脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節
July 23rd, 2020
Ex vivo脳スライスは、求心性入力に対する誘発反応に対する揮発性麻酔薬の効果を研究するために使用できます。光遺伝学は、視床皮質および皮質皮質求心性神経を非原発性新皮質に独立して活性化するために使用され、シナプスおよびネットワーク応答はイソフルランで調節されます。
このプロトコルは、揮発性麻酔薬が他のものよりも一部の概要を混乱させるかどうかを調査し、その影響が細胞型であるか経路特異的であるかを判断し、集団レベルでどのような影響が発生するかを判断するために使用できます。この技術の主な利点は、揮発性麻酔薬の効果を評価できる特異性です。特定の経路と細胞タイプを標的とし、同時に集団活性をアッセイできます。
切片化のための組織ブロックを準備することから始めます。脳を頭蓋骨の空洞からそっと持ち上げ、濾紙の上に置きます。正中線に平行な脳の矢状面に沿って切り込みを入れ、この矢状面に組織ブロックを配置します。
濾紙をブロッキングテンプレートにガイドし、脳を下にあるテンプレートのアウトラインに合わせます。テンプレートの線で示されているように、冠状面に平行なカットを行い、必要に応じて濾紙を濡らしておくためにスライスaCSFを少し加えます。組織ブロックを摂氏4度に置き、aCSFをスライスし、氷冷した試料ステージに少量の接着剤を塗布します。
スライスしたaCSFからティッシュブロックを持ち上げ、吸収性タオルの角で余分な溶液を吸い取ります。組織ブロックの後冠状面を標本ステージに接着し、脳の背側表面をサファイアブレードに向けて接着します。厚さ500マイクロメートルの冠状脳スライスを収集し、摂氏34度のナイロンメッシュにsicf
スライスします。容器を室温に戻します。イソフルランを溶解した実験用aCSFバッグを調製するには、600ミリリットルの実験用aCSFと600ミリリットルの95%酸素と5%二酸化炭素ガスの混合物を空のポリテトラフルオロエチレンガスバッグに加えます。このバッグコントロールにラベルを付けます。
300ミリリットルの実験用aCSFを別のポリテトラフルオロエチレンガスバッグに加え、このバッグにイソフルランを標識します。原稿の指示に従ってイソフルランバッグの準備を進めます。各プロファイルに波形をランダムに割り当てることにより、光シミュレーションプロトコルを設定します。
各プロファイルとそれに割り当てられた波形は、デジタルTTL入力からの1つのトリガーパルスまたは1つの試行に対応します。終了したら、プロファイル順序を保存します。マルチチャンネルプローブをex vivo脳組織スライドに配置するには、灌流した実験用aCSFを毎分3〜6ミリリットルで灌流し、関心領域を含む脳スライスを顕微鏡灌流チャンバーのメッシュグリッドに移します。
プラチナハープで脳のスライスを固定します。メッシュグリッドを回転させて、マルチチャンネルプローブの遠位端の電極接触線が剥離面に対してほぼ垂直になるようにします。広視野照明とマイクロマニピュレーターの微調整下で、マルチチャンネルプローブをスライスの表面に向かって下げます。
皮質求心性神経の軸索終末に発現する蛍光レポータータンパク質を可視化するために、適切なフィルターキューブをかみ合わせます。必要に応じて、スライスを回転させて、プローブを剥離面により正確に位置合わせします。プローブをスライスの平面のすぐ上、x軸に沿った最終ターゲット位置の200マイクロメートル手前に配置し、記録する組織の領域の外側に少なくとも1つのチャネルを残します。
プローブをその長手方向軸に沿ってスライスにゆっくりと挿入します。組織への損傷を最小限に抑えるには、鋭い先端が組織表面の下に見える程度までのみプローブを進めます。実験用aCSFイオン源をバギングコントロール溶液に切り替え、蛍光標識細胞を同定して標的パッチクランプ記録を行います。
絞りを最小直径に制限し、マルチチャネルプローブと対物レンズが接触しないように注意しながら、高出力水浸対物レンズをかみ合わせます。組織に焦点を合わせます。マルチチャンネルプローブに隣接しているが重なっていない組織の領域に光を集中させます。
Cre依存性蛍光マーカーを発現する細胞のイメージングを可能にするために、適切なフィルターセットを作動させます。対物レンズを上げると、パッチピペットを下げるための十分なスペースが確保されます。パッチピペットに内部溶液をセットし、電極ホルダーに取り付けます。
1ミリリットルの注射器を使用して、約0.1ミリリットルの空気に相当する陽圧を加えます。.目視誘導下で先端に焦点を合わせながらパッチピペットを溶液に下げ、標的細胞から全細胞記録を取得します。このプロトコルで使用された動物は、ソマトスタチンまたはパルブアルブミン陽性介在ニューロンのいずれかで蛍光レポータータンパク質tdTomatoを発現しました。
これらの介在ニューロンは、適切なフィルターキューブを作動させた視覚ガイダンスの下でパッチクランプの標的とされました。シナプス後電位は、2ミリ秒の光パルスが4回連続して発生することに応答して介在ニューロンで観察されました。局所的な磁場ポテンシャルも記録されました。
電流源密度とマルチユニット活性は、局所的な電界ポテンシャルから抽出されました。電流源密度から抽出された電流シンクの振幅は、光強度の関数として増加しました。3つのパラメータ非線形ロジスティック方程式を、経路間の比較のためにデータに適合させました。
シナプス後電位の振幅も、電流シンクの振幅とともに増加しました。視床皮質および皮質皮質入力に対するシナプス応答は、制御、イソフルラン、および回復条件で測定されました。ソマトスタチンおよび皮質皮質刺激のシナプス後応答および誘発電流シンクは、イソフルラン条件で抑制された。
脳のスライスを準備するとき、組織の健康を維持することが最も重要です。スライス手順全体を通して組織を冷たく保ち、組織を損傷することなく迅速に作業することが重要です。マルチチャンネルの細胞外記録は、さまざまな方法で後処理できます。
たとえば、広帯域信号のハイパスフィルタリングは、ポピュレーションスパイク活動を分離し、電流源密度計算ではシナプス活動を強調します。これらの技術により、皮質回路の特定の孤立したコンポーネントに対する麻酔効果を探求することができ、生体内での意識喪失の根底にあるメカニズムについての洞察を得ることができました。
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概要
この研究は、揮発性麻酔薬、特にイソフルランが入力情報に対するニューロンの反応に与える影響を調べるために、ex vivoの脳切片を使用します。オプトジェネティクスを使用して、研究者は非主要新皮質における視床皮質および皮質皮質入力を独立して活性化し、麻酔暴露がシナプスおよびネットワーク反応をどのように調整するかを探ります。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- シナプス可塑性
背景
- 揮発性麻酔薬がニューロン回路にどのように影響するかを理解することは重要です。
- ex vivo脳切片は、このような研究のための管理された環境を提供します。
- オプトジェネティクスにより、ニューロン経路の特定の活性化が可能になります。
- 麻酔薬のシナプス反応への影響は、臨床設定における麻酔のより広範な影響を知らせることができます。
研究目的
- 揮発性麻酔薬が異なるシナプス経路に様々な影響を与えるかどうかを判断すること。
- これらの効果が特定の細胞タイプに特異的であるかどうかを評価すること。
- 麻酔暴露中の集団レベルの反応を評価すること。
使用された方法
- この研究で使用された主要なプラットフォームは、動物からのex vivo脳切片でした。
- 標的細胞タイプには、ソマトスタチンおよびパルバルブミン陽性間脳ニューロンが含まれました。
- 脳切片は、組織損傷を最小限に抑える条件で準備および維持されました。
- 実験には、シナプス後電位を測定するためのオプトジェネティック刺激が含まれました。
- 重要なステップには、実験溶液の調製および光刺激プロトコルの設定が含まれました。
主な結果
- イソフルラン暴露は、視床皮質および皮質皮質入力に対するシナプス反応を抑制しました。
- シナプス後電位の振幅は光の強度とともに増加し、標的間脳ニューロンの反応性を示しました。
- 電流源密度の計算は、特定の条件下でのシナプス活動の増強を強調しました。
- 結果は、麻酔薬がニューロンの興奮性およびシナプス調節に明確な影響を与えることを示唆しています。
結論
- この研究は、神経回路に対する麻酔効果を調べるためのex vivo脳切片の有用性を示しています。
- これは、揮発性麻酔薬によって影響を受けるシナプスダイナミクスに関する洞察を提供し、麻酔下でのニューロンメカニズムのより深い理解に貢献しています。
- この発見は、麻酔およびその脳機能への影響に関する臨床実践に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise dissection of anesthetic effects on defined neural pathways and cell types, supporting mechanistic de-risking in CNS drug discovery. By isolating thalamocortical and corticocortical inputs in ex vivo brain slices, it provides quantitative, pathway-specific readouts that enhance target validation confidence. The approach aids in predicting how CNS-active compounds modulate network excitability and synaptic transmission, informing early go/no-go decisions in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether volatile anesthetics differentially affect synaptic pathways.
- Operational Value: Enables cell type- and pathway-specific assessment of drug effects on neuronal excitability.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds with selective modulation of thalamocortical versus corticocortical transmission.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems with quantifiable extracellular and intracellular responses to afferent stimulation.
- Reproducibility: Standardizes optogenetic stimulation and anesthetic delivery via aCSF for consistent synaptic response measurements.
- Scalability: Supports multi-condition testing (control, drug, recovery) to enable dose-response and time-course profiling.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models thalamocortical circuits implicated in consciousness and sensory processing, aligning with neuropsychiatric indications.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by preserving key physiological properties of cortical networks.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insight into anesthetic-induced suppression of postsynaptic potentials, informing safety pharmacology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment, offering a platform to evaluate CNS compound effects on defined neural circuits before in vivo testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pathway-specific drug actions and biological de-risking of synaptic targets.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with quantifiable postsynaptic potential and current source density outputs.
- Analytics: Enables comparison of synaptic responses across conditions using non-linear logistic fitting of light-intensity response curves.
- Translational Research: Maintains cortical circuit integrity to support extrapolation to preclinical efficacy and safety studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening anesthetic and non-anesthetic CNS modulators on isolated afferent pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating cell type-specific effects of volatile anesthetics on synaptic transmission.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized tissue preparation, optogenetic stimulation, and anesthetic delivery in aCSF.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing whether compounds preferentially disrupt thalamocortical or corticocortical signaling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on pathway-selective modulation of interneuron activity in sensory cortex.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, electrophysiology, and brain slice preparation.
- Depends on fluorescence-guided patch clamping and multi-channel extracellular recording systems.
- Necessitates precise control of anesthetic concentration in aCSF and light stimulation protocols.
- Involves adaptation considerations when translating findings across species or disease models.
- Limited by tissue viability duration and the need to maintain physiological conditions throughout experimentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Preparation of Acute Brain Slices
2:47
Placing Multi-Channel Probe in Ex Vivo Brain Tissue Slice
4:38
Patch Clamping Targeted Neurons and Obtaining Whole-Cell Configuration
5:55
Results: Intracellular and Multi-Channel Extracellular Recordings in Cortical Slice
7:19
Conclusion
