Name: 脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学ぶ脳スライスを用いた光遺伝学的活性化とイソフルランによる求心性経路の応答調節。この手法は神経回路への麻酔薬効果を特定の細胞型で評価し、シナプス伝達と集団活動の変化を明らかにする。

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著者は、このプロジェクトに関する技術サポートとガイダンスを提供してくれたBryan Krauseに感謝します。
この研究は、国際麻酔研究学会(IMRAからAR)、国立衛生研究所(R01 GM109086からMIB)、およびウィスコンシン大学マディソン校の医学部および公衆衛生学部麻酔科の支援を受けました。

<ol><li>Baumgart, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+inhibits+synaptic+vesicle+exocytosis+through+reduced+Ca2%2B+influx%2C+not+Ca2%2B-exocytosis+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Isoflurane inhibits synaptic vesicle exocytosis through reduced Ca2+ influx, not Ca2+-exocytosis coupling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 112 (38), 11959-11964 (2015).</li>
<li>Herring, B. E., Xie, Z., Marks, J., Fox, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+inhibits+the+neurotransmitter+release+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane inhibits the neurotransmitter release machinery.</a> Journal of Neurophysiology. 102 (2), 1265-1273 (2009).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+anesthetics+with+neurotransmitter+release+machinery+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of anesthetics with neurotransmitter release machinery proteins.</a> Journal of Neurophysiology. 109 (3), 758-767 (2013).</li>
<li>Crick, F., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">A framework for consciousness.</a> Nature Neurosciences. 6 (2), 119-126 (2003).</li>
<li>Koch, C., Massimini, M., Boly, M., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+consciousness%3A+progress+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of consciousness: progress and problems.</a> Nature Reviews Neurosciences. 17 (5), 307-321 (2016).</li>
<li>Dehaene, S., Changeux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+approaches+to+conscious+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical approaches to conscious processing.</a> Neuron. 70 (2), 200-227 (2011).</li>
<li>Friston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theory+of+cortical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A theory of cortical responses.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 360 (1456), 815-836 (2005).</li>
<li>Mashour, G. A., Hudetz, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-Up+and+Top-Down+Mechanisms+of+General+Anesthetics+Modulate+Different+Dimensions+of+Consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Bottom-Up and Top-Down Mechanisms of General Anesthetics Modulate Different Dimensions of Consciousness.</a> Frontiers in Neural Circuits. 11, 44(2017).</li>
<li>Voss, L. J., Garcia, P. S., Hentschke, H., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Effects+of+General+Anesthetics+on+Cortical+Network+Activity+Using+Ex+Vivo+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Understanding the Effects of General Anesthetics on Cortical Network Activity Using Ex Vivo Preparations.</a> Anesthesiology. 130 (6), 1049-1063 (2019).</li>
<li>Redinbaugh, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamus+Modulates+Consciousness+Via+Layer-Specific+Control+of+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Thalamus Modulates Consciousness Via Layer-Specific Control of Cortex.</a> Neuron. 105 (4), 0896(2020).</li>
<li>Carhart-Harris, R. L., Friston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REBUS+and+the+Anarchic+Brain%3A+Toward+a+Unified+Model+of+the+Brain+Action+of+Psychedelics%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">REBUS and the Anarchic Brain: Toward a Unified Model of the Brain Action of Psychedelics.</a> Pharmacological Reviews. 71 (3), 316-344 (2019).</li>
<li>Mak-McCully, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+cortical+and+thalamic+activity+during+non-REM+sleep+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Coordination of cortical and thalamic activity during non-REM sleep in humans.</a> Nature communications. 8 (1), 15499(2017).</li>
<li>Alkire, M. T., Hudetz, A. G., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consciousness+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Consciousness and anesthesia.</a> Science. 322 (5903), 876-880 (2008).</li>
<li>Sanders, R. D., Maze, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noradrenergic+trespass+in+anesthetic+and+sedative+states%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Noradrenergic trespass in anesthetic and sedative states.</a> Anesthesiology. 117 (5), 945-947 (2012).</li>
<li>Hemmings, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+Comprehensive+Understanding+of+Anesthetic+Mechanisms+of+Action%3A+A+Decade+of+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Towards a Comprehensive Understanding of Anesthetic Mechanisms of Action: A Decade of Discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 40 (7), 464-481 (2019).</li>
<li>Nourski, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Predictive+Coding+across+Awareness+States+under+Anesthesia%3A+An+Intracranial+Electrophysiology+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Auditory Predictive Coding across Awareness States under Anesthesia: An Intracranial Electrophysiology Study.</a> Journal of Neurosciences. 38 (39), 8441-8452 (2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+disrupts+functional+interactions+between+sensory+and+high-order+processing+of+auditory+verbal+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Brain+Mapping%22%5BJournal%5D)">Propofol disrupts functional interactions between sensory and high-order processing of auditory verbal memory.</a> Human Brain Mapping. 33 (10), 2487-2498 (2012).</li>
<li>Hentschke, H., Raz, A., Krause, B. M., Murphy, C. A., Banks, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cortical+network+activity+by+the+general+anesthetic+isoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of cortical network activity by the general anesthetic isoflurane.</a> British Journal of Anaesthesiology. 119 (4), 685-696 (2017).</li>
<li>Lee, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+frontal-parietal+communication+by+ketamine%2C+propofol%2C+and+sevoflurane%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Disruption of frontal-parietal communication by ketamine, propofol, and sevoflurane.</a> Anesthesiology. 118 (6), 1264-1275 (2013).</li>
<li>Ferrarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+in+cortical+effective+connectivity+during+midazolam-induced+loss+of+consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Breakdown in cortical effective connectivity during midazolam-induced loss of consciousness.</a> Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 107 (6), 2681-2686 (2010).</li>
<li>Ku, S. W., Lee, U., Noh, G. J., Jun, I. G., Mashour, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+inhibition+of+frontal-to-parietal+feedback+connectivity+is+a+neurophysiologic+correlate+of+general+anesthesia+in+surgical+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Preferential inhibition of frontal-to-parietal feedback connectivity is a neurophysiologic correlate of general anesthesia in surgical patients.</a> PLoS.One. 6 (10), 25155(2011).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+Properties+in+Transitions+of+Consciousness+during+Propofol-induced+Sedation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Network Properties in Transitions of Consciousness during Propofol-induced Sedation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 16791(2017).</li>
<li>Murphy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+anesthesia+and+sleep%3A+a+high-density+EEG+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Propofol anesthesia and sleep: a high-density EEG study.</a> Sleep. 34 (3), 283-291 (2011).</li>
<li>Murphy, C., Krause, B., Banks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+of+isoflurane+on+cortico-cortical+feedback+afferent+responses+in+murine+non-primary+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Selective effects of isoflurane on cortico-cortical feedback afferent responses in murine non-primary neocortex.</a> British Journal of Anaesthesiology. 123 (4), 488-496 (2019).</li>
<li>Raz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+effect+of+isoflurane+on+top-down+versus+bottom-up+pathways+in+sensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+System+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Preferential effect of isoflurane on top-down versus bottom-up pathways in sensory cortex.</a> Frontiers in System Neurosciences. 8, 191(2014).</li>
<li>Schrouff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+functional+integration+decreases+during+propofol-induced+loss+of+consciousness%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Brain functional integration decreases during propofol-induced loss of consciousness.</a> Neuroimage. 57 (1), 198-205 (2011).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-Specific+Feedforward+Circuits+between+Thalamus+and+Neocortex+Revealed+by+Selective+Optical+Stimulation+of+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-Specific Feedforward Circuits between Thalamus and Neocortex Revealed by Selective Optical Stimulation of Axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li>
<li>Gredell, J. A., Turnquist, P. A., MacIver, M. B., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+diffusion+and+partition+coefficients+of+propofol+in+rat+brain+tissue%3A+implications+for+studies+of+drug+action+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BJA%3A+British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Determination of diffusion and partition coefficients of propofol in rat brain tissue: implications for studies of drug action in vitro.</a> BJA: British Journal of Anaesthesia. 93 (6), 810-817 (2004).</li>
<li>Benkwitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+EC50+amnesic+concentration+of+etomidate+and+its+diffusion+profile+in+brain+tissue%3A+implications+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Determination of the EC50 amnesic concentration of etomidate and its diffusion profile in brain tissue: implications for in vitro studies.</a> Anesthesiology. 106 (1), 114-123 (2007).</li>
<li>Franks, N. P., Lieb, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+actions+of+volatile+general+anaesthetics+at+molecular+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Selective actions of volatile general anaesthetics at molecular and cellular levels.</a> British Journal of Anaesthesia. 71 (1), 65-76 (1993).</li>
<li>Honemann, C. W., Washington, J., Honemann, M. C., Nietgen, G. W., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partition+coefficients+of+volatile+anesthetics+in+aqueous+electrolyte+solutions+at+various+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Partition coefficients of volatile anesthetics in aqueous electrolyte solutions at various temperatures.</a> Anesthesiology. 89 (4), 1032-1035 (1998).</li>
<li>Au - Segev, A., Au - Garcia-Oscos, F., Au - Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Lin, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+channelrhodopsin+variants%3A+features%2C+limitations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments.</a> Experimental Physiology. 96 (1), 19-25 (2011).</li>
<li>Banks, M. I., Pearce, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+actions+of+volatile+anesthetics+on+GABAA+IPSCs%3A+dissociation+of+blocking+and+prolonging+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Dual actions of volatile anesthetics on GABAA IPSCs: dissociation of blocking and prolonging effects.</a> Anesthesiology. 90 (1), 120-134 (1999).</li>
<li>Hagan, C. E., Pearce, R. A., Trudell, J. R., MacIver, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+measures+of+volatile+anesthetics+in+the+aqueous+phase+using+calcium+sensitive+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Concentration measures of volatile anesthetics in the aqueous phase using calcium sensitive electrodes.</a> Journal of Neuroscience Methods. 81, 177-184 (1998).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

この原稿では、ex vivo脳スライスにおいて選択的に活性化された求心性経路に対する細胞内および細胞外の応答を評価するためのプロトコルが記載されている。
光遺伝学的ツールと並列記録スキームの使用により、研究者は、遠隔脳領域からの求心性入力に対する局所集団の応答を調査し、同時に介在ニューロンの標的集団から記録することができます。光遺伝学的技術の使用は、求心性突起の軸索終末が、それらの細胞体がもはや付着していないにもかかわらず、保存され活性化されることを可能にする。これにより、以前は ex vivo スライスに課されていた幾何学的制限が緩和され、長距離電気接続の保存が最優先事項ではなくなります。それでも、関心のある残りの接続を保持する幾何学的平面でスライスを準備するように注意する必要があります。例えば、錐体細胞は皮質柱に沿って垂直に配向しており、これらの実験でマルチチャネルプローブによって測定された誘発ネットワーク活性は、そのような局所的な接続を可能な限り維持することを必要とする。したがって、コロナスライスは、局所的な接続性を損なわないように準備された。
<p...

揮発性麻酔薬は、1世紀以上にわたってさまざまな臨床および学術環境で遍在的に使用されてきました。異なるクラスの麻酔薬は、独特の、しばしば重複しない分子標的1,2,3を持っていますが、それらのほとんどすべてが無意識を生み出します。それらの行動効果は非常に予測可能ですが、麻酔薬が意識喪失を誘発するメカニズムはほとんど知られていません。麻酔薬は、皮質視床回路上の作用を介して意識のレベルと内容の両方に最終的に影響を及ぼし、皮質階層全体の情報の統合を混乱させる可能性があります4,5,6,7,8,9。より広義には、コルチコ視床回路の調節は、実験的に10または薬理学的に11の変化した意識状態において役割を果たす可能性があり、睡眠12および意識の病態生理学的障害13,14にも関与し得る。
麻酔中の意識の喪失と回復の根底にあるメカニズムのとらえどころのないことは、細胞、ネットワーク、およびシステムレベルでの麻酔薬の非線形の相乗作用に部分的に起因する可能性があります15。イソフルランは、例えば、選択された脳領域16、17、18内の活動を抑制し、遠隔脳領域19、20、21、22、23間の接続性を損ない、経路特異的な様式でシナプス応答を減少させる24、25。.分子レベルからシステムレベルまで、麻酔薬のどの効果が意識喪失をもたらすために必要または十分であるかは不明である。非侵襲的技術を用いた意識の実質的な臨床調査19,20,26に加えて、実験家が意識的経験に従属する明確な細胞およびネットワークの相互作用を解きほぐそうとすることが重要です。
無傷の脳に見られる複雑な相互作用を単純化することにより、ex vivo脳スライスは、脳の動的システムの孤立した構成要素の研究を可能にします9。縮小スライス調製は、局所神経回路の比較的無傷の解剖学的構造の利点とin vitro操作の多様性を兼ね備えています。しかし、最近まで、方法論的制約により、脳スライスにおける長距離入力のシナプスおよび回路特性の研究が妨げられていました27,28。コルチコ視床線維路の曲がりくねった経路は、電気刺激によって独立した求心性経路の活性化をほとんど不可能にしました。
脳スライス製剤に対する麻酔薬の効果を調査することは、さらなる課題を提示する。無傷の呼吸器系および循環器系がない場合、麻酔薬を入浴させ、濃度を推定効果部位の濃度に注意深く一致させる必要があります。.多くの静脈内麻酔薬にとって、組織内の平衡化速度が遅いため、従来の薬理学的調査は面倒です29,30。ex vivo製剤中の揮発性ガス麻酔薬の効果を調査することは、より扱いやすいですが、課題もあります。これらには、吸入分圧用量を水性濃度に変換すること、および人工脳脊髄液31を介した組織への薬物の修正送達システムの必要性が含まれる。
ここでは、研究者が揮発性麻酔薬イソフルランの十分に文書化された物理化学的特性を利用して、ex vivo脳スライスへの薬物送達を行い、高い時空間分解能で皮質領域への経路および層特異的入力を活性化し、同時に実施する方法について説明します 層流記録と標的パッチクランプ記録 ニューロンの選択された集団から。これらの手順を組み合わせることで、研究者は、シナプスレベルからローカルネットワークレベルまで、いくつかの観察可能な電気生理学的応答特性における揮発性麻酔薬誘発性の変化を測定できます。

<table><tbody><tr><td>2.5倍広視野対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>MPLFLN2.5倍</td> 40倍<td></td></tr><tr><td>水浸対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2 混合物</td><td>エアガス</td><td>Z02OX95R2003045</td><td></td></tr><tr><td>A16 プローブ</td><td>NeuroNexus</td><td>A16x1-2mm-100-177-A16</td><td>16 チャネル プローブ</td></tr><tr><td>AAV2-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP</td><td>カール・ダイセロス研究所、ノースカロライナ州ベクターコア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻酔ガスモニター(POET II)</td><td>Criticare</td><td>602-3A</td><td></td></tr><tr><td>ATP、マグネシウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A9187</td><td>細胞内溶液</td></tr><tr><td>B6。CG-GT(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>007914</td><td>Cre依存性tdTomatoマウス</td></tr><tr><td>B6;129P2-Pvalbtm1(cre)Arbr / J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>008069</td><td>PV-Creマウス</td></tr><tr><td>ベリーダンサーシェーカー</td><td>トーマスサイエンティフィック</td><td>1210H86-TS</td><td>密封ガスバッグの平衡化のための</td></tr>ベ<tr><td>タジン溶液</td><td>ジェネリックブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td>銀<td>塩素化パッチクランプ電極</td>ブピビカイン<td></td>のジェネリックブランド<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)</td><td>Dot Scientific</td><td>DSC20010</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>キャピラリーガラス(パッチクランプ録音)</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>KG-33</td><td>ホウケイ酸、ID:1.1mm、外径:1.7mm、長さ:90.0mm</td></tr><tr><td>キャピラリーガラス(ウイルス注射)</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>カンパニー3-000-203-G / X</td><td>3.5"</td></tr><tr><td>ジュニアマイクロマニピュレーターLuigs</td><td>とNeumann</td><td>SM8</td>の制御ジュニア<td>マイクロマニピュレーターの制御</td></tr>マ<tr><td>ニピュレーターとシフトテーブルの制御</td>マルチチャネル電極の制御のための<td>LuigsとNeumann</td><td>SM7</td><td>とシフトテーブル</td></tr><tr><td>Digidata 1440A + Clampex 10</td><td>Molecular Devices</td><td>1440A</td><td>デジタイザーとソフトウェア</td></tr><tr><td>E-3603 チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>14171208</td><td>95% O2/5% CO2 ガス混合物をインキュベーションチャンバーに送達 + パッチクランプ中の圧力の適用</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ドットサイエンティフィ</td>ック <td>DSE57060</td><td>細胞内溶液</td></tr><tr><td>ERP-27 EEG リファレンス/パッチパネル</td><td>Neuralynx</td><td>引退した</td><td></td></tr><tr><td>充填針</td><td>ワールド精密機器</td><td>パッチクランプピペットを充填するための</td><td>50821912</td></tr><tr><td>イメージング用フィルターキューブ EYFP</td><td>オリンパス</td><td>U-MRFPHQ</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09801E</td><td>組織ブロックの準備中にスライステンプレートを横切る</td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-1000</td><td>2.5x2.5 ボックスフィラメント</td></tr><tr><td>ガス分散管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3953312C</td><td></td></tr><tr><td>ガラスシリンジ (100 mL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ガスシール袋充填</td><td>用Z314390</td></tr><tr><td>グルコン酸、カリウム塩 (K-グルコン酸)、</td><td>ドットサイエンティフィ</td>ック <td>DSG37020</td><td>細胞内溶液</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>ドットサイエンティフィック</td><td>DSG32040</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>GTP、ナトリウム塩</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G8877</td><td>細胞内溶液</td></tr><tr><td>ヘッドステージプローブアダプター</td><td>NeuroNexus</td><td>A16-OM16</td><td>アダプター 16 チャンネルプローブをヘッドステージ入力に接続するための</td></tr>アダプター <tr><td>止血鉗子</td><td>VWR インターナショナル</td><td>76192-096</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ドット サイエンティフィック</td><td>DSH75030</td><td>ACSF、細胞内ソリューション</td></tr><tr><td>HS-16 ヘッドステージ</td><td>ニューラリンクス</td><td>引退した</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>パターソン獣医</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール(70%)</td><td>VWRインターナショナル</td><td>101223-746</td><td></td></tr><tr><td>ジュニアマイクロマニピュ</td><td>レーターLuigsとNeumann</td><td>210-100 000 0090-R</td><td>パッチクランプ電極の操作用</td></tr><tr><td>LED光源制御モジュール</td><td>MightexBLS-PL02_US</td><td></td><td>光遺伝学的光源制御</td></tr><tr><td>リドカイン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8 アンプ</td><td>ニューラリンクス</td><td>リタイア</td><td></td></tr><tr><td>Lynx-8 電源</td><td>ニューラリンクス</td><td>リタイア</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)</td><td>ドット サイエンティフィック</td><td>DSM24300</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>mCherry, Texas レッド フィルター キューブ</td><td>Chroma</td><td>49008</td><td>イメージング用 tdTomato 蛍光レポーター</td></tr><tr><td>メロキシカム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9044962</td><td></td></tr><tr><td>マイクロシリンジポンプ</td><td>ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>ジェネリックブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチクランプ 700A</td><td>モレキュラーデバイス/アクソンインスツルメンツ</td><td>700A</td><td>アンプ</td></tr><tr><td>窒素(エアテーブル用)</td><td>エアガス</td><td>NI200</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>501460083</td><td>平らにされたプラチナワイヤーの馬蹄形に伸び、録音中にこの上にスライスレスト</td></tr>ナイロン<tr><td>、パンストからカット</td><td>イン</td><td>キュベーションチャンバーでスライスプラットフォームを作成するための</td>一般的なブランドの<td></td>小片、プラチナハープ</tr><tr><td>眼科軟膏</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>NC1697520</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>を作成するための単一繊維ドットサイエンティフィック</td><td>307</td>リグ<td>プラチナ</td></tr><tr><td>ワイヤーVWRインターナショナル</td><td>BT124000</td><td>2センチメートル、平らに、プラチナハープ</td><td></td></tr><tr><td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-E-0470-0617-000</td><td>光遺伝学的光送達システムを作るために、ポリスキャン2ソフトウェアが付属しています</td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>ドットサイエンティフィック</td><td>DSP41000</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>リン酸カリウム(KH2PO4)</td><td>ドットサイエンティフィ</td>ック<td>DSP41200</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>サファイアブレード(ビブラトーム用)</td><td>VWRインターナショナル</td><td>100492-502</td><td></td></tr><tr><td>メスブレード</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー株式会社</td><td>sc-361445</td><td></td></tr><tr><td>密封されたガスバッグ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>109236</td><td></td></tr><tr>顕微鏡<td>LuigsおよびNeumann380FMU</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(HCO3-)</td><td>ドットサイエンティフィック</td><td>DSS22060</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>ドットサイエンティフィック</td><td>DSS23020</td><td>ACSF、細胞内溶液</td></tr><tr><td>Ssttm2.1(cre)Zjh / J(SOM-IRES-CRE)</td><td>ジャクソン研究所</td><td></td><td>013044 SOM-Cre マウス</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td><td>Kopf</td><td>モデル 902</td><td>デュアル小動物</td></tr><tr><td>用瞬間接着剤</td><td>ステープル</td><td>886833</td><td>スライス準備中に組織ブロックを標本ステージに固定します</td></tr><tr><td>サージカルドリル</td><td>RAM Products Inc.</td><td>DIGITALMICROTORQUE</td><td>Microtorque II</td></tr><tr><td>シリンジ (1 mL) LuerLock チップ付き</td><td>パッチクランプ時の圧力適用用</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>309628</td></tr><tr><td>スリップチップ付きシリンジ (1 mL)</td><td>WW Grainger, Inc.</td><td>パッチクランプピペットを充填するための</td><td>19G384</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>VWRインターナショナル</td><td>66064-414</td><td></td></tr><tr><td>直立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>振動ミクロトーム</td><td>ライカバイオシステム</td><td>ズ VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>ワイポールタオル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-042-427</td><td></td></tr></tbody></table>

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

麻酔薬は、視床皮質回路に対する作用を介して意識に部分的に影響を及ぼします。しかし、揮発性麻酔薬がこれらの回路の明確な細胞およびネットワークコンポーネントにどの程度影響を与えるかは不明のままです。生体外脳スライスは、研究者が複雑なネットワークの個別のコンポーネントを調査し、誘発された反応に対する揮発性麻酔薬の影響の根底にある潜在的なメカニズムを解きほぐす手段を提供します。脳スライス中の潜在的な細胞タイプおよび経路特異的薬物効果を分離するには、研究者は求心性線維経路を独立して活性化し、重複しない細胞集団を特定し、揮発性麻酔薬を水溶液中の組織に適用できなければなりません。このプロトコルでは、ex vivo脳スライスにおける新皮質への2つの独立した求心性経路に対する光遺伝学的に誘発された応答を測定する方法が記載されている。細胞外応答はアッセイネットワーク活性に対して記録され、標的全細胞パッチクランプ記録はソマトスタチンおよびパルブアルブミン陽性介在ニューロンで行われます。細胞およびネットワーク応答を調節するための人工脳脊髄液を介した生理学的に関連する濃度のイソフルランの送達が記載されている。

プロトコルで説明されている手順のタイムラインを 図 1 に示します。高次皮質領域または非一次視床核から到着する皮質入力は、非一次視覚野24の層1で部分的に重複する終末野を有する。独立した視床皮質または皮質皮質求心性経路を単離するために、ChR2およびeYFP蛍光レポーターを含むウイルスベクターをPoまたはCgのいずれかに注入した。注射半径内の細胞はウイルスベクターを取り込み、2〜4週間後、体細胞軸索と突出軸索の両方で非特異的陽イオンチャネルChR2とレポーターを発現します(図2A)。冠状スライスを採取した。適切なフィルターキューブを係合させて、ウイルス構築物を発現する軸索を画像化した(図2B)。ChR2を使用して軸索終末を活性化すると、付着した体細胞に前提条件がなくても求心性神経を活性化することができます。
ここで説明した実験で使用された動物は、SOM-td...

Ex vivo脳スライスは、求心性入力に対する誘発反応に対する揮発性麻酔薬の効果を研究するために使用できます。光遺伝学は、視床皮質および皮質皮質求心性神経を非原発性新皮質に独立して活性化するために使用され、シナプスおよびネットワーク応答はイソフルランで調節されます。

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

このプロトコルは、揮発性麻酔薬が他のものよりも一部の概要を混乱させるかどうかを調査し、その影響が細胞型であるか経路特異的であるかを判断し、集団レベルでどのような影響が発生するかを判断するために使用できます。この技術の主な利点は、揮発性麻酔薬の効果を評価できる特異性です。特定の経路と細胞タイプを標的とし、同時に集団活性をアッセイできます。切片化のための組織ブロックを準備することから始めます。脳を頭蓋骨の空洞からそっと持ち上げ、濾紙の上に置きます。正中線に平行な脳の矢状面に沿って切り込みを入れ、この矢状面に組織ブロックを配置します。濾紙をブロッキングテンプレートにガイドし、脳を下にあるテンプレートのアウトラインに合わせます。テンプレートの線で示されているように、冠状面に平行なカットを行い、必要に応じて濾紙を濡らしておくためにスライスaCSFを少し加えます。組織ブロックを摂氏4度に置き、aCSFをスライスし、氷冷した試料ステージに少量の接着剤を塗布します。スライスしたaCSFからティッシュブロックを持ち上げ、吸収性タオルの角で余分な溶液を吸い取ります。組織ブロックの後冠状面を標本ステージに接着し、脳の背側表面をサファイアブレードに向けて接着します。厚さ500マイクロメートルの冠状脳スライスを収集し、摂氏34度のナイロンメッシュにsicfスライスします。容器を室温に戻します。イソフルランを溶解した実験用aCSFバッグを調製するには、600ミリリットルの実験用aCSFと600ミリリットルの95%酸素と5%二酸化炭素ガスの混合物を空のポリテトラフルオロエチレンガスバッグに加えます。このバッグコントロールにラベルを付けます。300ミリリットルの実験用aCSFを別のポリテトラフルオロエチレンガスバッグに加え、このバッグにイソフルランを標識します。原稿の指示に従ってイソフルランバッグの準備を進めます。各プロファイルに波形をランダムに割り当てることにより、光シミュレーションプロトコルを設定します。各プロファイルとそれに割り当てられた波形は、デジタルTTL入力からの1つのトリガーパルスまたは1つの試行に対応します。終了したら、プロファイル順序を保存します。マルチチャンネルプローブをex vivo脳組織スライドに配置するには、灌流した実験用aCSFを毎分3〜6ミリリットルで灌流し、関心領域を含む脳スライスを顕微鏡灌流チャンバーのメッシュグリッドに移します。プラチナハープで脳のスライスを固定します。メッシュグリッドを回転させて、マルチチャンネルプローブの遠位端の電極接触線が剥離面に対してほぼ垂直になるようにします。広視野照明とマイクロマニピュレーターの微調整下で、マルチチャンネルプローブをスライスの表面に向かって下げます。皮質求心性神経の軸索終末に発現する蛍光レポータータンパク質を可視化するために、適切なフィルターキューブをかみ合わせます。必要に応じて、スライスを回転させて、プローブを剥離面により正確に位置合わせします。プローブをスライスの平面のすぐ上、x軸に沿った最終ターゲット位置の200マイクロメートル手前に配置し、記録する組織の領域の外側に少なくとも1つのチャネルを残します。プローブをその長手方向軸に沿ってスライスにゆっくりと挿入します。組織への損傷を最小限に抑えるには、鋭い先端が組織表面の下に見える程度までのみプローブを進めます。実験用aCSFイオン源をバギングコントロール溶液に切り替え、蛍光標識細胞を同定して標的パッチクランプ記録を行います。絞りを最小直径に制限し、マルチチャネルプローブと対物レンズが接触しないように注意しながら、高出力水浸対物レンズをかみ合わせます。組織に焦点を合わせます。マルチチャンネルプローブに隣接しているが重なっていない組織の領域に光を集中させます。Cre依存性蛍光マーカーを発現する細胞のイメージングを可能にするために、適切なフィルターセットを作動させます。対物レンズを上げると、パッチピペットを下げるための十分なスペースが確保されます。パッチピペットに内部溶液をセットし、電極ホルダーに取り付けます。1ミリリットルの注射器を使用して、約0.1ミリリットルの空気に相当する陽圧を加えます。.目視誘導下で先端に焦点を合わせながらパッチピペットを溶液に下げ、標的細胞から全細胞記録を取得します。このプロトコルで使用された動物は、ソマトスタチンまたはパルブアルブミン陽性介在ニューロンのいずれかで蛍光レポータータンパク質tdTomatoを発現しました。これらの介在ニューロンは、適切なフィルターキューブを作動させた視覚ガイダンスの下でパッチクランプの標的とされました。シナプス後電位は、2ミリ秒の光パルスが4回連続して発生することに応答して介在ニューロンで観察されました。局所的な磁場ポテンシャルも記録されました。電流源密度とマルチユニット活性は、局所的な電界ポテンシャルから抽出されました。電流源密度から抽出された電流シンクの振幅は、光強度の関数として増加しました。3つのパラメータ非線形ロジスティック方程式を、経路間の比較のためにデータに適合させました。シナプス後電位の振幅も、電流シンクの振幅とともに増加しました。視床皮質および皮質皮質入力に対するシナプス応答は、制御、イソフルラン、および回復条件で測定されました。ソマトスタチンおよび皮質皮質刺激のシナプス後応答および誘発電流シンクは、イソフルラン条件で抑制された。脳のスライスを準備するとき、組織の健康を維持することが最も重要です。スライス手順全体を通して組織を冷たく保ち、組織を損傷することなく迅速に作業することが重要です。マルチチャンネルの細胞外記録は、さまざまな方法で後処理できます。たとえば、広帯域信号のハイパスフィルタリングは、ポピュレーションスパイク活動を分離し、電流源密度計算ではシナプス活動を強調します。これらの技術により、皮質回路の特定の孤立したコンポーネントに対する麻酔効果を探求することができ、生体内での意識喪失の根底にあるメカニズムについての洞察を得ることができました。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、ニューロン特異的な蛍光タンパク質を含むトランスジェニック脳切片の電気的活動を同時にイメージングし、記録する方法を概説しています。この手順では、脳スライスを曝気された人工脳脊髄液で灌流チャンバーに保持し、光源を使用して蛍光標識細胞を励起し、マルチチャネルプローブとパッチクランプで電気信号を記録する。...

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

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扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

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ラット脳切片におけるシナプスイベントの光遺伝学的刺激と電気生理学的記録

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光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。...

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

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記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。...

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。...

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

現在実施されているように、非ヒト霊長類のオプトジェネティクスは、脳へのウイルスベクターの注射を必要とします。最適な注入方法は、信頼性が高く、多くのアプリケーションにとって、死後の組織学で容易かつ明確に特定される任意の深さの個々の部位を標的にできる必要があります。これらの特性を有する注入方法が提示される。...

非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

学ぶ脳スライスを用いた光遺伝学的活性化とイソフルランによる求心性経路の応答調節。この手法は神経回路への麻酔薬効果を特定の細胞型で評価し、シナプス伝達と集団活動の変化を明らかにする。

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

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