心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。

こんにちは、クリス・グレンボツキーです。私はフェニックスにあるアリゾナ大学医学部の医学教授です。そして、私はここフェニックスにあるトランスレーショナル心臓血管センターの所長です。

本日は、私たちの新しい技術を実演していただく2人の方、私のシニアポスドクフェローでトレーニング担当のエリック・ブラックウッド博士と、シニアリサーチアソシエイトのアリーナ・ビラルさんをご紹介したいと思います。現在の心筋細胞単離プロトコルでは、培養中の細胞の量と生存率が制限されており、心臓生理学と病態生理学の理解を深めるための実験的な行き詰まりが生じています。このプロトコルは、成体マウスの心臓細胞単離のプロセスを迅速化するだけでなく、1匹のマウス心臓から心房および心室心臓細胞の細胞収量と生存率を同時に増加させることも目的としています。

この技術は、治療薬の発見に深い意味を持ち、心房細動のような疾患を細胞種特異的なレベルでより適切に特徴付けることができるため、治療標的の特定が可能になります。以前に顕微手術の経験がない個人は、完全な分離プロトコルを試みる前に、上行大動脈口摘出術とカニューレ挿入ステップを広範囲に練習することをお勧めします。まず、ハサミを使用して正中線の皮膚を切開し、麻酔をかけた生後10週齢のC57ブラック6Jマウスの胸部を腹部中央部から顎まですばやく開きます。

腹膜に入り、鈍的解剖によって横隔膜をクリアします。両側の外側の胸壁に沿って切開して胸郭を切り取り、心臓と胸壁の間の繊維状の接続を切り取ります。胸郭を完全に取り除いた後、小さな鉗子とはさみを使用して、心臓の後面を露出させる頂点で心臓を優しく持ち上げます。

心臓を造設するには、上行大動脈の無名動脈よりすぐに下方を解剖し、すぐに心臓を氷のように冷たい心臓灌流培地に入れます。残りの組織をすばやく解剖して上行大動脈を露出させ、マイクロ解剖鉗子とハサミを使用して大動脈の周囲の領域から余分な組織を取り除きます。先端の細い鉗子を使用して、洗浄した大動脈を灌流カニューレに2mm位置に配置し、カニューレを5-0シルク縫合糸で固定します。

カニューレを装着した心臓を心臓灌流培地で毎分3ミリリットルの流量で4分間洗い流してから、消化バッファーに15〜17.5分間切り替えます。灌流の最後の数分間に、消化緩衝液の流れを8ミリリットル集め、カニューレから心臓をプラスチック製の60ミリメートル培養皿に移し、余分な組織を取り除き、心臓を消化緩衝液の2.5ミリリットルに浸します。心房細胞の単離では、心房を心臓から離剖し、750マイクロリットルの消化緩衝液を含むプラスチック製の30mm培養皿に心房を入れます。

先端の細い手術用ハサミを使用して、心房を細かく刻んでからかい、筋繊維を攪拌したり引き離したりせずに、細い鉗子で組織をさらに解剖します。滅菌トランスファーピペットチップを使用して、組織を15分間穏やかに混合し、解離し続けます。5分ごとに、明視野顕微鏡の10倍対物レンズの下で心房筋細胞の解離を観察します。

組織がさらに消化されるようになったら、細孔径の小さい滅菌トランスファーピペットチップを使用して組織を穏やかに混合および解離し続けてから、細胞懸濁液を滅菌済みの2ミリリットル微量遠心チューブに移します。30ミリメートルプレートを摂氏37度の筋細胞停止緩衝液1の750マイクロリットルですすぎ、その緩衝液を細胞懸濁液と組み合わせます。心房筋細胞を重力と穏やかに攪拌して室温で10分間沈降させます。

目に見えるペレットが形成されたら、細胞懸濁液を遠心分離し、心房筋細胞ペレットを乱さずに、上清を含む非筋細胞を15ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移します。非筋細胞画分を遠心分離し、非筋細胞ペレットを10%ウシ胎児血清を添加した10ミリリットルのDMEMに再懸濁します。カウント後、非筋細胞を適切な実験密度で下流の分析に供し、単離した心房筋細胞ペレットを適切な実験濃度で再懸濁して、ラミニン被覆培養プレートに播種します。

心室細胞の単離のためには、心房組織サンプルについて示したように心室心臓組織をミンチにし、得られた細胞懸濁液を摂氏37度の2.5ミリリットルの筋細胞停止緩衝液を含む15ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移す。解剖プレートを摂氏37度の筋細胞停止緩衝液1の2.5ミリリットルですすぎ、洗浄液と細胞懸濁液を組み合わせます。滅菌トランスファーピペットを使用して、組織を4分間穏やかに混合し、解離し続けます。

インキュベーションの終わりに、細胞の10マイクロリットルのアリコートを使用して、棒状の筋細胞の存在を確認します。細胞懸濁液を滅菌済みの100マイクロリットルナイロンフィルターに通し、50ミリリットルのポリプロピレンコニカルチューブに通し、以前に採取した消化緩衝液の2ミリリットルを使用して、滅菌ナイロンフィルターから残りの細胞を洗浄します。心室筋細胞を重力によって6分間沈降させ、チューブの底に見えるペレットが形成されるまで穏やかに攪拌します。

滅菌ピペットチップを使用して、心室筋細胞ペレットを乱さずに、非筋細胞含有上清を15ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移し、非筋細胞画分を遠心分離します。非筋細胞ペレットを10ミリリットルのDMEMに再懸濁し、10%ウシ胎児血清を添加してカウントし、細胞を下流の分析に適した濃度でプレートし、次に単離された心室筋細胞を2ミリリットルの筋細胞停止緩衝液2に再懸濁してカウントします。段階的なパラダイムカルシウム再導入を設定するには、50マイクロリットルの10ミリモル塩化カルシウムを心室筋細胞懸濁液に加え、室温で4分間インキュベートするために完全に混合します。

インキュベーションの最後に、さらに50マイクロリットルの10ミリモル塩化カルシウムを細胞に加え、室温でさらに4分間インキュベーションします。次に、100マイクロリットルの10ミリモル塩化カルシウムで1回の4分間インキュベーションと、80マイクロリットルの10ミリモル塩化カルシウムで1回の4分間インキュベーションで細胞を処理します。最後のインキュベーション後、カルシウム処理した心室筋細胞を、計画された下流の分析に従って適切な量の心室筋細胞プレーティング培地に再懸濁し、ラミニン被覆培養プレート上に細胞を播種します。

1時間後、上清を25マイクロモルのブレビスタチンを補充した心室筋細胞維持培地と交換します。.心筋トロポニンTは心筋細胞のマーカーであり、心房および心室の両方の心筋細胞培養で強力に発現します。対照的に、心房性ナトリウム利尿ペプチドとミオシン軽鎖2は、それぞれ心房および心室心筋細胞培養で堅牢かつ特異的に発現します。

線維芽細胞マーカーは、心房室と心室の両方から単離された非筋細胞培養物でのみ発現します。成体マウス心房筋細胞および成体マウス心室筋細胞のT尿細管マーカージヒドロピリジンおよびリアノジン受容体の免疫染色は、単離および長期培養全体を通じて無傷のT尿細管を示しています。肉腫縞模様は、単離された心筋細胞の純度と生存率を、棒状の形態とTO-PRO-3による核染色と組み合わせて評価するために使用できます。

予想通り、心室心筋細胞は大きく、平均長は約150マイクロメートルであるのに対し、心房心筋細胞は平均約75マイクロメートルです。さらに、免疫染色分析の結果、心房筋細胞は、小胞体および分泌顆粒への局在に特徴的な染色パターンで心房性ナトリウム利尿ペプチドの強力な発現を示します。心房筋細胞は基礎条件下で心房性ナトリウム利尿ペプチドを分泌しますが、分泌促進物質に応答して分泌が増加します。

さらに、心房性筋細胞は心房性ナトリウム利尿ペプチドを分泌し、共分泌はホルモンの一部をその前駆体状態から生成ペプチドにしか処理しません。最も一般的な回避可能なエラーには、犠牲の前に動物を落ち着かせなかった、灌流システムから気泡を排出しなかった、外科医自身が冷静さを保たなかったなどがあります。この手順に続いて、電気生理学的およびカルシウム処理パラメータのアッセイ、免疫細胞化学、肥大応答、シグナル伝達研究、およびシミュレートされた虚血再灌流研究など、一般的な実験手順を実行できます。