助gfCDMに置き換えます。ステップ3.6を繰り返し、バイオリアクター攪拌を30rpmに増やす。</li>
	<li>14日目に、ステップ3.2、3.3、および3.4を繰り返します。GfCDM分化培地の60 mLにFGF19(最終濃度、100 ng/mL)の60 μLを加えます。FGF19を補充gfCDMでバイオリアクターからすべての使用済み培地を交換してください。ステップ 3.6 を繰り返します。 注:FGF19は、中脳構造26の分極化を促進するために使用されます。</li>
	<li>18日目に、ステップ3.2、3.3、3.4、および3.11を繰り返します。</li>
	<li>21日目に、ステップ3.2、3.3、および3.4を繰り返します。バイオリアクターからすべての使用済み培地を完全な神経基底培地に置き換える(表1)。ステップ 3.6 を繰り返します。 注:神経基底培地は、オルガノイド7内の神経細胞集団を維持するために使用される基底培地である。</li>
	<li>28日目に、ステップ3.2、3.3、および3.4を繰り返します。完全な神経基底培地の60 mLにSDF1の180 μL(最終濃度、300 ng/mL)を加える。バイオリアクターからすべての使用済み培地を、SDF1で補充された完全な神経基底培地に置き換えます。ステップ 3.6 を繰り返します。 注: SDF1 は、個別のセル 層27の編成を容易にするために使用されます。</li>
	<li>35日目に、ステップ3.2、3.3、および3.4を繰り返します。バイオリアクターからすべての使用済み培地を完全なBrainPhys培地に置き換える(表1)。ステップ 3.6 を繰り返します。 注:脳Physは、共感覚的に活性なニューロン28をサポートする神経培地です。</li>
	<li>3日毎に総容積の1/3を90日目まで完全なBrainPhys培地に置き換えます。</li>
</ol>4. 凍結切除・免疫組織化学のためのオルガノイドの調製
<ol><li>免疫染色のためのオルガノイドの収集<ol>
<li>バイオリアクターから15 mL円錐形チューブに血清ピペットを含むオルガノイドを含む培地のサンプル1 mLを収集します。 注:オルガノイドは、日7、14、21、35、56、70、80、および90を含む分化の有効性を評価するために、異なる時点で収集する必要があります。</li>
		<li>上清を取り出し、1mLの1×PBSで1回洗います。 注:オルガノイドを遠心分離しないでください。オルガノイドを重力でチューブの底に落ち着かせてください。</li>
		<li>上清を取り除き、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の1 mLを加えます。4°Cで30分間インキュベートします。使用済みの PFA を取り出し、1 mL の 1 × PBS を追加します。</li>
		<li>オルガノイドを1mLの1×PBSで4°Cで、凍結切断処理のために保管してください。 注:オルガノイドは、固定後1週間以下の1x PBSで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>凍結切断のためのオルガノイドの調製<ol>
<li>保存されたオルガノイドから上清を取り除く。15%スクロース(w/v、1×PBSで希釈)の1mLを加え、穏やかな渦巻きでよく混ぜ、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>15%スクロース/7.5%ゼラチン(表2)の溶液を調製し、固化するゼラチンを避けるために調製中に37°Cで維持する。</li>
		<li>15%のスクロース溶液を取り除き、15%スクロース/7.5%ゼラチンをオルガノイドに1mL加え、穏やかな渦巻きによって素早く混ぜます。37°Cで1時間インキュベートする。</li>
		<li>15%のスクロース/7.5%ゼラチン溶液をプラスチック容器に加え、その体積の半分まで。RT で固化を待ちます。</li>
		<li>1時間のインキュベーションの後、慎重にパスツールピペットで固化ゼラチン上にオルガノイドを含むスクロース/ゼラチンドロップを置きます。RTで約15分間固める。気泡の形成を避けるようにしてください。</li>
		<li>容器が満たされるまでオルガノイドの上に15%スクロース/7.5%ゼラチンを置きます。RT で完全な固化を待ちます。</li>
		<li>固化後、4°Cで20分間インキュベートする。</li>
		<li>ゼラチンを中央にオルガノイドを含む立方体に切り、O.C.t.化合物の滴で段ボールの一部にゼラチンキューブを固定します。</li>
		<li>500 mLカップに250mLのイセペンタンを入れ、適切な容器に液体窒素を充填します。鉗子と厚い手袋を使用して、液体窒素の表面にイポペンタンを含むカップを慎重に置き、イポランを-80°Cに冷却します。</li>
		<li>-80°Cに達したら、ゼラチンキューブをイセオペンタンを含むカップに入れ、温度を-80°Cに保ちます。 キューブのサイズによっては、1 ~ 2 分かかる場合があります。 注:-80°C以下の温度や過度の凍結時間は、立方体のひび割れを引き起こす可能性があるため、避けてください。</li>
		<li>冷凍したら、ゼラチンキューブを-80°Cで素早く保管し、凍結切り分けするまで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>オルガノイドの凍結切断<ol>
<li>クライオスタットをオンにし、-25 °Cの両方の標本(OT)と凍結室(CT)温度を定義します。</li>
		<li>両方の温度が安定したら、O.C.T.化合物を用いて、試料上のオルガノイドを含むゼラチンキューブを固定する。</li>
		<li>断面厚を12μmで定義します。</li>
		<li>立方体を切り、接着顕微鏡スライド上の3~4枚のスライスを集めます( 材料表を参照)。</li>
		<li>使用するまで-20°Cで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>オルガノイドスライスの免疫染色<ol>
<li>オルガノイド切片を含む顕微鏡スライドを、50 mLのプリウォーム付き1x PBSを備えた熟止用瓶に入れ、最大10枚のスライドを連続して保持します。 注:すべてのオルガノイドセクションは、液体で水没する必要があります。</li>
		<li>37°Cで45分間インキュベートし、スライドをデゲルラ化します。</li>
		<li>RTで5分間5×PBSで1倍洗う:新鮮な1×PBSを含むコプリングジャーにスライドを転送します。</li>
		<li>スライドを、作りたてのグリシン50mLを含むコプリングジャーに移し(表2)、RTで10分間インキュベートします。</li>
		<li>スライドを0.1%トリトンの50 mLを含む熟成瓶に移し、RTで10分間透過します。</li>
		<li>1×PBSで5分間2分洗います。</li>
		<li>1×PBSに浸した3mm紙で免疫染色皿を準備します。スライスの周りにティッシュを使ってスライドし、3mm紙の上に置きます。パスツールピペットを使用して、スライドあたり〜0.5 mLで、スライドの全面をブロッキング溶液(表2)で覆います。RTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>余分なブロッキング溶液を取り除き、スライスの周りの組織でスライドを乾燥させます。一次抗体の50 μLを配置します (表3)ブロック溶液で希釈し、カバースリップで覆います。スライスを以前に準備した免疫染色皿に入れます。4°Cで一晩インキュベートする。</li>
		<li>スライドをTBST(表2)の50 mLのコプリングジャーに移し、カバーリップを落とし、TBSTで5分間3倍洗います。</li>
		<li>ブロック溶液で希釈した2次抗体の50 μLをセクションの上に置き、カバースリップで覆います。前に準備した免疫染色皿にスライスを入れます。RTで30分間インキュベートし、光から保護します。</li>
		<li>スライドをもう一度コプリングジャーに移し、50 mLのTBSTで5分3倍洗います。</li>
		<li>スライス全体の周りのティッシュでスライドを乾燥させ、以前に準備した免疫染色皿にスライスを入れます。パスツールピペットでスライドの全面に0.5 mLのDAPI溶液を追加します。RTで5分間インキュベートします。</li>
		<li>ステップ 4.4.9 を繰り返します。</li>
		<li>慎重にティッシュでスライドを乾燥させます。スライドに沿ってドロップして50μLの取り付け媒体を加え、慎重にカバースリップを各スライドに下げ、泡を避けるためにわずかに曲げます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者YHとSJはPBSバイオテクノロジーの従業員です。著者BLは、PBSバイオテック社のCEO兼共同創設者です。これらの共同研究者は、原稿に使用されるバイオリアクターの開発に参加しました。これは、データと資料の共有に関するジャーナルのすべてのポリシーに対する著者の遵守を変更するものではありません。他のすべての著者は利益相反を宣言しません。

大規模な細胞数と、薬物スクリーニングおよび再生医療用途向けに特定の細胞タイプを生成するための定義された培養条件の必要性が、スケーラブルな培養システムの開発を推進してきました。近年、いくつかのグループは、神経前駆物質および機能的ニューロンのスケーラブルな生成を報告しています32,,33,,34,神経変性疾患の新しいモデルの開発に大きな進歩を提供.それにもかかわらず、胚発生のいくつかの重要な事象の再現はまだ欠けていて、そして長期間の懸濁液中での生成された機能ニューロンの維持は34を達成していない。ここでは、小脳の同一性を持つiPSC由来神経オルガノイドを生成し、動的培養における化学的に定義されたフィーダーフリー条件下での機能的小脳ニューロンへの成熟をさらに促進することができる動的3D培養システムを紹介します。
小脳分化を始める前に、ヒトのiPSCの品質を...

ヒト多能性幹細胞(PSC)の出現は、再生医療および疾患モデリングのための優れたツールを表しており、これらの細胞は人体11,2のほとんどの細胞系統に分化することができるからである。その発見以来、多様なアプローチを用いたPSC分化は、神経変性疾患33、4、5、64,5を含む異なる疾患を6モデル化することが報告されている。
近年、ヒトの脳構造に似たPSC由来の3D培養が報告されている。これらは脳オルガノイド33、7、87と呼ばれています。健康な、患者固有のPSCの両方からのこれらの構造の生成は、人間の発達および神経発達障害をモデル化する貴重な機会を提供する。しかし、これらのよく組織化された脳構造を生成するために使用される方法は、その大規模な生産に適用することは困難です。オルガノイド内部の壊死を伴わずに組織形態形成を再現するのに十分な大きさの構造を作り出すために、プロトコルは静的条件下での初期神経コミットメントに依存し、続いてヒドロゲル中のカプセル化および動的系におけるその後の培養3。しかし、そのようなアプローチは、オルガノイド産生の潜在的なスケールアップを制限する可能性がある。皮質、線条体、中脳,、脊髄ニューロン9、10、11、12を含む中枢神経系の特定の領域にPSC分化を指示9する努力がなされているにもかかわらず、10,11動的な状態で特定の脳領域の生成は依然として課題である。12特に、3D構造における成熟小脳ニューロンの生成については、まだ記載されていない。Mugurumaら.は、初期の小脳の発達13を再現する培養条件の生成を開拓し、最近、ヒト胚性幹細胞が第1三期小脳7を連想させる偏光構造を生成することを可能にするプロトコルを報告した。しかしながら、報告された研究における小脳ニューロンの成熟は、オルガノイドの解離、小脳前駆腫の分類、および単層培養系7、14、15、1614,15におけるフィーダー細胞との共培養を必要7とする16。したがって、規定された条件下での疾患モデリングのための所望の小脳オルガノイドの再現性のある生成は、培養およびフィーダー源変動に関連する課題である。
このプロトコルは、単回使用垂直車輪バイオリアクター(仕様については 材料表 を参照)を用いた小脳ニューロンへのヒトPSCの3D拡張および効率的な分化のための最適な培養条件を提示し、以下バイオリアクターと呼ばれる。バイオリアクターは、U字型の底部と組み合わせた大きな垂直インペラを装備しており、容器内のより均質なせん断分布を提供し、攪拌速度17を低下させた穏やかで均一な混合および粒子懸濁液を可能にする。このシステムにより、形状およびサイズ制御された細胞凝集体が得られ、より均質で効率的な分化のために重要である。さらに、より多くのiPSC由来オルガノイドは、より手間のかかわりのない方法で生成することができます。
通常幹細胞から形成される3D多細胞構造であるオルガノイドの主な特徴は、ヒト形態形成18、19、2019,20に見られるような特定の形状を形成する異なる細胞18型の自己組織化である。したがって、オルガノイド形態は、分化過程で評価される重要な基準である。オルガノイドの細分化と、さらに特定の抗体を用いたオルガノイドスライスの免疫染色により、細胞増殖、分化、細胞集団の同一性、アポトーシスを解析する分子マーカーの空間的可視化が可能になります。このプロトコルを用いて、オルガノイド・クライオセクションを免疫染色することにより、分化の7日目により初期の効率的な神経コミットメントが観察される。分化の間、小脳の同一性を有する複数の細胞集団が観察される。この動的系で35日後、小脳神経エピテリウムは、前駆細胞および基底位置した近味神経系の前駆細胞および基底位置の素端層を有するアピコ基底軸に沿って組織する。成熟過程では、35~90日目の分化から、プルキンエ細胞(カルビンビン+)、顆粒細胞(PAX6+/MAP2+)、ゴルジ細胞(ニューログラニン+、ユニポーラブラシ細胞+(TBR2+)、深小+脳核投影ニューロン(TBR1+)+を含む、異なるタイプの小脳ニューロンが見られる。+また、培養で90日後に発生した小脳オルガノイドでは、有意でない量の細胞死が観察される。
このシステムでは、ヒトiPSC由来オルガノイドは異なる小脳ニューロンに成熟し、解離およびフィーダーの共培養を必要とせずに最大3ヶ月間生存し、疾患モデリングのためのヒト小脳ニューロンの供給源を提供する。

<table><tbody><tr><td>3MM紙</td><td></td><td>WHA3030861メルク</td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>A6964-500mL</td><td>シグマ</td><td>細胞剥離培地</td></tr><tr><td>抗BARHL1抗体</td><td>HPA004809</td><td>アトラス抗体</td><td></td></tr><tr><td>抗カルビンジンD-28k抗体</td><td>CB28</td>ミリ<td>ポア</td><td></td></tr><tr><td>抗MAP2抗体</td><td>M4403</td>シ<td>グマ</td><td></td></tr><tr><td>抗N-カドヘリン抗体</td><td>610921</td><td>BD形質導入</td><td></td></tr><tr><td>抗NESTIN抗体</td><td>MAB1259-SP</td><td>R&D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-OLIG2 抗体</td><td>MABN50</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PAX6 抗体</td><td>PRB-278P</td><td>Covance</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SOX2 抗体</td><td>MAB2018</td><td>R&D</td><td></td></tr><tr><td>抗 TBR1 抗体</td><td>AB2261</td><td>ミリポア</td><td></td></tr><tr><td>抗 TBR2 抗体</td><td>ab183991</td><td>アブカム</td><td></td></tr><tr><td>抗 TUJ1 抗体</td><td>801213</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>アポトランスフェリン</td><td>T1147</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &SM1キット</td><td>5793-500mL</td><td>幹細胞技術</td><td></td></tr><tr><td>化学的に定義された脂質濃縮物</td><td>11905031</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24x60mm</td><td>631-1575</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>結晶化精製BSA</td><td>5470</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>10236276001</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>ジブチリルcAMP</td><td>SC-201567B -500mg</td><td>Frilabo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>32500-035</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>A3840001</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>ウシの皮からのゼラチン</td><td>G9391</td><td>シグマ</td><td></td></tr><tr><td>ガラス コプリング ジャー</td><td>E94</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス I</td><td>10566-016</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>MB014001</td><td>NZYtech</td><td></td></tr><tr><td>ハムs F12</td><td>21765029</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Human Episomal iPSC Line</td><td>A18945</td><td>ThermoFisher</td><td>iPSC6.2</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>12440046</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>91077C</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>iPS DF6-9-9T.B</td><td></td><td>WiCell</td><td></td></tr><tr><td>イソペンタン</td><td>PHR1661-2ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>A-92902</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>354230</td><td>Corning</td><td>基底膜マトリックス</td></tr><tr><td>モノチオグリセロール</td><td>M6154</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>475904</td><td>ミリポア</td><td>実装剤</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>85850 -500ml</td><td>幹細胞技術</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>17502048</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>12348017</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>158127</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>PBS-0.1 シングルユース容器</td><td>SKU: IA-0.1-D-001</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>PBS-MINI MagDrive ベースユニット</td><td>SKU: IA-UNI-B-501</td><td>PBS</td><td></td>バイオテクノロジー</tr><tr><td>組換えヒト BDNF</td><td>450-02</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト bFGF/FGF2</td><td>100-18B</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト FGF19</td><td>100-32</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト GDNF</td><td>450-10</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト SDF1</td><td>300-28A</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>ROCK阻害剤 Y-27632</td><td>72302</td><td>幹細胞技術</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SB431542 S4317</td><td>シグマ</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>S7903</td><td>シグマ</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト顕微鏡 スライド</td><td>12372098</td><td>サーモフィッシャー</td><td>接着顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>ティッシュテック O.C.T. 化合物</td><td>25608-930</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>トリス-HCL 1M</td><td>T3038-1L</td><td>シグマ</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>9002-93-1</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>P1379</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>15575020</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

小脳はバランスと運動協調の維持において重要な役割を果たし、異なる小脳ニューロンの機能的欠陥は小脳機能障害を引き起こす可能性がある。疾患関連の神経細胞型に関する現在の知識のほとんどは、死後の組織に基づいており、疾患の進行と発症の理解が困難です。動物モデルおよび不死化細胞株は、神経変性疾患のモデルとしても使用されている。しかし、彼らは完全に人間の病気を再現しません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、疾患モデル化の可能性が大きく、再生アプローチの貴重な供給源となります。近年、患者由来のiPSCからの脳オルガノイドの生成は、神経変性疾患モデルの見通しを改善しました。しかし、3D培養系において多数のオルガノイドを産生し、成熟したニューロンの収量が高いプロトコルが欠けている。このプロトコルは、オルガノイドが小脳の同一性を獲得するスケーラブルな単一使用バイオリアクターを使用して、化学的に定義された条件下で、ヒトiPSC由来オルガノイドを再現可能でスケーラブルに生成するための新しいアプローチです。生成されたオルガノイドは、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で特異的なマーカーの発現によって特徴付けられる。タンパク質の特定のグループの分析は、その局在化がオルガノイド構造の評価に重要である異なる小脳細胞集団の検出を可能にします。オルガノイド凍結切除およびオルガノイドスライスのさらなる免疫染色は、特定の小脳細胞集団の存在およびそれらの空間組織を評価するために使用される。

プロトコルは、0.1 Lバイオリアクターを用いて細胞凝集を促進することによって開始された(図1A)。iPSCの単一細胞接種を行い、250,000個の細胞/mLを60mLの培地に播種し、撹拌速度は27rpmであった。これは 0 日として定義されました。24時間後、細胞は効率的にスフェロイド状の凝集体(1日目、図1B)を形成し、形態は5日目まで良好に維持され、徐々にサイズが増加し、時間の経過とともに凝集形態およびサイズにおいて高度な均質性を示した。(図1B)。顕微鏡による定量分析では、1日目による集合サイズの正規分布も明らかになった(図1C)。集合サイズは、異なる系統29,30,30に向かって細胞を区別するように求めることができる重要な物理的パラメータです。このため、効率的な神経<sup ...

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞の制御されたサイズ凝集体を産生し、単一使用バイオリアクターを使用して化学的に定義されたフィーダーフリー条件下で小脳オルガノイドの分化をさらに刺激する動的培養システムを記述する。

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

我々は初めて、単回使用バイオリアクターを用いて、再現性と拡張性の高い生成、小脳オルガノイドで誘導されるIPS細胞の新しいアプローチ、および化学的に定義された条件を提示する。バイオリアクターを播種するための細胞を得るために、ヒトiPSCの6つのウェルプレートの各ウェルに、細胞剥離培地を1ミリリットル加える。穏やかな揺れがウェルから細胞を簡単に取り外すまで、37°Cでプレートを7分間インキュベートします。P1000マイクロピペットを用いて、細胞剥離培地を、上下に、細胞が単一細胞に解離するまでピレットする。次に、完全な細胞培養培地の2ミリリットルを各ウェルに加え、酵素消化を不活性化する。次にピペットを使用して、細胞を滅菌状の円錐管に穏やかに移します。チューブを210倍の重力で3分間遠心分離します。上清を取り除き、培養培地中の細胞ペレットを再懸濁した。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、トリパンブルー染料。iPSCの1ミリリットル当たり250,000細胞の密度でバイオリアクター容器を参照してください。バイオリアクター容器をユニバーサルベースユニットに挿入し、摂氏37度、湿度95%、二酸化炭素5%のインキュベーターに挿入します。iPSC凝集を促進するには、ベースコントロールユニットの攪拌速度を27 RPMに設定します。1日目には、ゼロ日目がバイオリアクターを播種する日で、バイオリアクターとベースユニットを無菌フローフードに入れ、血清ピペットを使用して細胞懸濁液の1ミリリットルサンプルを採取する。細胞懸濁液を超低い取り付け、24ウェルプレートに入れます。顕微鏡を用い、iPSC由来の凝集体が形成されたことを確認する。その場合、40 Xまたは100 X.iPSCとバイオリアクターの培養を続けるで、凝集体とバイオリアクターの平均直径が100マイクロメートルになるまで、その後、岩石阻害剤のない新鮮なMT01で培地の80%を置き換えます。凝集体が直径200〜250マイクロメートルに達すると、すべてのオルガノイドを生体反応器の底に落ち着かせ、その後、すべての使用済み培地をgfCDM分化培地に置き換えます。基底ユニットとバイオリアクターをインキュベーターに入れ、撹拌を25RPMに減らします。保存されたオルガノイドから上清を取り除いた後、ペレットに15%スクロースの1ミリリットルを加え、穏やかに渦巻いてよく混ぜます。オルガノイドを一晩、摂氏4度でインキュベートした後、スクロース溶液を取り除き、15%スクロース、7.5%ゼラチンの1ミリリットルを加え、穏やかに渦巻くことによって素早く混ぜます。オルガノイドは摂氏37度でインキュベートしている間、15%スクロース7.5%ゼラチン溶液で途中でプラスチック容器を充填し、固化させます。オルガノイドが1時間インキュベートされた後、パスツールピペットを使用して、凝固したスクロースとゼラチンの上にオルガノイドスクロースゼラチン混合物の滴を置く。滴が固まるのを15分待った後、プラスチック容器の残りの部分を15%以上のスクロース、7.5%ゼラチンで満たし、室温で完全に固まり、摂氏4度で20分間インキュベートします。ゼラチンを立方体に切り、中央にオルガノイドを入れ、OCT化合物を滴下して立方体を段ボールに固定し、250ミリリットルのイポペンタンを500ミリリットルのカップに入れ、適切な容器に液体窒素を充填します。鉗子と厚い手袋を使用して、慎重に液体窒素の表面に、イポレタンのカップを置きます。イセペンタンと液体窒素は、有害な試薬である。これら2つの試薬の使用は、厚い手袋と十分な換気を含む個人的な保護具を必要とする。イセオペンタンが80°Cの負の80度まで冷却したら、ゼラチンキューブをイセプタンに入れ、凍るまで置きます。よく凍結された立方体は、軽く鉗子で叩くと金属音を生成し、それが保存される準備ができていることを示す。オルガノイド切片を含む顕微鏡スライドを5分間1XPBSで5分間洗浄し、そのスライドをコプリン瓶に移し、新鮮な1X PBSを含む。スライドをコプリン瓶に移し、調製したグリシン50ミリリットルを室温で10分間インキュベートし、スライドをコプリン瓶に移し、0.1%トリトンの50ミリリットルを含み、室温で10分間透過させた。スライドを1X PBSで2回、毎回5分間洗います。免疫染色皿を3ミリメートル紙で準備し、1X PBSに浸します。スライドをスライスの周りのティッシュで乾かして、3ミリメートル紙の上に置きます。パスツールピペットで、各スライドを0.5ミリリットルのブロッキング溶液で覆います。室温で30分間インキュベートした後、余分なブロッキング溶液を取り除き、すべてのスライスの周りに、組織でスライドを駆動します。各スライドに希釈された一次抗体の50マイクロリットルを置き、カバースリップでそれらをカバーします。スライドをレースし、以前に準備した免疫染色皿で、摂氏4度でインキュベートします。一晩のインキュベーションの後、スライドをコプリン瓶に移し、50ミリリットルのTBSTでカバースリップを落とし、そのスライドをTBSTで3回洗い、毎回5分間洗います。各スライドに希釈二次抗体の50マイクロリットルを置き、カバースリップで覆います。スライドを入れ、あらかじめ調製した免疫染色皿に、光から保護された室温で30分間インキュベートする。スライドをもう一度コプリン瓶に移し、毎回5分間、50ミリリットルのTBSTで3回洗います。パスツールピペットを使用して、ダッピー溶液の0.5ミリリットルで、各スライドの全表面にわたって、室温で5分間インキュベートします。バイオリアクターで24時間後、iPSCの効率的に形成されたスフェロイド状の凝集体。形態は5日目までよく維持され、サイズは徐々に増加した。高度な均質性を実証する。顕微鏡による定量分析では、1日目の集合体サイズの正規分布も明らかにされ、両方の細胞株は2日目までに最適な集合体サイズを達成した。所望の凝集直径が達成された後、神経コミットメントが誘発され、そしてその後、異なる小脳前駆物質の生成が促進された。分化オルガノイドの間に、発光空間を有する神経管様構造に類似した、より顕著な上皮化を示した。さらに、オルガノイド径分布は、14日目まで初期小脳コミットメントの間に均質であった。免疫蛍光分析は、iPSC由来オルガノイドの効率的な神経コミットメントが既に達成されていることを、7日目の分化によって支持する。免疫染色はまた、実証, 効率的な小脳コミットメントと小脳オルガノイドの効率的な成熟.さらに、バイオリアクターで80日後、オルガノイドの生きた死染色は高い細胞生存率を示し、壊死領域の証拠はなかった。この技術は、病理学的経路を研究するための重要なツールを表し、新薬の治療効果を評価するために観察された小脳の変性に関与する。

scalable-generation-mature-cerebellar-organoids-from-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するアッセイを実演しています。ヒトiPS細胞は、胚様体(EB)を形成するように誘導されます。EBは、誘導媒体を使用してポリマー足場上で培養され、神経幹細胞、前駆細胞、未成熟ニューロンへの分化を促進します。最後に、EBはマトリックスに埋め込まれ、脳オルガノイド形成のための維持培地に移されます。...

人工多能性幹細胞由来脳オルガノイドの作製

このビデオでは、シングルユースの3Dバイオリアクターを使用して、人工多能性幹細胞(iPSC)から成熟した小脳オルガノイドを生成する技術を示しています。このバイオリアクターはiPS細胞凝集体の形成を促進し、その後、成長因子とケモカインを豊富に含む一連の培地で処理することで、iPS細胞凝集体の成熟小脳オルガノイドへの分化を誘導します。その後、オルガノイドを回収し、さらなる分析のために凍結保存します。...

シングルユースバイオリアクターを用いた人工多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドの作製

このビデオは、ヒトが誘導した多能性幹細胞を小脳前駆細胞に分化させるためのプロトコルを示しています。これは、幹細胞コロニーを超低接着プレートに移して胚様体を形成し、成長因子による分化を促進した後、胚様体をマトリックスコーティングプレートに移して接着するというものです。その後のステップでは、細胞遊走を誘導し、グルタミン酸作動性およびGABA作動性小脳ニューロン前駆体およびプルキンエ細胞前駆細胞の発達を導くための成熟培地を添加します。...

人工多能性幹細胞から小脳細胞の2次元単層を生成する技術

このビデオは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)の球状脳オルガノイドへの変換を示しています。特異的な阻害剤を用いることで、hPSCは神経細胞の系統に分化するように誘導され、神経外胚葉コロニーを形成します。その後、特別な成長因子が導入され、コロニーの自己組織化と増殖が促進され、最終的には球状の脳オルガノイドが形成されます。...

ヒト多能性幹細胞からのスフェロイドの作製

このビデオは、オルガノイドの成熟を示す様々な小脳ニューロンで発現する特定の標的抗原を特定するための小脳オルガノイドスライスの免疫蛍光染色を示しています。...

小脳オルガノイドスライスの蛍光免疫染色

神経上皮組織の前例のない複雑さのために、人間の脳の発達をモデル化することが妨げられてきました。ここでは、ヒトの脳発生の初期のイベントを明らかにし、in...

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

我々は、新皮質発生の2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)ベースのモデルの生成および特性評価のための詳細なプロトコル、ならびに初代繊毛(PC)生合成および機能の定性的および定量的分析を可能にする補完的方法論を提示する。...

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

本研究では、標準的なフィーダーフリーhPSC培養を用いた、シンプルでありながら堅牢な皮質オルガノイド培養システムのための詳細な技術を提供する。これは、...

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

本プロトコールは、小脳発生の初期段階を調査するための人工多能性幹細胞からの小脳細胞の2D単層の生成を説明する。...

ヒト小脳発生 のin vitro での2次元構造モデリング

本プロトコルは、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の脳オルガノイドの再現性のある生成、維持、および老化のための段階的な手順を提供します。この方法により、脳オルガノイドを長期間培養・成熟させることができ、脳の老化や加齢に伴う病態形成に関わる過程のモデル化が容易になります。...

老化研究のためのiPS細胞由来脳オルガノイドの長期培養のための堅牢な組織作製

学ぶ ヒトiPS細胞からの小脳オルガノイドのスケーラブルな生成法。使い捨てバイオリアクターを用いた化学的定義条件下での分化誘導と免疫染色による特徴付けのプロトコルを解説します。

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

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