Name: 心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶ 成体マウス心臓から心房筋細胞、心室筋細胞、非筋細胞を同時に分離・培養する革新的な手法。高収率かつ高生存率で心臓病の治療標的解析に貢献します。

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E.A..Bは、国立衛生研究所(1F31HL140850)、ARCS財団、サンディエゴ支部、およびリーススティーリー研究財団フィリップスガウゼヴィッツ、SDSU心臓研究所のM.D.学者によってサポートされています。E.A.BとA.S..Bは稲盛財団の支援を受けています。CCG by (NIH) は、R01 HL135893、R01 HL141463 および HL149931 を付与します。

本論文で報告されたマウスに関して行われたすべての研究は、SDSU制度動物のケアと使用委員会によって審査され、承認されており、国立研究評議会が発表した実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠しています。
1. 分離・培養メディアの作成とめっき
<ol><li>ヨクリクの変更最小必須培地(MMEM)を1Lの滅菌水に添加して、使用前に1Lの心臓灌流培地を調製します。10 N NaOHでpHを7.36に調整し、0.2 μmフィルターを通してフィルターし、4°Cで最大2週間保存します。 注:ジョクリクMMEMは112 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl2、9mM NaH2PO4、および11.1 mM D-グルコースで構成されています。これは10 mM HEPES(2.38 g/L)、30 mMタウリン(3.75 g/L)、2 mM D-l-カルニチン(0.4 g/L)、2 mMクレアチン、および10 mMブタンジオンモノキシム(1.01 g/L)を補充する。</li>
	<li>灌流直前に消化バッファーを準備します: 100 mM CaCl2 の6.25 μL(ステップ1.3を参照)とコラゲラーゼタイプ2(酵素活性〜310〜310〜320 U/mg dw)で心臓灌流培地50 mLを補います。 注:犠牲の前に動物の重量を量る。消化バッファーに補うコラゲザーゼ2型の量は、動物の体重(体重1g当たり2型コラゲナーゼ2mg)によって決定される。</li>
	<li>100 mM CaCl2を準備するには、1.47 g の CaCl2 ~ 100 mL の分子生物学グレードの水を加えます。溶解するまで撹拌し、0.2 μmのフィルターを通過し、室温で最大2ヶ月間保存します。</li>
	<li>筋細胞停止バッファー 1 を、胎児ウシ血清 (FBS) の 10 mL と 100 mM CaCl2の 125 μL で 90 mL の心臓灌流バッファーを補って準備する。0.2 μmフィルターを通過し、4 °Cで最大2週間保管します。</li>
	<li>6 mLのFBSと10 mM CaCl2の150 μLで114mLの心臓灌流バッファーを補って、ミオサイト停止バッファー2を調製する。0.2 μmフィルターを通過し、4 °Cで最大2週間保管します。</li>
	<li>95 mLのDulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)を4 mLのFBS、100xペン/ストレップグルタミン1mL、100xインスリントランスフェリンセレン1mL、10μMデキサキサメゾン1mLで補充し、灌流直前に心房筋細胞メッキ培地を調製します。0.2 μmフィルターを通過し、めっきするまで37°Cで保管します。</li>
	<li>FBSの4 mL、100xペン/ストレパプタミンの1mL、1M HEPES溶液の10mL、100xインスリントランスフェリンセレンの1mL、ブタネジョンモノメの0.1 gで最低必須培地(MEM)の95 mLを補うことによって心室筋細胞めっき培地を準備する。0.2 μmフィルターを通過し、4 °Cで最大2週間保管します。</li>
	<li>100xインスリントランスフェリンセレン、0.1 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、1M HEPES溶液10mの10mLおよび100xペン/ストレップグルタミンの1mLでMEMの99 mLを補うことによって、心室筋細胞維持培地を準備する。0.2 μmフィルターを通過し、4 °Cで最大2週間保管します。</li>
	<li>ラミニンコーティング実験プレートおよびスライドを調製するために、マウスラミニンストック溶液(1.19mg/mL)を解凍します。DMEMの1 mLごとに10μLのラミニンストック溶液を加え、混合します。実験プレートとスライドを均等にコーティングし、37°C、5%CO2インキュベーターに少なくとも1時間、灌流前に保存して平衡を可能にします。 注:コーティングされた実験プレートとスライドは、最大2日間4°Cで保存することができます。</li>
</ol>2. 絶縁装置
<ol><li>各分離の前に、バブルトラップを上部に充填して70%EtOHの3回の完全な洗浄でシステムのチューブやその他のコンポーネントを清掃します(下のストップコックを閉じて、トップストップコックを開いたままにします)。</li>
	<li>バブルトラップを上部に充填して、完全なシステム3xを滅菌H2Oでリンスします(底栓を閉じて、トップストップコックを開いたままにします)。</li>
	<li>心臓灌流バッファーで完全なシステムをすすい出し、媒体で途中でバブルトラップを埋めます。</li>
	<li>循環水浴を37°Cに設定します。</li>
	<li>37°Cにメディア用の水浴を設定します。</li>
	<li>蠕動ポンプチューブ内の気泡を取り除く。</li>
	<li>蠕動ポンプの流量を3 mL/minに調整します。</li>
</ol>3. 外科手術(非生存)
<ol><li>手術器具を少なくとも5分間、70%のEtOHに浸す。</li>
	<li>心臓灌流媒体、筋細胞停止バッファー、及び消化バッファーを37°Cの水浴に入れる。</li>
	<li>心房筋細胞メッキ媒体、心室筋細胞めっき媒体、心室筋細胞メッキ培地、心室筋細胞維持培地を37°Cに入れ、5%CO2インキュベーターを使用する1時間前にカプセルを緩め、均衡を可能にしてキャップを緩める。</li>
	<li>10週齢の雄または雌のC57b6/jマウスを腹腔内(i.p.)に0.35mLのヘパリンで注入し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で100 IU/mLに希釈する。約10分間効果を出します。 注:2つの心臓がこの分離手順を受ける場合、第2のマウスは、最初の手順のこの時点で麻酔および投与ヘパリンすることができる。動物のストレスを最小限に抑えるために、気密シール誘導室で2%イオフルラン/酸素混合物を使用して軽麻酔を投与することができる。</li>
	<li>2%のイオフルラン/酸素混合物で動物を麻酔し、ペントバルビタール(10 mg/mLストックから0.3 mL)でi.p.を注入し、70%のEtOHでスワッピングして胸を準備します。</li>
	<li>結ばれた5-0シルク縫合糸を準備して、心臓を輸血カニューレに合う準備をします。外科顕微鏡のすぐ隣にカニューレを取り付ける。</li>
	<li>最初に中腹部から顎まで中腹部を切開し、大きなはさみで腹膜に入り、鈍い解剖によって横隔膜を取り除くことによって、すぐに胸を開く。その後、両側の側面の胸壁を切り取って、はさみを使用してリブケージを切り取ります。</li>
	<li>心臓と胸壁(胸腺を含む)の間の線維性の接続を切り取る。その後、リブケージをすべて一緒に切り取ります。小さな鉗子とはさみを使用して、心を頂点でそっと持ち上げ、心臓の後部側面を露出させる。</li>
	<li>上流大動脈の分母にすぐ劣った動脈を解剖することによって心臓を外に出し、すぐに氷冷PBSまたは冷たい心臓灌流媒体に心臓を置く。その後、氷冷心臓灌流媒体中の外植心臓から残りの組織を素早く解剖し、上昇大起を露出させる。 注:解剖学的ランドマークとして使用するには、胸腺をそのままにして心臓を植え出すのに便利です。</li>
	<li>過剰組織の大器官の周囲を、マイクロ解剖鉗子とはさみを使用して清掃します。細かい先端の鉗子を使用してカニューレに大オルタを置き、5-0シルク縫合糸で固定します。 注意:最良の配置は、通常、大オルタがカニューレの上に約2mm伸びて発生します。</li>
	<li>3 mL/minの流量で心の透過媒体を4分間、カニュード心臓に浸透させます。次に、メディアを心臓灌流メディアから、15.0~17.5分間の消化バッファーに切り替えます(図1A)。 注:冠動脈流量が増加する可能性が高く、効果的な組織消化(すなわち、青白く、腫れた心臓)を示す。</li>
	<li>ステップ5.4で後で使用するために、灌流の最後の分の間に消化バッファーの流れの8 mLを収集します。</li>
	<li>カニューレから心臓を取り出し、60mmのプラスチック文化皿の上に置きます。過剰な組織(大器官、静脈)を除去し、機械的分離に備えて2.5mLの消化バッファーで心臓を沈下する。 注:この時点で、心房は解剖され、1人の実験者が心房細胞分離プロトコルを実施し、2人目の実験者は心室細胞分離を行うべきです。</li>
</ol>4. 心房細胞の分離と培養
<ol><li>心臓から離れてアトリアを解剖し、30ミリメートルのプラスチック文化皿に置きます。機械的分離のために0.75 mLの消化バッファーに沈める。60 mm皿(ステップ3.12)に心室を入れておき、分離方法を同時に実行します(セクション5、図1B)。 注:この時点で、心房と心室は、左側および右側の細胞を分離する必要がある場合、さらなる分離を受けることができます。</li>
	<li>最初は細かい先端の外科用ハサミで、さらにミンチのための細かい鉗子が続いて、離れてアトリアをミンチといじめ始めます。組織を攪拌することを避け、そして急速に筋線維を引き離さない。</li>
	<li>無菌転移ピペットチップを使用して、15分間組織を穏やかに混合し、解体し続けます。5分ごとに、10倍の目的の明視野顕微鏡下で組織から心房筋細胞の解離を観察する。組織がさらに消化されるようになるにつれて、小さな細孔サイズで無菌転写ピペットチップを使用して組織を穏やかに混合し、解離し続けます。</li>
	<li>細胞懸濁液を2 mLの無菌マイクロ遠心分離チューブに移す。30 mmプレートを0.75 mLの37°Cの筋細胞停止バッファー1でリンスし、セル懸濁液(エンドボリューム= 1.5 mL)と組み合わせます。</li>
	<li>心房筋細胞を室温で10分間重力で沈下させます。細胞懸濁液を穏やかに攪拌し、筋細胞が円錐形チューブの底まで沈み込み、目に見えるペレットを形成するようにします。</li>
	<li>20 x gで 5 分間の細胞懸濁液を遠心分離します。非筋細胞を含む上清を慎重に除去し、心房筋細胞のペレットを乱すことなく滅菌ピペットチップを使用して15 mLポリプロピレンコニカルチューブに移す。</li>
	<li>遠心分離術非筋細胞分率は、20,000 x gで5分間.上清を吸引し、10%の胎児の子牛血清(FCS)を補充したDMEMの10 mLで非筋細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	<li>血球計または他の方法を用いて非筋細胞を数え、次に実験の必要性に従ってプレート、または蛍光活性化細胞分類を介して個々の特定細胞集団にさらに単離する(図1C)。</li>
	<li>心房筋細胞メッキ培地のステップ4.6から1mLの分離された心筋細胞のペレットを再懸濁し、この懸濁液の10μLを血球計に塗布する。棒状の筋細胞の細胞数をフィールドごとに実行します。</li>
	<li>予備コーティングされた実験プレート/スライドからラミニンを吸引し、25 μMブレビスタチンを添加した心房筋細胞メッキ培地の適切な体積で単離された心房筋細胞を再中断する。実験ニーズに応じて所望の密度でプレート(図1C)。 注:ここで説明する長期培養のための典型的なめっき密度は、4つのチャンバ(1.7 cm2)ガラススライド上の5 x 105細胞/チャンバーです。</li>
</ol>5. 心室細胞の分離と培養
<ol><li>最初に細かい先端の外科用ハサミで心臓をミンチといじめ、さらにミンチのための細かい鉗子を始める(図1B)。急速に筋線維を引き離すことによって組織を攪拌を避けます.</li>
	<li>セル懸濁液を15 mLポリプロピレンコニカルチューブに移します。プレートを37°Cのミオサイト停止バッファー1の2.5 mLでリンスし、セル懸濁液(エンドボリューム= 5 mL)と組み合わせます。</li>
	<li>滅菌転移ピペットチップを使用して、4分間組織を穏やかに混合し、解体し続けます。この細胞懸濁液の10 μLをスライドに塗布し、棒状の筋細胞の存在を可視化して、分離の質を確保します。</li>
	<li>100 μmの無菌ナイロンフィルターを通して、50 mL ポリプロピレン製の円錐形チューブにセル懸濁液を通します。手順3.12で収集した消化バッファーの2 mLを使用して、残りの細胞を滅菌ナイロンフィルターから洗い流します。</li>
	<li>心室筋細胞を室温で6分間重力で沈下させます。濾過された細胞懸濁液を穏やかに攪拌し、筋細胞が円錐の底に沈み込み、目に見えるペレットを形成することを可能にする。</li>
	<li>心室筋細胞のペレットを乱すことなく、上清(非筋細胞)を慎重に除去し、滅菌ピペットチップを使用して50 mLポリプロピレンコニカルチューブに移します。遠心分離術非筋細胞分率は、20,000 x gで5分間.上清を吸引し、非ミオサイトペレットを10%FCSで補ったDMEMの10mLで再懸濁する。</li>
	<li>血球計を使用して非筋細胞をカウントし、10%のFCSを補充したDMEMの適切な量で再中断します。そして、実験ニーズに応じたプレート、又は蛍光活性化細胞分類を介して個々の特異的細胞集団にさらに単離する(図1C)。</li>
	<li>2 mLの筋細胞停止バッファー2で分離した心室筋細胞を再懸濁し、10 μLの細胞懸濁液を血球計に塗布する。棒状の筋細胞の細胞数をフィールドごとに実行します。</li>
	<li>ステップワイズパラダイムを用いたCa2+ の再導入 注:カルシウム再導入ステップは心室筋細胞に特異的であり、細胞死をもたらすため、心房筋細胞に対しては行うべきではない。<ol>
<li>50 μLの 10 mM CaCl2 を心室筋細胞懸濁液に加えます。よく混ぜて、室温で4分間インキュベートします。</li>
		<li>さらに50 μLの10 mMCaCl2 を心室筋細胞懸濁液に加えます。よく混ぜて、室温で4分間インキュベートします。</li>
		<li>10 mM CaCl2 の 100 μL を心室筋細胞懸濁液に追加します。よく混ぜて、室温で4分間インキュベートします。</li>
		<li>心室筋細胞懸濁液に80μLの100 mMCaCl2 を加えます。よく混ぜて、室温で4分間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>プレートまたはスライドからラミニンコーティングを除去し、実験的ニーズに応じて適切な量の心室筋細胞めっき媒体で孤立した心室筋細胞を再中断する(図1C)。 注:ここで説明する長期培養のための典型的なめっき密度は、4つのチャンバ(1.7 cm2)ガラススライド上の5 x 105細胞/チャンバーです。75%以上の密度でめっきを避け、細胞過緻密化が細胞の凝集を促進し、それによってプレートへの付着を阻害するように。さらに、最初の中規模の変化の間に多数の細胞が失われます。細胞外Ca2+が過剰収縮および生存可能な筋細胞の喪失を促進するので、細胞は単離後に素早く細胞を培養する。</li>
	<li>心室筋細胞が少なくとも1時間沈着するようにします。その後、25 μM ブレビスタチンを添加した培地を維持する心室筋細胞にメディアを変更します。 注意:心室筋細胞はμMブレビスタチンでめっきした後96時間まで培養することができる。ブレビスタチンがない場合に心室筋細胞維持培地で実験を行う必要があります。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで説明する手順を用いて単離される細胞の質は、培養中の細胞の収量および全体的な健康状態によって決定されるように、多数の制御可能な因子に依存する。マウス自体から、動物に課せられたストレスが培養中の細胞収量および生存率に悪影響を及ぼす可能性が文書化されており、おそらく過剰な全身性コルチゾール、カテコールアミン、および心臓組織2、5、7の過収縮状態に起因する。これらの理由から、犠牲を払う前に動物を驚かせないように対策を講じるべきである。このような措置には、動物のケージを覆い、犠牲の前にビバリウム外の時間を制限することが含まれます。安楽死に一般的に使用されるヘパリンおよび多くのバルビツール酸塩は、シグナル伝達経路に影響を与える可能性があります。したがって、安楽死の最適な方法は、それに応じてカスタマイズする必要があります。動物の年齢は、単離された細胞の質および生存率にかなりの影響を及ぼし、最も可能性の高い老化過程と同時に起こる間質線維化の進行性蓄積に起因し、組織消化に影響を及ぼす可能性がある25。ここで提示されていないデータでは、上記の方法は生後78週までのマウスで働くが、これらの古い動物では細胞の質が低かった。
記述された分離プロセスにおける最も重要なステップは、逆行灌流のためのランゲンドルフ装置を特徴とする他のプロトコルと同様に、心臓のカヌレーションおよび初期灌流である。最適な結果を得るには、心臓の排泄から上昇大オルタのカヌルへの時間と灌流の開始は90秒以下でなければなりません。時間に加えて、2つの追加の重要な要因は、カニューレの深さと灌流装置から空気塞栓を導入する可能性です。したがって、カニューレは大動脈根に入らず、冠状血管の灌流を損なう大動脈弁を妨げないように、上に大動脈に進むべきである。
消化プロセス中に、心臓筋細胞カルシウム耐性を低下させる消化酵素コラゲザーゼへの長期暴露を避けるために、定期的に心臓の剛性をテストすることが重要です。孤立した心室筋細胞培養へのカルシウム再導入のために上記のプロトコルは、店舗運営のカルシウムチャネルを介して不適切なカルシウム流入を介して心臓筋細胞死を制限するように設計された。これは、短期および長期培養12の間に細胞死を促進するので、段階的なカルシウム再導入は、単離心房筋細胞培養のために行われるべきではないことを留意すべきである。さらなる予防のために、ここで使用される灌流および消化バッファーには、単離された筋細胞の過収縮を避けるために心筋収縮抑制剤ブタンジオン単酸素(BDM)、ならびにカルシウムパラドックスが含まれ、いずれも筋細胞生存率26に影響を与える。しかし、BDMからブレビスタチンへの切り替えは、単離心臓筋細胞用の培地を維持する上で好ましい抗収縮剤であるため、注意すべきである。示されていないデータでは、ブレビスタチンは、単離心臓筋細胞の長期培養に対するより大きな生存率を打ち明ける。
単離直後に、心臓細胞、特に筋細胞の長期培養の影響を考慮することが重要である。ここで説明する心臓非筋細胞の分離および培養プロトコルは、異なる心臓細胞の異なる密度および接着特性を利用する一般的な方法に基づいている。非筋細胞の利点は、文化におけるその高い拡大の可能性です。したがって、心臓筋細胞とは異なり、それらは永続性のために通過可能である。しかし、FBSによる培地補充を含む培養条件が心臓筋細胞機能27に影響を及ぼす可能性が知られている。ここで説明する培養培地は、特に単離心筋細胞に対して、生存率を最適化し、機能的変性を制限するように設計された。ブレビスタチン補充がない培養後の単離心臓筋細胞では、収縮能力の異常は認められなかったが、肉体構造と分子シグネチャが依然として無傷の心臓を模倣している場合、電気生理学、収縮性、および生体内の単細胞に焦点を当てた研究は、単離後すぐに行われるべきである。
心房筋細胞の特徴は、収縮機能に加えて、膨大な分泌能力を持つ内分泌細胞として月光を灯す能力である。生理学的条件下では、心房筋細胞は、刺激を受けると調節された興奮性に備えて、小胞体および大きな高密度分泌顆粒に貯蔵されるANPを大量に産生する。多くの孤立した心房筋細胞研究は、そのユニークな電気生理学的特性に焦点を当てていますが、これは培養培地を設計する最初の研究です。これは、長期の生存可能性だけでなく、心房筋細胞の内分泌および収縮特性の維持機能の促進を可能にする。この新しい培養方法は、単一マウス心臓からの心房室および心室室からの全ての細胞タイプの同時単離と同様に、心房および心室筋細胞の生理学的および病理的特性に関する研究に有用かつ有効であろう。

一次細胞培養は、心臓筋細胞機能の詳細な機械学的研究のための制御された環境を提供する不可欠な資源である。そのより耐久性があり、孤立しやすさのために、新生児ラット心房および心室筋細胞は、そのような細胞培養の共通の供給源であった1.しかし、成人マウス心房および心室筋細胞(AMAMおよびAMMV)は、その分子および機能的特性が成人の心臓細胞の分子および機能特性をよりよく模倣するため、インビトロ研究に非常に望ましい。したがって、それらは心臓病理に関連する研究に関連するようになり、そのほとんどは成人2で発症する。
さらに、トランスジェニックおよび疾患マウスモデルの利用可能性および使用は、単離された成人心筋細胞の有用性を拡大する。マウス AM の分離と、短期および長期の研究のための培養プロトコルは、多数の以前の出版物2、3、4、5、6、7、8、9、10、11.これに対し、Amam の分離に関するプロトコルはほとんど説明されていません。さらに、記載されているものは、主に、現在11、12、13に記載された長期培養プロトコルを有する、新たに単離された細胞の急性研究のために最適化される。そのため、AMAM 分離プロトコルは、AMVM の分離と文化に対して公開されたプロトコルの有用性と汎用性を提供するようには設計されていません。さらに、AMAMとAMVの分離に関する先駆的な研究は豊富であることが証明されていますが、AMAMとAMVMの両方の最適な同時分離と文化のためのプロトコルはなく、各準備のために心臓全体を効率的に使用します。
これまで、公開されたAMAMおよびAMVM絶縁プロトコルは、心房および心室機能に関するほとんどの研究がチャンバー固有の焦点を有するため、両方の細胞タイプの同時分離のために設計されなかった。例えば、AMAMは、米国で最も一般的な心臓不整脈である心房細動(AF)への関心もあって、心房筋細胞電気生理学を研究するために主に使用されています。しかし、AFは単独で心房に影響を与える疾患ではなく、軽度から重度の左心室機能不全14に原因となる役割を有するものとして関与している。さらに、保存された駆出率(HFpEF)を有する心不全患者からの心電図は、左心房サイズが心不全15に対する感受性の最も強い予測値の1つであることを示している。
電気生理学や収縮性におけるその役割に加えて、心房は内分泌器官でもあり、心管内圧(すなわち心房性心内尿素ペプチド[ANP])を恒分的に調節する心房性心内尿素ペプチド(ANP)を、16,17に恒分的に調節する。また、ANP(おそらく心房筋細胞由来)は、心室筋細胞16,17において顕著な保護及び抗肥大的役割を有する。様々な疾患状態における心房と心室の間の神経ホルモンコミュニケーションには強い意味があるが、このコミュニケーションの根底にあるメカニズムは十分に探求されていない。この点はさらに、疾患の機能としての心臓リモデリングが心筋細胞生存率および世界的な心機能18、19、20、21、22に直接影響を及ぼす疾患の非筋細胞(特に心臓線維芽細胞および免疫細胞)の役割を1)に焦点を当てた研究の急増によって例示される。したがって、心房と心室の両方から心臓細胞を研究することは、心臓病理生理学における彼らの役割のより完全な画像を得るために必要なアプローチである。
以下のプロトコルは、生理学的および病的生理学的条件下での単一のマウス心臓からの心房および心室筋細胞および非筋細胞の同時分離を記述する。さらに、心室筋細胞の培養を維持するための条件が既に発表されているとして、心房心筋細胞の培養を維持するために必要な最適な条件を記述する最初の方法である。

<table><tbody><tr><td>(-)-ブレビスタチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0560</td><td></td></tr><tr><td>1リットルウォータージャケットリザー</td><td>バーRadnoti</td><td>120142-1</td><td></td></tr><tr><td>2,3-ブタンジオンモノキシム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>5-0シルク縫合糸ファイン</td><td>サイエンスツール</td><td>18020-50</td><td></td></tr>ア<tr><td>デノシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>バブルトラップ コンプライアンスチャンバー</td><td>ラドノチ</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム 無水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>塩酸カルニチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C9500</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 2型</td><td>ワージントン バイオケミカル コーポレーション</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>クレアチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1; 1X)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescent micropscpe</td><td>Olympus X70</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td><td>オメガサイエンティフィック</td><td>FB-12</td><td>Lot# 206018</td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Headband Magnifiers</td><td>Fine Science Tools</td><td>28030-04</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤 (Bright-Line)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>イノシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4125</td><td></td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 105 ウォーターバス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>NC0858659</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>13-874-182</td><td></td></tr><tr><td>Joklik 修正最小エッセンシャル メディア</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-0518</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン (ナチュラル、マウス)</td><td>Gibco</td><td>1795024</td><td>Lot# 1735572</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex C/L シングルチャンネル可変速コンパクトポンプ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM 1X)</td><td>Gibco</td><td>12350-039</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学グレード ウォーター</td><td>コーニング</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>ペン連鎖球菌グルタミン (100X)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ - 6mm カッティングエッジ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15020-15</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T-8691</td><td></td></tr></tbody></table>

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

マウスからの心臓筋細胞の分離と培養は、心臓生理学および病態生理学の理解を促進するために不可欠であった。新生児マウスの心臓から筋細胞を単離することは比較的簡単であるが、成人マウスの心臓からの筋細胞が好ましい。これは、新生児細胞と比較して、成人筋細胞は生体内の成人心臓において起こるように細胞機能をより正確に再現するためである。 しかし、実験の行き詰まりに寄与する必要な量と生存率で成人マウス心臓筋細胞を分離することは技術的に困難である。さらに、公開された手順は、心房および心室非筋細胞細胞を犠牲にして心房または心室筋細胞の単離に特異的である。ここでは、心房と心室心筋細胞の両方を単一のマウス心臓から同時に心房および心室非筋細胞と共に単離するための詳細な方法を説明する。また、細胞の生存率と機能を高める最適な細胞特異的培養方法の詳細も提供されています。このプロトコルは、成人マウス心臓細胞の分離のプロセスを促進するだけでなく、心房および心室心細胞の調査のための細胞の収量および生存率を高めることを目的としている。

野生型の10週齢のC57b6/jマウス心臓は、通常、75,000-150,000心房筋細胞と1.0-1.5 x 106心室筋細胞の間で生じ、心房および心室筋細胞18、19のおよその収量に相当する。分離中および直後に、実行可能な心臓筋細胞は、棒状および非収縮に見えるべきである。孤立した心臓筋細胞の大部分は、効果的な灌流の指標であるこの形態を適応させるべきである。また、棒状形態は生存率の予測変数としても使用できます。このプロトコルは、病気のマウス心臓から分離された筋細胞および非筋細胞の収量および生存率を高めることを目的としている。さらに、過負荷誘発心不全のモデルで試験されている(データは示していない)。
心房組織および心室組織からの筋細胞および非筋細胞の適切かつ複製可能な分離を確認するために、培養中の様々な日に細胞を観察し、撮影した(図2)。さらに、定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を行い、細胞型特異的であった転写物のレベルを測定した。心臓筋トロポニンT(Tnnt2)は心筋細胞のマーカーであり、心房および心室心筋細胞培養の両方で強固に発現した(図3A)。対照的に、心房性心尿酸ペプチド(Nppaは、生理学的条件下で成人心房心筋細胞に排他的に発現する典型的な)および筋細胞軽鎖2(心室筋細胞特異的遺伝子であるMyl2)は、それぞれ心房および心室心筋細胞培養物において強く特異的に発現した( 図3B,C)。
線維芽細胞マーカーは、転写因子21(Tcf21)、血小板由来成長因子受容体A(Pdgfra)、および分化68(Cd68)の単球由来細胞マーカークラスターを、心房および心室の両方から分離した非筋細胞培養物で排他的に発現した(図3D−F)。非筋細胞は、全ての心臓細胞の65%を侵害し、これらの大部分は線維芽細胞または単球由来系統18、19、23、24に由来すると推定される。したがって、これらの2系統のマーカーは、心臓病理学の様々なモデルおよび病因の研究におけるこれらの細胞集団への関心を考えると、代表的なものとして選ばれた。
t-tubuleマーカージヒドロピリジン(DHPR、電圧依存(L)型カルシウムチャネル)およびリアノジン受容体(RYR2)に対するAMAMおよびAMMVの免疫染色は、単離および長期培養を通じて無傷のチューブを実証した(図4A,B)。心房および心室筋細胞に特有のDHPRおよび局在性の豊富さは、t-tubuleの存在を示した。さらに、DHPRとRYR2免疫染色の共局在化は、無傷のダイアッド構造の指標であった。心房および心室心筋細胞における肉体タンパク質α-アクチニンの免疫染色は、予想される肉体線条体パターンをもたらした。肉体線条発パターンは、棒状の形態形状およびTOPRO-3との核染色と併せて、単離心臓筋細胞の純度および生存率を評価するために使用された(図4C,D;紫および赤色)。予想通り、心室心筋細胞は大きかったが、平均長さは〜150mm、心房心筋細胞は平均〜75mmであった。さらに、免疫染色分析の際、心房心筋細胞(心室心筋細胞ではないが)は、心内用性心筋細胞(ANP)の強い発現を示し、小胞体および分泌顆粒に局在化する特徴である染色パターンを示した(図4C、D;緑色)。
心房心筋細胞に特有の特徴は、収縮細胞に加えて内分泌細胞としての分類である。心房筋細胞は基底条件下でANPを分泌するが、分泌物は分泌物(すなわち、αアドレナリン作動薬、フェニレフリン[PE])に応答して増加する。また、心房心筋細胞はANPを分泌し、その前駆体状態(Pro-ANP,15kD)から生成ペプチド(ANP3kD)16,17にホルモンの一部を共同分泌処理する。この分泌能は、急性PE治療に応答して単離された心房心筋細胞の培地中のANPの免疫ブロット検出を介して定量することができる(図4E)。心房心筋細胞のこの分泌および処理能力は、培養条件に敏感であることが判明した。したがって、心房筋細胞めっき培地は、デキサメタゾン、インスリン、トランスフェリン、セレンを添加することが不可欠である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig1.jpg"> 図1:逆行性の心臓灌流、消化、および細胞分離の概略図。 示されているのは、単一のマウス心臓からの心房および心室の両方からの細胞分離に関与する主なステップである。(A)単一のマウス心臓は、上昇大オルタを介して急速にカニューレ化され、逆行的に浸透する。(B) 心は心房と心室組織に分離され、さらなる消化と物理的分離が可能である。(C)適切な消化に続いて、細胞は重力濾過を介して、その後の実験のために培養される合計4つの細胞分画に分離される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig2.jpg"> 図2:培養中の単離心房および心室心筋細胞および非筋細胞の形態学的解析(A)単離された成体マウス心房筋細胞(AMAM)、(B)成人マウス心房非筋細胞(AMANMs)、(C)成体マウス心室筋細胞(AMVMs)、または(D)成体マウス心室非筋細胞(AMVNM)を4つのチャンバー(1.7cm)スライドでメッキした。位相画像は、10x目的を使用した培養中の示された日に、蛍光顕微鏡で得られた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig3.jpg"> 図3:分離細胞培養の代表的なqRT-PCR分析。RNAは、新たに単離された心臓筋細胞および非筋細胞から抽出し、細胞特異的遺伝子マーカーに対するmRNAレベルをqRT-PCR4により求めた。(A) Tnnt2、心筋トロポニンT(心臓筋細胞マーカー);(B)Nppa、心房性経尿毒ペプチド(心房筋細胞マーカー);(C) Myl2、筋細胞軽鎖2(心室筋細胞マーカー);(D) Tcf21, 転写因子 21 (線維芽細胞マーカー);(E) Pdgfra, 血小板由来増殖因子受容体 A (線維芽細胞マーカー);(F)Cd68、分化68のクラスター(単球由来細胞マーカー)。データは、SEM±平均値(*p≤、ANOVAによって決定された他のすべての値とは異なる0.05を表し、その後にニューマン・キュールのポストホック分析が続く)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61224/61224fig4.jpg"> 図4:孤立した心房および心室心筋膜の代表的な形態学的および機能的分析。(A)AMAMまたは(B)AMMは、接着を可能にするために、各めっき媒体の4つのチャンバー(1.7 cm2)のガラススライドに5 x 105細胞/チャンバーでメッキを行った。その後、心房筋細胞めっき培地を再給餌するか、またはブレビスタチンを補充した心室筋細胞維持培地に16時間変更した。その後、培養物を、RYR2(紫)、DHPR(緑色)、及び核染色TOPRO-3(赤色)について免疫染色を行った。(C) AMAM または (D) AMVM を単離してメッキし、アクチニン (紫色)、ANP (緑)、および TOPRO-3 (赤) に対して免疫染色した。各セルの種類に対応する 2 つの代表的なイメージを示します。(E) AAMを、心房筋細胞メッキ媒体中の12個のウェル培養皿に5 x 105細胞/ウェルでメッキした。AMAMは、その後、培地を収集してANPのイムノブロット分析を行う前に、車両またはANP分泌物(フェニレフリン、50mM)で0.5時間治療した。イムノブロット分析の前に、培地サンプルを5分間500 x gで遠心分離し、細胞の破片を除去し、観察されたANPがAMAMからの能動分泌の結果であることを確認した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61224/61224fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

こんにちは、クリス・グレンボツキーです。私はフェニックスにあるアリゾナ大学医学部の医学教授です。そして、私はここフェニックスにあるトランスレーショナル心臓血管センターの所長です。本日は、私たちの新しい技術を実演していただく2人の方、私のシニアポスドクフェローでトレーニング担当のエリック・ブラックウッド博士と、シニアリサーチアソシエイトのアリーナ・ビラルさんをご紹介したいと思います。現在の心筋細胞単離プロトコルでは、培養中の細胞の量と生存率が制限されており、心臓生理学と病態生理学の理解を深めるための実験的な行き詰まりが生じています。このプロトコルは、成体マウスの心臓細胞単離のプロセスを迅速化するだけでなく、1匹のマウス心臓から心房および心室心臓細胞の細胞収量と生存率を同時に増加させることも目的としています。この技術は、治療薬の発見に深い意味を持ち、心房細動のような疾患を細胞種特異的なレベルでより適切に特徴付けることができるため、治療標的の特定が可能になります。以前に顕微手術の経験がない個人は、完全な分離プロトコルを試みる前に、上行大動脈口摘出術とカニューレ挿入ステップを広範囲に練習することをお勧めします。まず、ハサミを使用して正中線の皮膚を切開し、麻酔をかけた生後10週齢のC57ブラック6Jマウスの胸部を腹部中央部から顎まですばやく開きます。腹膜に入り、鈍的解剖によって横隔膜をクリアします。両側の外側の胸壁に沿って切開して胸郭を切り取り、心臓と胸壁の間の繊維状の接続を切り取ります。胸郭を完全に取り除いた後、小さな鉗子とはさみを使用して、心臓の後面を露出させる頂点で心臓を優しく持ち上げます。心臓を造設するには、上行大動脈の無名動脈よりすぐに下方を解剖し、すぐに心臓を氷のように冷たい心臓灌流培地に入れます。残りの組織をすばやく解剖して上行大動脈を露出させ、マイクロ解剖鉗子とハサミを使用して大動脈の周囲の領域から余分な組織を取り除きます。先端の細い鉗子を使用して、洗浄した大動脈を灌流カニューレに2mm位置に配置し、カニューレを5-0シルク縫合糸で固定します。カニューレを装着した心臓を心臓灌流培地で毎分3ミリリットルの流量で4分間洗い流してから、消化バッファーに15〜17.5分間切り替えます。灌流の最後の数分間に、消化緩衝液の流れを8ミリリットル集め、カニューレから心臓をプラスチック製の60ミリメートル培養皿に移し、余分な組織を取り除き、心臓を消化緩衝液の2.5ミリリットルに浸します。心房細胞の単離では、心房を心臓から離剖し、750マイクロリットルの消化緩衝液を含むプラスチック製の30mm培養皿に心房を入れます。先端の細い手術用ハサミを使用して、心房を細かく刻んでからかい、筋繊維を攪拌したり引き離したりせずに、細い鉗子で組織をさらに解剖します。滅菌トランスファーピペットチップを使用して、組織を15分間穏やかに混合し、解離し続けます。5分ごとに、明視野顕微鏡の10倍対物レンズの下で心房筋細胞の解離を観察します。組織がさらに消化されるようになったら、細孔径の小さい滅菌トランスファーピペットチップを使用して組織を穏やかに混合および解離し続けてから、細胞懸濁液を滅菌済みの2ミリリットル微量遠心チューブに移します。30ミリメートルプレートを摂氏37度の筋細胞停止緩衝液1の750マイクロリットルですすぎ、その緩衝液を細胞懸濁液と組み合わせます。心房筋細胞を重力と穏やかに攪拌して室温で10分間沈降させます。目に見えるペレットが形成されたら、細胞懸濁液を遠心分離し、心房筋細胞ペレットを乱さずに、上清を含む非筋細胞を15ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移します。非筋細胞画分を遠心分離し、非筋細胞ペレットを10%ウシ胎児血清を添加した10ミリリットルのDMEMに再懸濁します。カウント後、非筋細胞を適切な実験密度で下流の分析に供し、単離した心房筋細胞ペレットを適切な実験濃度で再懸濁して、ラミニン被覆培養プレートに播種します。心室細胞の単離のためには、心房組織サンプルについて示したように心室心臓組織をミンチにし、得られた細胞懸濁液を摂氏37度の2.5ミリリットルの筋細胞停止緩衝液を含む15ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移す。解剖プレートを摂氏37度の筋細胞停止緩衝液1の2.5ミリリットルですすぎ、洗浄液と細胞懸濁液を組み合わせます。滅菌トランスファーピペットを使用して、組織を4分間穏やかに混合し、解離し続けます。インキュベーションの終わりに、細胞の10マイクロリットルのアリコートを使用して、棒状の筋細胞の存在を確認します。細胞懸濁液を滅菌済みの100マイクロリットルナイロンフィルターに通し、50ミリリットルのポリプロピレンコニカルチューブに通し、以前に採取した消化緩衝液の2ミリリットルを使用して、滅菌ナイロンフィルターから残りの細胞を洗浄します。心室筋細胞を重力によって6分間沈降させ、チューブの底に見えるペレットが形成されるまで穏やかに攪拌します。滅菌ピペットチップを使用して、心室筋細胞ペレットを乱さずに、非筋細胞含有上清を15ミリリットルのポリプロピレン円錐管に移し、非筋細胞画分を遠心分離します。非筋細胞ペレットを10ミリリットルのDMEMに再懸濁し、10%ウシ胎児血清を添加してカウントし、細胞を下流の分析に適した濃度でプレートし、次に単離された心室筋細胞を2ミリリットルの筋細胞停止緩衝液2に再懸濁してカウントします。段階的なパラダイムカルシウム再導入を設定するには、50マイクロリットルの10ミリモル塩化カルシウムを心室筋細胞懸濁液に加え、室温で4分間インキュベートするために完全に混合します。インキュベーションの最後に、さらに50マイクロリットルの10ミリモル塩化カルシウムを細胞に加え、室温でさらに4分間インキュベーションします。次に、100マイクロリットルの10ミリモル塩化カルシウムで1回の4分間インキュベーションと、80マイクロリットルの10ミリモル塩化カルシウムで1回の4分間インキュベーションで細胞を処理します。最後のインキュベーション後、カルシウム処理した心室筋細胞を、計画された下流の分析に従って適切な量の心室筋細胞プレーティング培地に再懸濁し、ラミニン被覆培養プレート上に細胞を播種します。1時間後、上清を25マイクロモルのブレビスタチンを補充した心室筋細胞維持培地と交換します。.心筋トロポニンTは心筋細胞のマーカーであり、心房および心室の両方の心筋細胞培養で強力に発現します。対照的に、心房性ナトリウム利尿ペプチドとミオシン軽鎖2は、それぞれ心房および心室心筋細胞培養で堅牢かつ特異的に発現します。線維芽細胞マーカーは、心房室と心室の両方から単離された非筋細胞培養物でのみ発現します。成体マウス心房筋細胞および成体マウス心室筋細胞のT尿細管マーカージヒドロピリジンおよびリアノジン受容体の免疫染色は、単離および長期培養全体を通じて無傷のT尿細管を示しています。肉腫縞模様は、単離された心筋細胞の純度と生存率を、棒状の形態とTO-PRO-3による核染色と組み合わせて評価するために使用できます。予想通り、心室心筋細胞は大きく、平均長は約150マイクロメートルであるのに対し、心房心筋細胞は平均約75マイクロメートルです。さらに、免疫染色分析の結果、心房筋細胞は、小胞体および分泌顆粒への局在に特徴的な染色パターンで心房性ナトリウム利尿ペプチドの強力な発現を示します。心房筋細胞は基礎条件下で心房性ナトリウム利尿ペプチドを分泌しますが、分泌促進物質に応答して分泌が増加します。さらに、心房性筋細胞は心房性ナトリウム利尿ペプチドを分泌し、共分泌はホルモンの一部をその前駆体状態から生成ペプチドにしか処理しません。最も一般的な回避可能なエラーには、犠牲の前に動物を落ち着かせなかった、灌流システムから気泡を排出しなかった、外科医自身が冷静さを保たなかったなどがあります。この手順に続いて、電気生理学的およびカルシウム処理パラメータのアッセイ、免疫細胞化学、肥大応答、シグナル伝達研究、およびシミュレートされた虚血再灌流研究など、一般的な実験手順を実行できます。

simultaneous-isolation-culture-atrial-myocytes-ventricular-myocytes

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、細胞内Caために使用することができ、ヒト心房筋細胞の単離を記載...

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

我々は、成体マウス心筋細胞の単離のための信頼できる方法を記載している。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能大人の心筋細胞の培養のための一貫性のある結果が得られます。...

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

このプロトコルは、成体マウス心筋細胞の再現性のある単離と長期培養のための段階的な方法を説明しています。これは、高収率、純度、および生存率を備えています。...

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

方法は、パッチクランプ電気生理学やイメージング研究のための成体マウスから洞房結節筋細胞（のSAM）の単離のために実証されています。単離された細胞を直接使用することができ、またはそのような遺伝的にコードされたレポーターとして、関心対象のタンパク質の発現を可能にするために、培養物中に維持することができます。...

成体マウスから洞房結節筋細胞の単離、培養、および機能解析のための方法

ラット心臓から様々な心臓細胞型を単離するためのいくつかのプロトコールが開発され、記載されている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にし、実験コストを削減する最適化プロトコルが記載されている。...

成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

このプロトコルは、チャンク消化アプローチを使用して、成人マウス心臓から単一の心筋細胞を単一の心筋細胞を分離するために使用される。このアプローチは、パッチクランプ研究で心房筋細胞電気生理学を特徴付けるために使用できる右または左心房筋細胞を単離するために使用されます。...

成体マウスからの心房筋細胞の単離

ここでは、成体マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、および長期培養のためのプロトコルを提示する。...

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

前向き灌流法により、高品質のマウスの心臓細胞を単離するためのシンプルe...

マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

このプロトコルは、成体マウスからの心房および心室筋細胞の同時分離のための大歯カンヌレーションの深さを含むランゲンドルフ法の修飾を記述する。...

成体マウスからの心房と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の改変

学ぶ 成体マウス心臓から心房筋細胞、心室筋細胞、非筋細胞を同時に分離・培養する革新的な手法。高収率かつ高生存率で心臓病の治療標的解析に貢献します。

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

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