毒性試験のための空気中の粒子への現実的な反復吸入暴露のための気管支上皮モデル
2020年5月13日
説明は、毒性試験のために粒子への吸入を繰り返し暴露するためのインビトロ気管支モデルの細胞培養および曝露方法である。
このプロトコルは、空気を介してヒト気管支上皮細胞を培養および曝露する方法を説明しています。これは、吸入粒子への肺の曝露を研究するためのより現実的なモデルです。肺細胞は、肺の実際の環境に似せて、これらの方法で準備しました。細胞は粘液を生成し、緊密な障壁を形成し、数週間生存可能なままになります。この方法は、空気中の粒子の毒性影響を研究するために使用できます。また、気道の感染症や吸入によって摂取される薬物の研究にも使用できます。このプロトコルを初めて試すときは、アジャイルの生成には専門家の知識が必要であることに注意してください。また、測定には専用の機器が必要です。まず、予め加温した細胞培養培地またはCCMで細胞を希釈し、6ウェルインサートでミリリットルあたり500,000細胞の濃度にします。そして12ウェルの挿入のためのミリリットルごとの250、000の細胞。インサート付きの細胞培養プレートを無菌条件下で置き、基底側面に予め加温したCCMを充填します。細胞懸濁液を混合した後、細胞培養インサートのメンブレンの上にピペットで移します。プレートを覆い、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。細胞を水没した条件下で7日間培養し、2〜3日ごとにCCMを交換しながら、細胞がコンフルエントに達するようにします。経上皮電気抵抗を測定するには、箸電極セットを補充した荷電上皮電圧計を使用します。電極を70%エタノールで洗浄します。長い方の電極を、皿の底に触れるまで外部培養培地に入れます。そして、膜に触れることなく、媒体内の短い電極。セルのない空のインサートで測定値の収集を開始します。測定値が安定するまで待ち、抵抗をオームで書き留めます。この測定値は、セルやブランク抵抗のないインサートメンブレンの抵抗です。各インサートについて測定を繰り返し、ブランク抵抗を差し引いて真の抵抗を求め、インサートの表面積を掛けます。インサートの頂端側から培地を取り出し、ウェルの基底側に予め温めたCCMを追加します。メディウムは下からメンブレンに接触する必要がありますが、インサートの上部に漏れないようにする必要があります。インキュベーター内の気液界面で細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で7日間培養します。基底外側媒体は2〜3日ごとに交換します。粒子を曝露する直前に、1%ナノ粒子懸濁液を調製します。NPを96%エタノールで事前に湿らせます。純水を最終濃度1%NPsまで加え、バイアルを氷上のビーカーに入れます。懸濁液を16分間超音波処理し、分散液でボトルに攪拌を加え、次に小さなチューブを介してボトルを蠕動ポンプに接続し、流量を毎時25ミリリットルに調整します。露光の1日前に、自動露光ステーションまたはAESをオンにし、キャビネットの温度が37度に達するまで待ちます
概要
本研究では、毒性試験のために空気中の粒子への反復吸入曝露をシミュレートする、in vitro気管支モデルの開発に焦点を当てています。培養されたヒト気管支上皮細胞は長期的な生存能と現実的な粘液産生を示し、このモデルを毒性学的研究および感染症研究に適したものにしています。
研究の主要構成要素
研究分野
- 毒性学
- 呼吸生物学
- in vitro モデル
背景
- 現実的な肺曝露モデルの必要性
- 吸入粒子の研究の重要性
- ドラッグデリバリーおよび感染症研究への応用
使用方法
- ヒト気管支上皮細胞の細胞培養技術
- 気液界面培養条件
- 経上皮電気抵抗の測定
主な結果
- 細胞が強固なバリアを形成し、粘液を産生する
- 制御された条件下で数週間にわたり生存能が維持される
- 毒性評価への適用について手法が検証済みである
結論
- 開発されたモデルは、吸入粒子による肺への曝露を効果的に模倣している
- 毒性試験および呼吸器研究における重要な意義を持つ
よくある質問
産業上の重要性
現実的なin vitro気管支上皮モデルは、予測的な吸入毒性試験および呼吸器への薬剤配送研究において極めて重要です。Calu-3細胞を用いた気液界面（ALI）システムは、ヒト気道の条件を密接に模倣した反復的な低用量曝露研究を可能にし、化合物評価の初期段階におけるトランスレーショナルな信頼性を高めます。このアプローチは、呼吸器バイオ医薬品の開発パイプラインにおける、生理学的に妥当で再現性のあるモデルへのニーズに応えるものです。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 吸入化合物が気道上皮に及ぼす影響について、メカニズムに基づいたリスク低減を可能にする。
- タイトジャンクションと粘液産生を長期間維持することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
- 呼吸器毒性および安全性評価における予測の信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 上皮バリア機能の定量的測定のための、検証済みで再現性のあるシステムを提供します。
- 低濃度粒子の反復曝露におけるアッセイの標準化をサポートします。
- 連続フロー条件下での airborne compound（空気中化合物）の影響に関する信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルなバイオマーカー研究に適した、疾患関連気道モデルと整合しています。
- in vitroでの探索から前臨床吸入毒性ワークフローまでの一貫性を確保します。
- 現実的な曝露シナリオをモデル化することで、後期段階での脱落リスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このALI気管支モデルは、呼吸器治療薬および吸入毒性学における創薬から前臨床までの連続的な研究フローに統合されます。
- ディスカバリー生物学：気道バリア機能および粒子毒性に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：再現性のある定量的な経上皮電気抵抗および生存率の読み取り値を提供します。
- 分析：曝露濃度および投与量の継続的なモニタリングを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroでの知見を、疾患関連エンドポイントを用いた前臨床吸入研究へと繋げます。
- エンタープライズでの再利用：多様な空中粒子および薬剤研究に適応可能な標準化されたプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：呼吸毒性試験における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用上の価値：反復投与プロトコルの再現性とスケーラビリティを向上させます。
- 戦略的価値：呼吸器系ポートフォリオ開発におけるgo/no-go判断および資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：吸入化合物および製剤のリスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- ALI細胞培養および上皮バリア測定の専門知識が必要です。
- 連続フロー曝露および電気抵抗モニタリングのための専用装置が必要です。
- 曝露プロトコルおよびデータ解析に関するチーム間の標準化が求められます。
- モデルの制限範囲内であれば、さまざまな種類の空中粒子および濃度に適応可能です。
- 長期的な培養期間にわたる細胞生存率およびタイトジャンクションの完全性の維持に依存します。
