Name: 宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼虫を用いたアスペルギルス感染モデルで、生体内での免疫細胞と病原体の相互作用をリアルタイムで可視化する方法です。侵襲性アスペルギルス症の治療標的発見に応用可能です。

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この研究は、国立衛生研究所の国立アレルギー・感染症研究所が受賞番号K22AI134677の下で支援しました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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<li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).</li>
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<li>Knox, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+phagocyte+responses+to+Aspergillus+fumigatus+conidia+and+hyphae+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae.</a> Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).</li>
<li>Rosowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+inhibit+Aspergillus+fumigatus+germination+and+neutrophil-mediated+fungal+killing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing.</a> PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229(2018).</li>
<li>Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+establishes+infection+in+zebrafish+by+germination+of+phagocytized+conidia%2C+while+Aspergillus+niger+relies+on+extracellular+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination.</a> Scientific Reports. 9 (1), 12791(2019).</li>
<li>Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-glucan-dependent+shuttling+of+conidia+from+neutrophils+to+macrophages+occurs+during+fungal+infection+establishment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment.</a> PLoS Biology. 17 (9), 3000113(2019).</li>
<li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis-dependent+activation+of+a+TLR9-BTK-calcineurin-NFAT+pathway+co-ordinates+innate+immunity+to+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).</li>
<li>Shah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+Orchestrates+Lateral+Transfer+of+Aspergillus+fumigatus+during+Macrophage+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenate+sensitivity+of+a+laeA+mutant+is+restored+by+overexpression+of+the+bZIP+protein+MetR+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus.</a> Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifunctional+Small+Molecules+Enhance+Neutrophil+Activities+Against+Aspergillus+fumigatus+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro.</a> Frontiers in Immunology. 10, 644(2019).</li>
<li>Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+voriconazole+against+A.+fumigatus+infection+depends+on+host+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).</li>
<li>Herbst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+clinically+relevant+murine+model+of+solid-organ+transplant+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis.</a> Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).</li>
<li>Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+immune+cell+clearance+of+Aspergillus+fumigatus+spores+and+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae.</a> Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).</li>
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開示する紛争や財政的利益はありません。

ここで説明する感染モデルは、宿主の免疫応答、宿主病原体相互作用、および真菌病原体12、13、14、15を分析するために有益である。この情報は、蛍光標識病原体および宿主細胞13の高解像画像化、幼虫生存、およびCFU持続性を経て得ることができる。
マイクロインジェクション技術は、このプロトコルの成功に不可欠であり、異なるマイクロインジェクション装置およびセットアップを使用する場合に調整する必要があります。特に、射出の圧力と時間は2つの主要な変数であり、針によって排出される容積が〜3nLであることを確認するために調節することができる。鉗子でそれを切り取ることによって決定される針のサイズはまた注入される胞子の数を調節する;しかし、大きな開口部は、幼虫に組織損傷を引き起こす可能性があります。一方、開口部が小さすぎると、比較的大きな胞子(>2 μm)が外に出て、針詰まりを引き起こす可能性があります。この場合、針は、わずかに大きな開口部を持つようにクリップすることができます。
細菌のマイクロインジェクションのための他のプロトコルは、均質な注入混合物を維持するためにPVP-40を利用するが、我々は アスペルギルス 胞子とこのキャリアを使用する上で任意の利点を発見していない。針の詰まりは、真菌製剤を徹底的にボルテックスして、針をロードする前に塊を壊すことによって軽減することができます。時には、針の詰まりは、一時的に圧力または注射時間を増加させ、針が幼虫を取り巻く液体中にある間にマイクロインジェクターを引き起こすことによって取り除かれる。圧力と射出時間は、前のレベルに再び減少する必要があります。他のケースでは、詰まりを除去することができず、新しい針をロードし、再調整する必要があります。
このプロトコルは、幼虫あたり〜30~70個の胞子を注入するように設計されています。胞毛調製物の濃度と注入される体積に基づいて、この数はかなり低いことが知られている。しかし、これはこれらの条件下で注入された胞子の数であることを経験的に発見されています。なぜこの違いが起こったのかは不明ですが、針の胞毛が凝集している可能性があります。より多くの胞子を注入しようとする私たち自身の試みは、ほとんど失敗しています。
約30~70個の胞子が注入され、すべての幼虫を通して注射の一貫性を維持するために、幼虫を取り巻くE3に注入して胞子の数を確認してください。すべての注射を通して5〜6匹の幼虫ごとにこれを繰り返します。胞子数が変化すると思われる場合は、圧力および/または注入時間を調整して、複数の幼虫に一貫した数の胞子を注入することができます。しかし, 注意してください注射用量は、主に後脳に残り、中脳と前脳を埋めないことを.
局所感染を確実にするために、胞毛懸濁液は後脳心室内に含まれるべきです。これは、注射直後のフェノールレッド染色によって視覚化することができますが、赤い色は時間とともに拡散します。注射の場合、オティックベシクルの周りの領域を貫通し、45°~65°の角度で心室に到達します。この領域は、主要な血管を持っていない、より少ない組織の損傷を引き起こし、瞬時に治癒します。心室の皮膚が突き刺さると、 アスペルギルス 胞子注射に使用しなければならない針が細菌懸濁液よりも大きいため、胞子懸濁液が漏出する可能性があります。誤って注射または誤って損傷した幼虫は、黄身に数回注入して赤いマークを作成するか、または針で列から幼虫をドラッグすることによってマークすることができます。一連の注射が完了した後、これらの幼虫は、残りの部分がプレートから洗い流される前に除去され、処分されるべきである。メチレンブルーのないE3は、注射前に幼虫を麻酔し、注射後も幼虫を保つために使用されます。
注射時に、CFUカウントは感染した宿主内の生存可能な胞子の数を表す。しかし、胞子が催眠術に発芽する場合、これらは均質化中に別々の生存可能な「真菌単位」に分かれて、複数のコロニーを生じさせることができる。または、切れ目のない多細胞性催眠術は、単一のコロニーを生じさせ、真菌の負担の平均値を示すが不正確である。これは、CFUカウントと個々の幼虫の縦方向顕微鏡を組み合わせることで緩和することができ、注入された胞子の運命の視覚的データを提供する。
哺乳類系と比較して、ゼブラフィッシュ幼虫感染モデルは、その光学的なアクセシビリティのために特に重要である。自然免疫細胞の徴生と応答は、生きた無傷の宿主の中で視覚化することができる。これは、分子標的の遺伝的または化学的阻害と組み込まれ、各標的が生きている動物の アスペルギルス 胞子に対するマクロファージまたは好中球反応にどのように影響するかを分析することができる。
ゼブラフィッシュ幼虫アスペルギルス感染モデルは、IA12、13、14、15、16、17、18、19、20、22の異なる側面を記述するのに役立ち続けていますが、他の拡大領域があります。宿主側からは、細胞レベルの免疫応答を記述するために使用されますが、標的モルフォリーノ、CRISPR、安定した突然変異線、または化学的暴露と組み合わせることによって、分子レベルで免疫メカニズムを分析するために拡張することができます。1つの注意点は、すべての既知の哺乳類の自然免疫経路成分のホモログはゼブラフィッシュで同定されていないということです。
病原体側からは、異なる種および株の病原性が記載されている。将来の研究の有望な道は、特定の遺伝子またはタンパク質が毒性因子としてどのように寄与するかをテストするために変異ア スペルギルス 株を使用することです。それにより、新規抗真菌薬を開発して、これらのタンパク質を標的とすることができる。現在の抗真菌薬は、ヒト患者の有効性が低く、真菌28でこれらの薬剤に対する耐性が高まっている。このin vivoモデルは、これらの薬物が失敗した理由を調査するために使用することができ、新しい抗真菌薬の有効性をテストするための中間モデルとして使用することができます。全体として、このモデルを用いて発見された知見は、 アスペルギルス感染患者に対する効果的な治療法の将来の開発を促進することができる。

アスペルギルス・フミガトゥスは、ユビキタスな窒息菌であり、その空中胞子は屋内と屋外の両方で見つけることができます1.これらの胞子は、すべての人によって吸入されるが、免疫能力の個人1、2の肺から効果的にクリアされる。しかし、嚢胞性線維症などの肺の状態が変化した人は、肺の真菌発芽のために気管支肺アスペルギルス症を発症する可能性がある3。この感染の最も重篤な形態は、侵襲性アスペルギルス症(IA)、免疫不全の個体に影響を及ぼし、真菌を他の器官2,3に増殖することを伴う。IAは、抗真菌療法の利用可能性にもかかわらず、感染した患者の>50%の死亡につながる4.免疫能力のある個人では、自然免疫応答は吸入胞子1をクリアする上で大きな役割を果たす。しかし、この自然免疫クリアランスに寄与する特定のメカニズムは十分に理解されていない。IAの新しい治療法を見つけるためには、アスペルギルスのクリアランスにおける主要な自然免疫細胞(マクロファージおよび好中球)の細胞および分子メカニズムを理解することが重要です。
哺乳類モデルは真菌性毒性因子および宿主免疫応答の同定に役立っていますが、細胞レベルでの宿主と病原体の相互作用には視覚アクセシビリティが制限されています。組織培養実験では、動物全体に存在する複雑な多細胞環境と相互作用を完全に再現することはできません。したがって、ゼブラフィッシュは、このギャップを埋め、複数日感染8、9を越えて生きている無傷の宿主における宿主間相互作用の研究を容易にする代替モデル生物として人気を集めている。ゼブラフィッシュの自然免疫系は早くも24時間の受精後(hpf)10で発達し、適応体系は11を発症するのに4〜6週間かかり、自然免疫応答を単独で評価できる時間枠を提供する。自然免疫応答は、ヒトとゼブラフィッシュ11の間で十分に保存されている。ゼブラフィッシュは、光学的明瞭さ(無傷の宿主の高解像度のライブイメージングを可能にする)や遺伝的な難易度(分子機械学的研究を容易にする)など、これらの応答の調査を促進する多くの資質を有する。
ここで説明した幼虫ゼブラフィッシュアスペルギルス感染モデルは、もともとKnoxららによって開発されました。最近、我々のグループおよび他の人々によって、宿主免疫機構12、13、宿主病原体相互作用、免疫抑制13、16、17、真菌性毒性18、および抗真菌薬有効性19、20のメカニズムを調査するために拡大されている。このモデルは、ヒトアスペルギルス症の複数の側面を再現します。免疫担当の幼虫は耐性であるが、免疫不全の幼虫は感染に屈することができる12,13,16,17.
このモデルでは、幼虫の後脳心室に胞子を注入することにより局所感染が確立され、食細胞が少ない領域、および食細胞の採用と行動を評価することができる12、13。マクロファージは、ヒト1および哺乳類モデル6,21におけるアスペルギルス胞子に対する第一線の防御線として作用すると考えられている。同様に、ゼブラフィッシュモデルでは、マクロファージは、注入されたアスペルギルス胞子にリクルートされ、一方で好中球は、催眠成長12、13、22に応答して二次的に募集される。このモデルから、アスペルギルスは、感染の7日以上後に野生型免疫能力幼虫に持続できることも知られた。さらに、感染の全経過は、毎日の共焦点イメージングによって同じ生きた動物に続くことができる。
このプロトコルは、受精後2日間の後脳心室に胞子を注入する微小注入の技術を記述する(2dpf)幼虫。ゼブラフィッシュの幼虫は餌を与えずに最大10dpfまで生きることができるので、感染は最大7日間監視されます。免疫抑制は薬物治療によって誘発され得るが、幼虫への薬物の適用も記載されている。最後に、個々の幼虫からのCFUsの定量化および毎日のライブイメージング設定を含む、感染進行に従う2つの方法が記載される。

<table><tbody><tr><td>デュモン鉗子#5</td>ロ<td>ボズ手術器具株式会社</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>接眼レンズレチクル</td><td>顕微鏡ワールド</td><td>RETR10</td><td>針の校正用、実体顕微鏡</td></tr><tr><td>マイクロインジェクターのセットアップに使用: 背圧ユニット</td><td>アプライドサイエンティフィックインストルメンテーション</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>フットスイッチ</td><td>アプライドサイエンティフィックインストルメンテーション</td><td>FTSW</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダーキット</td><td>アプライドサイエンティフィックインストルメンテーション</td><td>M-Pip</td><td></td></tr><tr><td>圧力インジェクター</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター セットアップ マイクロマニピュレーター</td><td>習重 (トライテック)</td> <td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>マグネットスタンド&プレート</td><td>トライテック</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>ニードルプーラー</td><td>サッター装置</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ-745</td><td></td></tr><tr><td>Tissuelyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>幼虫</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>を均質化するために<tr><td>Material</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント/DescriptionAgarose</td></tr> <tr><td></td><td>Fisher</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin ナトリウム塩</td><td>フィッシャー</td><td>AAJ6380706</td><td></td></tr><tr><td>BSA、フラクションV</td><td>VWR</td><td>AAJ65855-22</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸</td><td>フィッシャー</td><td>AAJ1792406</td><td></td></tr><tr><td>Lスプレッダー</td><td>フィッシャー</td><td>14 665 230</td><td></td></tr><tr><td>マイクロキャピラリー針 (フィラメントなし)</td> <td>ワールド精密機器 (WPI)</td> <td>TW100-3</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダー ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>アスペルギルス懸濁液</td></tr>ミ<tr><td>ラクロス</td><td>VWR</td><td>EM475855-1R</td>を針にロードする <td>アスペルギルス懸濁液</td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素</td><td>フィッシャー</td><td>AAL0669009</td><td>色素沈着を防ぐために</td></tr><tr><td>フェノールレッド、1%溶液</td><td>フィ</td><td>ッシャー57254</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸、メタンスルホン酸塩)</td><td>フィッシャー</td><td>AC118000500</td><td>幼虫を麻酔する</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media and Solutions</td><td>Components/Recipe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3 media: 60x E3</td><td>17.2 g NaCl、0.76 g KCl、2.9 g CaCl2、4.9 g MgSO4 &middot; 7H2O、 H2O</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x E3</td><td>16.7 ml 60x ストック、430 ul 0.05 M NaOH を含む 1 L まで、H2O を含む 1 L まで (オプション: + 3 ml 0.01% メチレンブルー)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>トリカイン原液</td><td>2 g トリカイン、5 g Na2HPO4 &middot; 7H2</サブ>O、4.2 ml 60X E3、H2Oで500 mlまで、NaOH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース最小培地(GMM)寒天</td>でpH 7.0-7.5まで:GMM寒天<td>10 gグルコース(デキストロース)、50 ml 20x硝酸塩、1 ml TE、H2Oで1 Lまで、 NaOHでpH6.5、+ 16 g寒天、オートクレーブ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x硝酸塩</td><td>120 g NaNO3、10.4 g KCl、10.4 g、MgSO4 & middot; 7H2O、30.4 g、KH2PO4、 H2O、オートクレーブ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量元素(TE)</td><td>2.20 g ZnSO4 &middot、7H2O、1.10 g H3BO3、 0.50 g MnCl2 &middot;4H2O、0.16 g FeSO4 &middot;7H2O、0.16 g CoCl2 &middot;6H2O、0.16 g CuSO4 &middot;5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 &middot;4H2O、5.00 g Na2EDTA、H2Oで100mlまで、一晩攪拌しながら溶解し、オートクレーブ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

侵襲性アスペルギルス症(IA)は、免疫不全の個人の間で最も一般的な真菌感染症の1つです。抗真菌薬が利用できるにもかかわらず、IAは感染した免疫不全患者において>50%の死亡率を引き起こす可能性がある。新しい治療法を開発するためには、感染感受性と感染患者の低生存率に寄与する宿主および病原体因子の両方を決定することが重要です。生来の免疫応答は 、アスペルギルス 胞子の認識とクリアランスにおいて極めて重要な役割を果たしますが、正確な細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていません。信頼できるモデルは宿主と病原体の間の詳細な機械相互作用を調査するために必要である。ゼブラフィッシュの幼虫の光学的明瞭さと遺伝的な難解さは、生きている無傷の宿主における複数のヒト細菌および真菌感染症の宿主病原体相互作用を研究する興味深いモデルとなる。このプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュ アスペルギルス 感染モデルを記述する。まず、 アスペルギルス 胞子を単離し、マイクロインジェクションを介してゼブラフィッシュ後脳心室に注入する。次いで、免疫抑制薬などの化学阻害剤を幼虫水に直接添加する。注射された幼虫における感染を監視する2つの方法が記載されており、コロニー形成ユニット(CFU)列挙体および2)繰り返し、毎日のライブイメージングセットアップのための幼虫の均質化を含む。全体的に、これらの技術は、生体内で のアスペルギルス 感染の進行を機械論的に分析するために使用することができ、宿主と病原体の相互作用を尋問するために異なる宿主の背景および アスペルギルス 株に適用することができる。

アスペルギルス胞子をゼブラフィッシュ幼虫の後脳に微小注射した後、感染結果は生存、CFUs、ライブイメージングを含む複数のアッセイを続けることができます。生存アッセイでは、1~7dpiで生き残った感染した幼虫の数を監視した。野生型の幼虫を治療せずに放置すると、死はほとんど見られず、幼虫の約80~100%が実験全体を生き延びていた(図1)。幼虫が免疫抑制された場合、例えばコルチコステロイド薬デキサメタゾン(10μM)への曝露により、有意に減少した生存率が観察された(図1)。
CfUsをA.フミガトゥス胞子に感染した野生型幼虫からの7日間の実験を通して定量化した場合、胞子の持続性が観察され、時間の経過とともにクリアランスが遅かった(図2A)。1、2、3、5、および7 dpiで生存する胞子の数を、0 dpiで注入された胞子の数に正規化して、反復間の持続性とクリアランスを比較した(図2B)。
白血球中の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック魚株は、蛍光タンパク質発現 アスペルギルス 胞子と共に、白血球の形成および行動、ならびに真菌発芽および発育13の両方を可視化するために使用することができる。マクロファージに標識を付けた場合(例えば、Tg(mpeg1:H2B-GFP))、幼虫の50%程度のマクロファージクラスタリングが一般的に観察され、2~3dpiから始まる(図3A)。好中球(Tg(lyz:BFP))の採用は、典型的には遅延し、主に真菌発芽が起こった後に起こる(図3A)。幼虫の大部分の実験全体に対して真菌の負担が持続する一方で(図3A)、クリアランスが観察された(図3B)。一部の幼虫では、後に感染で後に後に、マクロファージで真菌の播種のために真菌の負担が観察された。
オティックベシクル周辺は、この普及が見つかる可能性のある場所の1つです(図3C)。これらの観測は、実験全体の過程で複数の個々の幼虫で定量化された(図4)。典型的には、発芽は5dpiによって幼虫の60%〜60%で見られた(図4A)。食細胞クラスター領域、マクロファージの採用、および好中球の採用は、時間の経過と共に変化し、幼虫全体で変化し、実験を通じていくつかの傾向があり、時間の経過とともに解決します(図4B,C,D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig01.jpg"> 図1:感染した幼虫の代表的な生存率分析アスペルギルス感染幼虫は、車両制御(DMSO)またはデキサメタゾン(Dex)にさらされ、生存を監視した。データは、3 つのプールされたレプリケートを表します。平均注入CFUs:DMSO = 30、Dex = 29(p値およびハザード比は、Cox比例ハザード回帰分析、****p&lt;0.0001)によって計算された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2.jpg"> 図2:代表的なCFUは、注射直後(0dpi)および感染経過時(2、3、5、および7 dpi)の感染幼虫から数える。感染した幼虫8匹を均質化し、各時点でCFUを数え、複製するためにメッキした。(A) 1 つのレプリケートからのデータの例。各点は1つの幼虫を表し、棒は各時間ポイントの平均を表す。(B) CFU カウントは、レプリケートごとに 0 dpi の CFU カウントに正規化され、3 つのレプリケートがプールされました。分散分析を用いて実験条件間でデータを比較し、推定限界平均と標準誤差の観点から要約した。Asterix は、0 dpi の CFU と比較して統計的有意性を表します (*p &lt; 0.05、**p &lt; 0.01、****p &lt; 0.0001)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2.jpg"> 図3:感染実験からの代表的な画像。蛍光マクロファージを有するPTU処理幼虫(mpeg1:H2B-GFP)および好中球(lyz:BFP)をRFP発現 A.フミガトゥスを注射した。共焦点顕微鏡上で2、3、および5dpiで、生きた、感染した幼虫を繰り返し画像化した。最大強度 Z 投影イメージが表示されます。幼虫の模式図は、各パネルのイメージングの位置を示しています。全てのスケールバーは100μmを表し、25μmのスケールバーを除き(A)画像は2、3、5 dpiで撮影された単一の幼虫から、典型的な感染進行を表します。インセットは3日目と5日目に真菌発芽を示す。(B) 感染をクリアできる幼虫のサブセットの代表的な画像であり、真菌の負担が低く、5 dpiではあまり炎症を起こさない。(C) 後の時点で感染が後脳から広がる幼虫のサブセットの代表的な画像。この画像では、真菌、マクロファージ、好中球は、オチクジクのベシクルの周りと下に見つけることができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2.jpg"> 図4:画像化実験の代表的な定量化。図3の実験セットアップからの画像を、真菌発芽および白血球の採用について分析した。(A)幼虫は、毎日発芽胞子の存在のために採点され、発芽を伴う幼虫の割合を計算した。(B,C,D)個々の幼虫は異なる色の線として表されます。食細胞クラスターの出現および大きさ(B)、マクロファージ募集(C)、および好中球募集(D)は、各幼虫に対する5日間の実験の過程で続いた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61165/61165fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ幼虫における アスペルギルス 感染モデルについて説明する。 アスペルギルス 胞子は幼虫の後脳に微量に注入され、免疫抑制を誘導するために化学的処理が使用されます。感染進行は、毎日のイメージング設定を介して、真菌の成長および免疫応答、ならびにコロニー形成単位めっきによる生きた胞子の列挙を監視する。

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生アスペルギルス感染モデルを示しており、この真菌に対する自然免疫応答を調査するために使用できます。ゼブラフィッシュ幼生モデルの主な利点は、数日間の感染を通じて、生きた宿主動物内の免疫細胞病原体の相互作用と感染の進行を視覚化できることです。このモデルから得られた知見は、免疫不全患者の侵襲性アスペルギルス症を治療するための新たな治療標的の発見に応用できる可能性があります。ゼブラフィッシュの幼生に胞子を微量注入することは難しい技術であり、一貫性のある再現性のある結果が得られるまでには、かなりの練習が必要です。マイクロインジェクションを行うには、圧力インジェクター、真空圧力ユニット、フットスイッチ、マイクロピペットホルダー、マイクロマニピュレーター、磁気スタンドとプレートに付属のセットアップを使用します。すべて圧縮空気の供給源に接続されています。圧縮空気バルブを開きます。そして、マイクロインジェクターの電源を入れます。圧力を約 25 psi に、強化を 60 ミリ秒に、vac 圧力ユニットを 1 psi に設定します。マイクロローダーピペットチップを使用して、マイクロインジェクション針に3〜5マイクロリットルのPBSまたはフェノールレッドの胞子懸濁液をロードします。次に、針をマイクロマニピュレーターに取り付けます。Aspergillus fumigatusは、人間の日和見病原体です。負荷をかけた針で皮膚が穿刺される危険性があります。針はマイクロインジェクターに非常にしっかりと取り付けられている必要があり、研究者は常に手袋を着用し、穿刺を避けるために針の周りの手の動きに細心の注意を払う必要があります。マイクロマニピュレーターは、針の端が実体顕微鏡の下で最低倍率で見えるように配置します。4倍にズームして、針を視界に入れたままにします。次に、鋭い鉗子を使用して針の端をクリップします。インジェクションペダルを踏むと、液滴のサイズが視覚化されます。そして、約3ナノリットルの胞子懸濁液が出てくるまで針をクリップし続けます。準備ができたら、マイクロマニピュレーターと針を邪魔にならないように動かして、注入プレートに幼虫を配置する際に誤って針に当たらないようにします。E3トリカインを注入プレートから注ぎます。.そして、約24匹の麻酔をかけた2日齢の幼虫を、できるだけ少ないE3でプレートに移します。次に、幼虫を向いている方向に合わせて配置し、右を向いているすべての幼虫を1列に並べ、左を向いている幼虫をすべて下に一列に並べます。顕微鏡を最低倍率に設定した状態で、マイクロマニピュレーターを戻し、針が30〜60度の角度で幼虫に近づくようにします。最高倍率にズームインします。また、微調整ノブを使用して、針の位置をさらに調整します。胞子懸濁液を幼虫の隣の液体に注入して、30〜70個の胞子が針から出ていることを確認します。次に、針が最初の幼虫の真上にくて近くに配置されるようにプレートを動かします。針の方を向いている幼虫から始めます。耳小胞の周りの組織に針を挿入し、後脳心室に突き刺し、必要に応じてプレートを動かして幼虫の正しい向きを取得します。針の端が後脳室の中心にあることを視覚的に確認します。次に、フットペダルを押して胞子を注入し、針を静かに引っ込めます。両方の列にすべての幼虫を注入した後、針を再び邪魔にならないように動かします。そして、より低い倍率にズームします。フェノールレッド染料は、各幼虫の後脳にまだ見えるはずです。注射に失敗した幼虫は処分し、残りの幼虫は新鮮なE3で皿から洗い流してシャーレに移します。幼虫をE3で2回洗い流し、麻酔から回復することを確認します。注射直後に、8匹の幼虫を個々の1.7ミリリットルチューブに移し、安楽死させます。PBS1mLをアンピシリンとカナマイシンで調製します。幼虫の入ったチューブからできるだけ多くの液体を取り除きます。次に、抗生物質を含むPBSの90マイクロリットルを追加します。TissueLyserで幼虫を毎分1800振動で6分間均質化します。次に、Gの17,000倍で30秒間スピンダウンします。均質化された懸濁液を各チューブからラベル付きGMMプレートの中央までピペットで移動し、使い捨てのL字型スプレッダーを使用して広げます。リムにぶつからないように注意してください。プレートを逆さまにして摂氏37度で2〜3日間インキュベートします。次に、形成されたコロニーの数を数えます。残りの注入された幼虫を2つの3.5ミリメートル皿に分割します。1つは薬物治療用、もう1つはコントロール用です。できるだけ多くの液体を取り除き、車両制御付きのE3を1つの皿に追加します。そして、E3は他のものに興味のある扱いをします。ピペットを使用して、各幼虫を96ウェルプレートのウェルに移します。そして、彼らの生存を7日間監視します。イメージング当日は、100マイクロモルPTUの3.5mmシャーレとE3トリカインのシャーレを1枚ずつ準備します。Z-ウェッジEデバイスのチャンバーにE3トリカインを追加し、P100マイクロピペットを使用して、チャンバーと拘束チャネルから気泡を取り除きます。次に、チャンバーの外側にある余分なE3トリカインをすべて取り除きます。1匹の幼虫をピペットで持ち上げ、E3 PTUで皿に移します。次に、できるだけ少ない液体でE3トリカインに移します。30秒後、麻酔をかけた幼虫を創傷および閉じ込め装置のローディングチャンバーに移します。E3トリカインを巻線室から取り出し、幼虫の尾部を制限水路に移動させるためにローディングチャンバーに放出します。幼虫が外側、背側、または背外側に配置されていることを確認して、後脳を倒立対物レンズで画像化できるようにします。共焦点顕微鏡で幼虫をイメージングした後、E3トリカインを創傷チャンバーに放出して、幼虫を拘束チャネルからローディングチャンバーに押し込みます。幼虫を拾い上げ、E3トリカインを入れた皿に戻します。次に、できるだけ液体を使わずにE3 PTUを入れた皿に移します。PTUですすぎ、48ウェルプレートに戻します。アスペルギルスの胞子をゼブラフィッシュの幼生の後脳にマイクロインジェクションし、感染結果をモニターしました。野生型の幼虫では死滅はほとんど観察されず、実験全体で80〜100%の幼虫が生き残った。免疫抑制された幼虫では生存率の有意な低下が観察されました。感染した野生型幼虫のコロニー形成単位を定量したところ、胞子の持続性と経時的な緩慢なクリアランスが観察されました。感染後1日、2日、3日、5日、7日で生存する胞子の数は、注入された胞子の数に正規化され、レプリカ間の持続性とクリアランスを比較しました。マクロファージを標識すると、通常、感染後2〜3日で幼虫の約50%にマイクロファージのクラスター化が観察されました。好中球の動員は遅延し、主に真菌の発芽後に発生しました。真菌の負荷は、大多数の幼虫で実験全体にわたって持続しました。感染後5日でクリアランスが観察された。幼虫の別のサブセットでは、後脳以外の領域への真菌の拡散が観察されました。耳小胞の周辺は、この拡散が発見された場所の1つです。真菌の発芽は、通常、幼虫の60%で5日間で見られました。食細胞クラスター面積、マクロファージの動員、および好中球の動員は、すべての幼虫で経時的に変化しました。実験を通じて上昇傾向にあるものもあれば、時間の経過とともに解決するものもあります。この手順は、CRISPRなどのゼブラフィッシュの遺伝子操作と組み合わせて、アスペルギルスに対する自然免疫応答を成功させるための特定の宿主経路の要件を決定することができます。このプロトコルにより、アスペルギルス属の自然免疫細胞の相互作用をリアルタイムで、生きた無傷の宿主で視覚化することが可能になりました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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