宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生アスペルギルス感染モデルを示しており、この真菌に対する自然免疫応答を調査するために使用できます。ゼブラフィッシュ幼生モデルの主な利点は、数日間の感染を通じて、生きた宿主動物内の免疫細胞病原体の相互作用と感染の進行を視覚化できることです。このモデルから得られた知見は、免疫不全患者の侵襲性アスペルギルス症を治療するための新たな治療標的の発見に応用できる可能性があります。

ゼブラフィッシュの幼生に胞子を微量注入することは難しい技術であり、一貫性のある再現性のある結果が得られるまでには、かなりの練習が必要です。マイクロインジェクションを行うには、圧力インジェクター、真空圧力ユニット、フットスイッチ、マイクロピペットホルダー、マイクロマニピュレーター、磁気スタンドとプレートに付属のセットアップを使用します。すべて圧縮空気の供給源に接続されています。

圧縮空気バルブを開きます。そして、マイクロインジェクターの電源を入れます。圧力を約 25 psi に、強化を 60 ミリ秒に、vac 圧力ユニットを 1 psi に設定します。

マイクロローダーピペットチップを使用して、マイクロインジェクション針に3〜5マイクロリットルのPBSまたはフェノールレッドの胞子懸濁液をロードします。次に、針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。Aspergillus fumigatusは、人間の日和見病原体です。

負荷をかけた針で皮膚が穿刺される危険性があります。針はマイクロインジェクターに非常にしっかりと取り付けられている必要があり、研究者は常に手袋を着用し、穿刺を避けるために針の周りの手の動きに細心の注意を払う必要があります。マイクロマニピュレーターは、針の端が実体顕微鏡の下で最低倍率で見えるように配置します。

4倍にズームして、針を視界に入れたままにします。次に、鋭い鉗子を使用して針の端をクリップします。インジェクションペダルを踏むと、液滴のサイズが視覚化されます。

そして、約3ナノリットルの胞子懸濁液が出てくるまで針をクリップし続けます。準備ができたら、マイクロマニピュレーターと針を邪魔にならないように動かして、注入プレートに幼虫を配置する際に誤って針に当たらないようにします。E3トリカインを注入プレートから注ぎます。.

そして、約24匹の麻酔をかけた2日齢の幼虫を、できるだけ少ないE3でプレートに移します。次に、幼虫を向いている方向に合わせて配置し、右を向いているすべての幼虫を1列に並べ、左を向いている幼虫をすべて下に一列に並べます。顕微鏡を最低倍率に設定した状態で、マイクロマニピュレーターを戻し、針が30〜60度の角度で幼虫に近づくようにします。

最高倍率にズームインします。また、微調整ノブを使用して、針の位置をさらに調整します。胞子懸濁液を幼虫の隣の液体に注入して、30〜70個の胞子が針から出ていることを確認します。

次に、針が最初の幼虫の真上にくて近くに配置されるようにプレートを動かします。針の方を向いている幼虫から始めます。耳小胞の周りの組織に針を挿入し、後脳心室に突き刺し、必要に応じてプレートを動かして幼虫の正しい向きを取得します。

針の端が後脳室の中心にあることを視覚的に確認します。次に、フットペダルを押して胞子を注入し、針を静かに引っ込めます。両方の列にすべての幼虫を注入した後、針を再び邪魔にならないように動かします。

そして、より低い倍率にズームします。フェノールレッド染料は、各幼虫の後脳にまだ見えるはずです。注射に失敗した幼虫は処分し、残りの幼虫は新鮮なE3で皿から洗い流してシャーレに移します。幼虫をE3で2回洗い流し、麻酔から回復することを確認します。

注射直後に、8匹の幼虫を個々の1.7ミリリットルチューブに移し、安楽死させます。PBS1mLをアンピシリンとカナマイシンで調製します。幼虫の入ったチューブからできるだけ多くの液体を取り除きます。

次に、抗生物質を含むPBSの90マイクロリットルを追加します。TissueLyserで幼虫を毎分1800振動で6分間均質化します。次に、Gの17,000倍で30秒間スピンダウンします。

均質化された懸濁液を各チューブからラベル付きGMMプレートの中央までピペットで移動し、使い捨てのL字型スプレッダーを使用して広げます。リムにぶつからないように注意してください。プレートを逆さまにして摂氏37度で2〜3日間インキュベートします。

次に、形成されたコロニーの数を数えます。残りの注入された幼虫を2つの3.5ミリメートル皿に分割します。1つは薬物治療用、もう1つはコントロール用です。

できるだけ多くの液体を取り除き、車両制御付きのE3を1つの皿に追加します。そして、E3は他のものに興味のある扱いをします。ピペットを使用して、各幼虫を96ウェルプレートのウェルに移します。

そして、彼らの生存を7日間監視します。イメージング当日は、100マイクロモルPTUの3.5mmシャーレとE3トリカインのシャーレを1枚ずつ準備します。Z-ウェッジEデバイスのチャンバーにE3トリカインを追加し、P100マイクロピペットを使用して、チャンバーと拘束チャネルから気泡を取り除きます。

次に、チャンバーの外側にある余分なE3トリカインをすべて取り除きます。1匹の幼虫をピペットで持ち上げ、E3 PTUで皿に移します。次に、できるだけ少ない液体でE3トリカインに移します。

30秒後、麻酔をかけた幼虫を創傷および閉じ込め装置のローディングチャンバーに移します。E3トリカインを巻線室から取り出し、幼虫の尾部を制限水路に移動させるためにローディングチャンバーに放出します。幼虫が外側、背側、または背外側に配置されていることを確認して、後脳を倒立対物レンズで画像化できるようにします。

共焦点顕微鏡で幼虫をイメージングした後、E3トリカインを創傷チャンバーに放出して、幼虫を拘束チャネルからローディングチャンバーに押し込みます。幼虫を拾い上げ、E3トリカインを入れた皿に戻します。次に、できるだけ液体を使わずにE3 PTUを入れた皿に移します。

PTUですすぎ、48ウェルプレートに戻します。アスペルギルスの胞子をゼブラフィッシュの幼生の後脳にマイクロインジェクションし、感染結果をモニターしました。野生型の幼虫では死滅はほとんど観察されず、実験全体で80〜100%の幼虫が生き残った。

免疫抑制された幼虫では生存率の有意な低下が観察されました。感染した野生型幼虫のコロニー形成単位を定量したところ、胞子の持続性と経時的な緩慢なクリアランスが観察されました。感染後1日、2日、3日、5日、7日で生存する胞子の数は、注入された胞子の数に正規化され、レプリカ間の持続性とクリアランスを比較しました。

マクロファージを標識すると、通常、感染後2〜3日で幼虫の約50%にマイクロファージのクラスター化が観察されました。好中球の動員は遅延し、主に真菌の発芽後に発生しました。真菌の負荷は、大多数の幼虫で実験全体にわたって持続しました。

感染後5日でクリアランスが観察された。幼虫の別のサブセットでは、後脳以外の領域への真菌の拡散が観察されました。耳小胞の周辺は、この拡散が発見された場所の1つです。

真菌の発芽は、通常、幼虫の60%で5日間で見られました。食細胞クラスター面積、マクロファージの動員、および好中球の動員は、すべての幼虫で経時的に変化しました。実験を通じて上昇傾向にあるものもあれば、時間の経過とともに解決するものもあります。

この手順は、CRISPRなどのゼブラフィッシュの遺伝子操作と組み合わせて、アスペルギルスに対する自然免疫応答を成功させるための特定の宿主経路の要件を決定することができます。このプロトコルにより、アスペルギルス属の自然免疫細胞の相互作用をリアルタイムで、生きた無傷の宿主で視覚化することが可能になりました。