Name: 免疫蛍光による原発性繊毛の簡易検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶ免疫蛍光法による繊維芽細胞での原発性繊毛の簡易検出法。蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡を用いて、細胞シグナル伝達と関連疾患の研究に貢献します。

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この作業は、チェコ共和国の防衛省によって支援されました - 長期組織開発計画軍事保健科学部の大量破壊兵器の医療側面、防衛大学;チェコ共和国教育・青年スポーツ省(特定研究プロジェクト第一:SV/FVZ201703)とPROGRES Q40/06また、英語の改訂で彼の親切な支援のためのダニエル・ディアスに感謝します。

1. 文化メディア、ソリューション、料理の準備
<ol><li>カバーリップをオートクレーブ(22 x 22 mm)にします。6つのウェルプレートを準備します。ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質ペニシリン/ストレプトマイシンを解凍し、培養培地を室温(RT)まで温める。トリプシン-EDTAを使用する (0.25%)1x PBS(リン酸緩衝食塩分カルシウムとマグネシウム)を細胞を通過させる。</li>
	<li>新鮮な4%パラホルムアルデヒド(PFA)をdH2O(20mLの20mLで800mgのPFA)で調製します。22PFAは各実験に対して新たに準備されなければならない。55°Cで溶液を攪拌し、ボンネットで30分間加熱します。溶液が明らかになるまで1M水酸化ナトリウムを加える(pH = 7.2-7.4)RTで冷却します。4°Cで1週間まで保管してください。 注: PFA は毒性があります。常に適切な個人用保護具を着用し、化学フードに準備します。</li>
	<li>500 mL の培養培地、10% FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン 1%、グルタミン 2% を含む DMEM (DULBEC の修正イーグル培地) を準備します。</li>
	<li>1%ゼラチン溶液13 mLを滅菌dH2O(130mgのゼラチンを13mLのdH2Oで調製)6ウェルプレートに各ウェルに1%ゼラチンの2mLを使用してください。無菌を保ちます。</li>
	<li>70%エタノールを使用して層流フードを洗浄します。実験を開始する前に、必要な材料を層流フードの内側に配置します。</li>
</ol>2. 免疫細胞染色のための細胞培養
<ol><li>標準的な技術を用いて細胞(本研究ではC2C12、MEF、NHLF、および皮膚線維芽細胞)を解凍し、調製した培地の〜10〜12mLを添加したT75フラスコにプレートする。細胞が合流率70%に達するまで、37°C/5%CO2 /90%相対湿度(RH)でインキュベートします。2</li>
	<li>インキュベーターから細胞を取り出し、層流フードに入れます。培養培地を取り出し、1x PBSで細胞を2倍にすすめます。0.25%トリプシンEDTAの約2mLをT75フラスコに加え、37°Cで〜5分間インキュベートします。反転した顕微鏡を定期的に確認して、細胞の剥離を監視します。 注意:インキュベーション時間は細胞株によって異なるため、経験的に決定する必要があります。</li>
	<li>10 mLの培養培地中の細胞を穏やかに再懸濁し、慎重にピペット処理して単一の細胞懸濁液を作り出す。必要に応じてフラスコを再びすすいします。</li>
	<li>細胞懸濁液を50 mLの円錐管に入れ、遠心分離機を~200 x gで5分間置 きます。上清をデカントし、10 mLの培養培地を加え、ペレットを静かに再懸濁します。細胞懸濁液を20μLとし、トリパンブルーで1:1の比率で混合し、標準的な方法に従ってサイトメーターにカウントします。</li>
	<li>ピンセットを使用して6ウェルプレートの各ウェルの中に1つのカバースリップを置きます。ウェルに約2mLを注いで、カバーリップにゼラチンを塗ります。これにより、セルがカバーリップにアタッチされます。ゼラチン溶液を取り出し、数分間空気乾燥させます。カバーリップは細胞の培養の準備が整いました。すぐに栽培を開始します。</li>
	<li>種子100,000線維芽細胞を各ウェルに入れ、2mLの培養培地を加える。細胞を37°C/5%CO2/90%RHで24時間培養する。この時点で、細胞は、ユーザのニーズに応じて処理することができる。毛様体化を誘導する治療法は、4,55に先に述べた。 注: 初期シード数はセルの倍時間によって異なり、それに応じて決定する必要があります。</li>
</ol>3. インビトロにおける原型繊毛の免疫蛍光染色
<ol><li>4%パラホルムアルデヒドを温め、RT.パスツールピペット、1x PBS(RT)、廃液容器、15 mL円錐管、マイクロピペット(0.5~10μL、20~200μL、100~1,00μL)、先端を用意します。インキュベーターから細胞を取り出し、ベンチに置きます。 注:染色手順は、滅菌条件で行う必要はありません。すべてのソリューションは RT である必要があります。</li>
	<li>各井戸からメディアを取り外します。カバースリップは井戸の中に置いておきなさい。細胞3xを2mLの1x PBSで非常に穏やかに洗います。パスツールピペットを使用して、各ウェルに4%PFAの2mLを加えて細胞を固定します。RTで10分間インキュベートし、PFAを取り出し、1x PBSで3倍洗います。 注:インキュベーション期間中は、カバースリップ全体をカバーするのに十分なボリュームを常に使用してください。細胞を乾燥させないでください。カバースリップに直接ソリューションを注ぎないでください。</li>
	<li>0.5% トリトンX-100を13 mLの10分の10分で準備します。各ウェルに2mLを加えます。15分間インキュベートします。1倍のPBSで4倍とやさしく洗います。 注:トリトンX-100はRTでPBSに不溶性です。</li>
	<li>使用前にヤギの血清5分を解凍します。ヤギの血清をブロッキング溶液として1:20比で1x PBSで希釈します。各カバースリップに150 μLを加え、RTで20分間インキュベートします。 注:必要に応じて、ブロック期間を最大60分まで延長してください。ヤギの血清でブロッキングした後、細胞を洗浄しないでください。</li>
	<li>一次抗体(すなわち、抗アセチル化アルファチューブリンおよび抗ガンマ尿管)を使用する5分前に解凍する。1x PBSで抗体を別々に希釈する:マウス抗アセチル化アルファ尿細管を1:800比、ウサギの抗ガンマ尿管を1:300比で希釈します。ブロックソリューションを削除します。洗わないで下してください。両方の抗体希釈液をカバーリップに150 μL加え、RTで60分間インキュベートします。 注:一晩インキュベートする場合は、一次抗体溶液の500〜1,000 μLを使用する場合は、パラフィンフィルムで6ウェルプレートを密封し、4°Cで保存してください。 あるいは、150 μLの抗体を使用し、湿度チャンバ内でインキュベートします。</li>
	<li>一次抗体を除去します。カバーリップを1x PBSの2 mLで3倍洗います。Cy3ヒツジの抗マウスとアレクサFluor488ヤギ抗ウサギを1:300比で別々に希釈することにより、1x PBSで二次抗体を調製します。両方の二次抗体希釈液の150 μLをカバースリップに加えます。暗闇の中でRTで45分間インキュベートします。 注:フォトブリーチを避けるために暗闇の中でインキュベート。二次抗体の他の組み合わせは、必要に応じて使用することができます。</li>
	<li>メーカーの指示に従ってDAPI(4'、6-ディミジノ-2-フェニリンドール)溶液を準備します。過剰なアリコートを-20°Cに保存する。 1x PBSの50 mLで、ストックアリコート(1:5,000)から10μLを希釈します。カバーリップにこの希釈液の2 mLを追加します。暗闇の中でRTで5分間インキュベートします。 注:光の漂白を避けるために暗闇の中で細胞をインキュベートすることが重要です。DAPI希釈は、4°Cで最大1ヶ月間保存できます。</li>
	<li>針、スライド、ピンセット、取り付け用メディアを2枚用意します。スライドにラベルを付けます。</li>
	<li>ウェルから DAPI ソリューションを削除します。1x PBSで3倍洗います。各スライドに取り付けメディアを1滴置きます。針を使って、カバースリップをウェルの底からそっと持ち上げます。ピンセットを使用してカバースリップを反転し、取り付けメディアのドロップの上にそっと置きます。気泡を慎重に取り除きます。</li>
	<li>スライドを光から保護し、4 °Cで一晩保管してください。</li>
	<li>蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、高倍率でプライマリ繊毛を可視化します。 注:スライドは、最大2ヶ月間、4°Cの暗闇の中に保存することができます。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もありません.

いくつかの,著者は、プライマリ繊毛の検出のための多様な方法を説明し、時には検出6、20、21、2220,に影響を与えることができる様々な固定方法も記述している。62122いずれにせよ、検出のための完全でわかりやすいプロトコルを見つけることは困難です。このような方法の準備ができたのは、特に研究の初期段階や、選択された細胞株におけるプライマリ繊毛の存在をテストするための迅速かつ容易な方法のために、一次繊毛調査の研究に大きな助けとなるであろう。したがって、このプロトコルは、異なる種類の治療後にインビトロで初代繊毛を検出するために可能な限り詳細に説明される。
現在のプロトコルは、,毎日20、23、<...

原性繊毛は、細胞の母中心に関連する感覚的、孤独な、膜結合性、非モタイル構造である。原発性繊毛は、赤血球、血液胞子1、および肝細胞2を除くほとんどの脊椎動物細胞に見られる。原繊毛は、細管によって構成される細長い軸索として形成され、その主成分はαチューブリンである。アキソンムは、γチューブリンから構成される基底体から成長する。プライマリ繊毛の長さは2~10μmの間で変化する。しかし、その寸法は、グリチル化、飢餓、低酸素、細胞毒性ストレス、または電離放射線33、4、5、6、74,5,6,7への暴露後に変化する可能性があります。通常、細胞は一次シリウムを1つしか持っていないが、これは形態形成および細胞シグナル伝達経路に関与し、細胞増殖および分化に重要な8,99である。
一次繊毛は、細胞周期進行中、特にG0/G1相中に動的に調節され、HDAC6(ヒストンデアセチルラーゼ6)10によって媒介される管内脱アセチル化に関連する過程で有糸分裂に入る前10にリソードされる。一次繊毛吸収の正確な瞬間は,、オーロラA、Plk1、TcTex-1 11、12、1311,など、このプロセスに直接関与する細胞の種類と遺伝子の発現に依存する。1213細胞の種類に応じて、プライマリ繊毛は異なるタイプの受容体、イオンチャネル、および活性シグナル伝達経路を発現する。これらには、増殖および生存に影響を及ぼす最も重要なシグナル伝達受容体、EGFR、PDGFR、およびFGFRが含まれる。また、ヘッジホッグ、ノッチ、Wntを含む1つ以上の器官の機能に影響を与える可能性のあるシグナル伝達経路のいくつかも含まれています。この機能により、原発性繊毛は、ノッチ、ホルモン、セロトニンまたはソマトスタチンなどの生物学的に活性な物質に対する特異的なリガンドを検出することができます。異なる長さの一次繊毛によって示される他の特定の機能は、温度、重力、および浸透病性14の変化に対する反応を含む。
一次繊毛は、ライブビジュアライゼーション、透過電子顕微鏡、3Dイメージング、または一,次繊毛5、15、16、1715の5自動検出のためのソフトウェアなど、さまざまな方法を通じて可視化することができる。,1617しかし、これらの方法は高度に専門化されており、研究のあらゆる段階で原型繊毛を染色するための基本的で迅速で簡単な方法が必要です。記載は、培養細胞における一次繊毛の検出に対する簡易で有用な方法である。

<table><tbody><tr><td>6ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92406</td><td>寸法 128x86x22 mm</td></tr><tr><td>Alexa Fluor488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-546-047</td><td>AffiniPure F(ab')?フラグメントヤギ抗ウサギIgG</td></tr><tr><td>抗チューブリン&ガンマ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>ポリクローナルウサギ抗マウスIgG2a</td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td>筋芽細胞(マウス)</td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2181</td><td>抗マウスIgG(全分子)F(ab&prime;)2フラグメント&ndash;ヒツジで産生されたCy3抗体</td></tr><tr><td>Dapi (4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute;s モディファイドイーグル&acute;Thermo</td><td>Scientific</td><td>11960044</td><td>高グルコース、グルタミンなし、Gibco</td></tr><tr><td>Dulbecco'MgCl</td><td>2およびCaCl2を含む</td>リン酸緩衝生理食塩水<td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td>、滅菌ろ過、細胞培養に適しています</tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>滅菌ろ過、Gibco</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>MEF</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1039</td><td>マウス胚性線維芽細胞</td></tr><tr><td>モノクローナル抗アセチル化チューブリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td>マウスで産生されるモノクローナル抗アセチル化チューブリン抗体</td></tr><tr><td>NHLF</td><td>ロンザ</td><td>CC-2512</td><td>初代肺線維芽細胞(ヒト)</td></tr><tr><td>正常なヤギ</td><td>血清 ジャクソン免疫研究</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td>粉末</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>0.9% NaCl に 10,000 単位ペニシリンと 10 mg ストレプトマイシン 1 mL あたり 0.9% NaCl、滅菌ろ過</td></tr><tr><td>ProLong Diamond 退色防止封入剤</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>皮膚線維芽細胞</td><td>カレル大学医学部 フラデツ Kr&aacute;愛する&eacute;。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正方形カバースリップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>22X22-1.5</td><td>ホウケイ酸ガラス、22x22mm、正方形</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200072</td><td>滅菌ろ過、Gibco</td></tr></tbody></table>

免疫蛍光による原発性繊毛の簡易検出

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

一次繊毛は、細胞周期進行中、特に細胞周期のG0/G1段階の間に動的に調節され、有糸分裂の前に再調節される。一次繊毛は、透過型電子顕微鏡、3Dイメージング、または一次繊毛の自動検出のためのソフトウェアを使用するなど、高度に洗練された方法で視覚化することができます。しかしながら、これらの方法を行うためには、一次繊毛の免疫蛍光染色が必要である。本書では、アセチル化アルファチューブリン(axoneme)とガンマ管(基底体)を染色することにより、インビトロで一次繊毛を容易に検出するためのプロトコルについて説明する。この免疫蛍光染色プロトコルは比較的単純であり、高品質の画像をもたらします。本プロトコルは、原性繊毛を発現する4つの細胞株(C2C12、MEF、NHLF、および皮膚線維芽細胞)を、どのように固定し、免疫染色し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した方法を記述する。

原繊毛の免疫蛍光染色は、高品質の画像をもたらす比較的簡単な手順です。これらの実験では、原発繊毛を発現する線維芽細胞を固定し、免疫染色し、上記のプロトコルに従って蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した。一次シリウムはアセチル化αチューブリンおよびγチューブリンを用いて検出した。原繊毛の評価は、種々のレベルで行うことができるし、この点に関する任意の変化は、電離放射線、細胞代謝(例えば、飢餓)、または化学処理(例えば、細胞増殖抑制)5、18,18への曝露に関連することができる。
電離放射線が一次繊毛に及ぼす影響は、照射された様々な細胞株(例えば、筋芽細胞株C2C12)で研究されており、一次繊毛発生率の変化を分析した。al.4のフィリポワによれば、低い照射量はC2C12細胞における単一の一次繊毛の発生を変えない。しかし、電離放射線の高用量(すなわち、20Gy)は、多元繊毛の出現を誘発した(<strong class="xfi...

一次繊毛は、中心に関連する細胞外構造である。免疫蛍光染色による一次繊毛検出は、非常に高品質な画像をもたらす比較的簡単な手順です。このプロトコルでは、原発繊毛を発現する線維芽細胞を固定し、免疫染色し、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像化した。

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

このプロトコルは、様々な研究努力の中で、培養細胞内の原発繊の迅速かつ容易な検出を可能にする。この方法は、原発繊毛の基底体に影響を与える障害で利用することができる。この手順は、パラフィン埋め込み組織での原発繊毛の染色や、蛍光が必要な他の実験にも適用できます。22 x 22ミリメートルのカバースリップをオートクレーブし、実験用の材料を準備します。FBSおよびペニシリンストレプトマイシンを解凍し、培養培地を室温に温める。トリプシンEDTAおよびPBSで細胞を通過させる。原稿の指示に従って、新鮮な4%パラホルムアルデヒド、培養培地、および1%ゼラチン溶液を調製する。その後、70%エタノールで層流フードを洗浄し、すべての必要な材料を内部に入れます。パラホルムアルデヒドは非常に危険です。適切なPPEは常に着用する必要があり、それは化学フードでのみ処理する必要があります。所望の細胞を70%合流に成長した後、インキュベーターからそれらを取り除き、層流フードに入れます。培養液を取り出し、PBSで細胞を2回リンスします。培養フラスコに0.25%トリプシンEDTAの約2ミリリットルを加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。反転顕微鏡で細胞を定期的にチェックして、剥離を監視します。細胞が10ミリリットルの培養培地で穏やかに再懸濁した場合、慎重にピペット処理して単一の細胞懸濁液を作り出す。細胞懸濁液を50ミリリットル円錐形チューブに移し、200倍G'5分間遠心分離します。上清をデカントし、10ミリリットルの培養培地を加え、ペレットを軽く再懸濁します。細胞懸濁液を20マイクロリットル取り、1対1の体積比でトリパンブルーと混ぜます。次に、標準的なヘモサイトメトリーを使用して細胞を数えます。6つのウェルプレートの各ウェルの中にカバースリップを置き、カバースリップに2ミリリットルのゼラチン溶液をコーティングします。ゼラチンを取り出し、プレートを数分間空気乾燥させます。種子100,000の線維芽細胞を各ウェルに入れ、2ミリリットルの培養培地を添加する。その後、セルを摂氏37度、二酸化炭素5%、相対湿度90%で24時間インキュベートします。培養後、毛様体化を誘導するために細胞を治療する。4%パラホルムアルデヒドを室温まで温め、牧草地のピペット、ABS、廃容器、15ミリリットルの円錐管、マイクロピペット、および先端を準備します。インキュベーターから細胞を取り出し、ラボベンチに置きます。カバースリップを残して、各井戸からメディアを取り外します。2ミリリットルのPBSで細胞を3回軽く洗います。その後、細胞を固定するために各ウェルに4%PFAの2ミリリットルを追加します。プレートを室温で10分間インキュベートし、PFAを取り出し、PBSで洗い洗いを繰り返します。各ウェルに0.5%トリトンX-100の2ミリリットルを加え、プレートを15分間インキュベートします。その後、PBSで井戸を4回洗います。ブロッキング溶液を作るために、ヤギの血清を5分間解凍し、PBSで1〜20の比率で希釈します。各カバースリップにこの溶液の150マイクロリットルを加え、20分間プレートをインキュベートします。一次抗体を5分間解凍し、テキスト原稿に記載されているようにPBSで別々に希釈する。カバースリップからブロッキング溶液を取り除き、両方の抗体溶液の150マイクロリットルを加えます。その後、プレートを室温で60分間インキュベートします。一次抗体を取り除き、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回軽く洗います。希釈Cy3羊抗マウスとアレクサフルーター488ヤギ抗ウサギをPBSで1〜300の比率で、カバースリップに両方の二次抗体溶液の150マイクロリットルを追加します。50ミリリットルのPBSで10マイクロリットルのストックを希釈して作業DAPI溶液を調製し、この希釈液をカバースリップに2ミリリットル加えます。室温で、暗闇の中で5分間プレートをインキュベートします。スライドにカバースリップを配置する前に、2本の針、ピンセット、取り付けメディアを準備し、すべてのスライドにラベルを付けます。ウェルからDAPI溶液を取り出し、PBSで3回洗浄します。各スライドに取り付けメディアを1滴置きます。針を使って、カバースリップをウェルの底からそっと持ち上げます。その後、それを反転し、ピンセットを使用して取り付けメディアのドロップの上にそっと置きます。気泡を慎重に取り除きます。スライドを光から保護し、摂氏4度で一晩保管してください。翌日には蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、高倍率で一次繊毛を可視化します。このプロトコルは、免疫染色体を固定するために使用され、一次繊毛を発現する様々な細胞株を画像化した。マウス筋芽細胞が様々な線量で電離放射線にさらされたとき、高用量が複数の一次繊毛の出現を誘発することを発見した。低用量では、単一の一次繊毛の出現をもたらした.同様に、ヒト肺線維芽細胞を低用量で放射した場合、単一の原発繊毛は免疫蛍光によって検出された。飢えたマウス胚性線維芽細胞では原発繊の増加が観察され、代謝ストレスが原発性繊毛の事件に影響を及ぼすことが示された。皮膚線維芽細胞を120ナノモルドキソルビシンで処理したところ、単一の一次シリウムを発現した。高用量は、複数の一次繊毛の出現を誘発する。1.25ナノモルタキソールで処理された線維芽細胞も単一の一次シリウムを発現した。しかし、高用量で治療した後、複数の繊毛は検出されなかった。このプロトコルを開く際は、すべてのPPE規制に従ってください。選択した細胞ラインの培養ニーズを念頭に置き、抗体を慎重に選択してください。細胞は取り返しのつかないため、この手順を他の手順で直接実行することはできません。代わりに、並列実験をプログラムする必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

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免疫蛍光法による哺乳類細胞の核ブレブとDNA漏出の検出

学ぶ免疫蛍光法による繊維芽細胞での原発性繊毛の簡易検出法。蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡を用いて、細胞シグナル伝達と関連疾患の研究に貢献します。

免疫蛍光による原発性繊毛の簡易検出

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