Name: C.エレガンスにおける大エキソファー小胞における生体内ニューロン集合体およびオルガネラ押出におけるスコアリングのための定量的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶエクソファー形成のメカニズムと定量的スコアリング法。C. elegansを用いた生体内イメージングで神経細胞からの凝集体・オルガネラ押出を観察し、神経変性疾患の病態理解と治療戦略開発に貢献する研究手法を解説します。

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我々は、次のNIH助成金を認める: R01AG047101 および R37AG56510.Driscollとグラントの研究室のメンバーは、厳格な実験と強力なコミュニケーションで、記述されたプロトコルの開発と微調整に広く貢献してきました。

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大きなエキソファーの形での骨体およびオルガネラ排除の インビボ 分子機構の特徴は、その初期段階にある。追放のための貨物の指定に関する質問、細胞内のこれらの貨物の偏光コレクション、エキソファーを生成する決定の規制、押出を媒介する機械、および隣接する細胞内の劣化機械とのエキソファーの相互作用はすべて取り上げられる。さらに、カルシウム、凝集体、ミトコンドリアを含む生物学的材料を通過できる管状の接続の 生体内 での可視化は興味深く、それ自体が研究された生物学です。なぜ特定の細胞が他の細胞よりも排泄する傾向があるのかという疑問も未解決であるが、このプロトコルで概説されているアプローチで遺伝的に解剖され始めることができる。
このプロトコルで詳細に説明されているのは、エキソファー生産の再現可能なスコアリングを達成するためのアプローチであり、エソファーと近くの細胞ソマを区別すること、排泄物産生のピークを捉える分析のタイミング、および成長条件の厳密な制御を行い、エキソファーレベルを調節できる意図しないストレスを排除する。大きな初期のエキソファーの区別、または周囲の皮下皮における「星空の夜」の分散の両方を、エソファー産生の証拠として定量することができる。そうは言うまでも、基底条件下でmCherryを発現するニューロンは、エキソファーを産生する特定のタイプのニューロンの5〜25%に最も頻繁に関連している。ストレス条件の導入を制御して、押出を生み出すニューロンの90%もの検出にエキソファー産生を増加させることができ、特に調節剤の遺伝的または薬理学的スクリーンに有用である。
ヒト神経変性疾患では、大きな凝集体が病気のニューロンから隣接する細胞に移り、病理の広がりを促進することができる。エキソファー機構は、フィラ全体の凝集押しに使用される保存されたメカニズムを介して起こる可能性があります。このプロセスの効率を高めるin vivo 分子を定義するか(より効果的なプロテオスタシス制御と考えられる)、またはブロックして、複数の神経変性疾患に対抗するための新しい戦略の設計に影響を与える可能性があります。したがって、ここで説明するプロトコルは、古典的な遺伝子変異生成スクリーン、エンハンサーおよびサプレッサーを同定するために遺伝子を体系的にノックダウンするゲノムワイドRNAiスクリーン、またはこのプロセスの候補薬理学的調節因子を同定する薬物介入研究に使用することができる。このアプローチは簡単ですが、やや面倒です。エキソファーは非常に大きく、拡大解剖顕微鏡で見ることができます。それでも 、C.エレガンス ニューロンは比較的小さく、オルガネラまたはその膜を見ると、より高い電力共焦点画像を必要とし、遅いプロセスです。スループットを高めるオプションには、マルチウェルプレート形式の高いコンテンツイメージングアプローチが含まれる可能性があります。
エキソファースコアリングへの標準化されたアプローチの適用は、ニューロンが細胞の破片を組織し、排除することができるプロセスの協調的な遺伝的解剖の根源であるべきである。

凝集体および機能不全ミトコンドリアの神経毒性の課題は、長い間細胞組み込みであると考えられてきましたが、最近では、1つのニューロンに由来する誤って折り畳まれたヒト疾患タンパク質が隣接する細胞にも広がり、病理を促進することが明らかになりました。同様に、哺乳動物のミトコンドリアは、細胞内分解2 のために、または挑戦した隣接細胞3におけるミトコンドリア集団の救助のために、元の産生の細胞から送り出すことができる。さまざまなサイズの小胞は、一般的に、細胞材料を隣接する細胞または流体周囲4に伝達することが観察されている。押し出された小胞の中には、平均的な神経細胞のソーマ(平均タッチニューロンソーマ〜6μm)の大きさに近づき、大きな凝集体やオルガネラに対応できるものもあります。
タンパク質凝集体および小器官を運ぶことができる大きな小胞押出の顕著な例は、有害な凝集を起こしやすい、分解耐性mCherry5をコードする高コピー数レポーター構築物を発現するC.エレガンスタッチ受容体ニューロンで起こる。エキソファーと呼ばれるタッチニューロンからの押出は、平均直径約4μmであり、選択的にmCherryまたは他の凝集体を含み、通常はタッチ受容体ニューロンを取り囲む隣接する皮下に直接送達される。この皮下皮はリソソームベースの分解を試みるが、mCherry凝集体のような一部の非消化性内容物は、動物の流体充填されたシュードコロームに皮下で再押し出され、そこからmCherryを長期間保存するために血球細胞と呼ばれる遠隔スカベンジャー細胞によって取り上げることができる(図1、図2)5。
大きな押出されたエキソファー小胞は、タッチ受容体原形質膜に囲まれた細胞を残し、凝集したヒト疾患タンパク質、ミトコンドリア、リソソームを含むことができる。エキソファー産生のプロセスは、潜在的に有毒な種の選別を伴うようだ(例えば、凝集しやすい発現mCherryは、主に神経細胞腫に残っているGFPのような可溶性の不快なタンパク質から分離される)。このようにして、脅迫的な実体の指示された追放はニューロン5によって達成される。オートファジー・ノックダウンによって誘発されるストレス、MG132媒介性プロテアソーム阻害、またはハンチントン病関連の拡大ポリグルタミンQ128またはアルツハイマー病関連フラグメントAβ1-42などのヒト疾患タンパク質のトランスジェニック発現などのプロテオスタシスの課題は、エキサを産生するニューロンの数を増加させることができる5。
エキソファーは最近文書化されたばかりで、生物学のメリットの説明で知られています。エキソファーは、C.エレガンスタッチ受容体ニューロンで発見され、最もよく研究されています。細胞体が体の周りに分布し、その超構造が特徴的な15の原始フィラメント微小管を特徴とするため、微小管細胞と呼ばれる6つのC.エレガンスメカノ感覚タッチニューロンがあります。タッチ受容体ニューロンは、前AVM(前腹側腸管ニューロン)、ALMR、ALML(左右の前側腸管ニューロン)、より中央のPVM(後側腹側腸管ニューロン)、後部PLMRおよびPLML(後側側微小管ニューロンおよび右および左)興味深いことに、6つのタッチ受容体ニューロンは、同じ攻撃的なトランスジーンを発現しているにもかかわらず、異なる速度でエキソファーを産生する(図3C)。6つのメカノ感覚タッチ受容体ニューロンのうち、ALMRニューロンは他のタッチニューロンよりも頻繁に発熱を受ける。タッチニューロンからのエキソファー数の定量は、ALMRに焦点を当てることによって通常確立される。
細胞形成は、典型的には神経細胞質の腫脹から始まる動的なプロセスである(図1A-B)。細胞内容物、オルガネラ、またはタンパク質凝集体は、神経細胞腫の片側に収集され、最も一般的にはALMRニューロンの後端(突出性神経突起から離れて)に向かって、プレエソファードメイン(PED)を形成する(図1B)。PEDが外側に突き出し始めると、初期の突起が観察され、認識可能な突出した芽を形成する。後期芽は、プレエキソファードメインの最も広い直径が、ソマエキソファー首の収縮の直径よりおよそ1/3大きいときに定義される(図1C)。エコファーはソーマからほぼ任意の方向に排出することができるが、ほとんどのエコファーは細胞体から後に出て、元の相馬とほぼ同じ焦点面にとどまる。
芽の首が薄いフィラメントに狭くなるにつれて、エキソファーは元のソーマから離れることができます。このフィラメント(図1D、矢印)を介して、外発性はソーマに付着したままで、後で剥離することができます。カルシウム、凝集体、ミトコンドリアなどの細胞内容物は、このフィラメントを介して付属のエキソファー5に移すことができるが、押し出された材料の大部分は、大規模な芽球によってエキソファーコンパートメントに入れ込まれる。エキソファーは、可視の接続チューブまたは薄いフィラメントがなく、そのエキソファーが送出側のソーマから完全に分離されている場合に成熟していると見なされます(図1E)。
C.エレガンスが産生するエキソファーは、すぐに皮下、タッチニューロンを取り囲む組織に遭遇する。最も一般的には、エキソファー小胞は尾部に向かって下皮内を後に移動するように見え、エソファーの内容物が劣化の対象と見える前に相腫からかなり遠く離れている可能性があります(例えば、距離は相馬から〜100μm離れている可能性があります)。蛍光エキソファー小胞は、皮下の多くの小胞に分裂し、「星空の夜」と呼ばれる外観を取る(図1Gおよび図2)。「星空の夜」段階では、穿刺蛍光物質は、元の孤独なエキソファーと比較して蛍光の多くの小さな点に皮下同期性を横切って散在するのを観察することができる。星空の夜は、低倍率の下で穿刺を見ることができ、より高い倍率で、下皮内で穿刺および/またはネットワークに見えることができます。星空夜の蛍光シグナルは、典型的には、蛍光のエキソファーおよびニューロンに比べて薄暗い(図2B-C)。多くの穿刺小胞へのmCherryの分散は、皮下細胞の内因性/リソソームネットワークとの貪食成熟および融合を伴うと考えられている。一部のエキソファー材料は皮下リソソームネットワークで分解される可能性が高いが、分解に強い残留種(mCherry凝集体など)は、細胞の破片を含むことができる流体室であるシュードコロームに皮下皮から投げ出される。蛍光物質は後に、血球細胞(図2C)と呼ばれる遠隔スカベンジャー細胞によって取り込まれ、濃縮、貯蔵、そして再びmCherryの分解を試みることができる。
凝集押出および移動の現象は,、C.エレガンス,55、6、7、D.6メラノガスター8、9などの遺伝モデルおよび複数の哺乳類モデルにおいて報告された、フィラ全体で保存されているように見える。7 9哺乳類細胞10に対して外発性状の押出が報告されており、保存されたメカニズムが凝集体および小器官の追放の根元にある可能性を示唆する観察である。したがって、エキソファー産生は、神経プロテオスタシスとミトコンドリア品質管理の基本的な、しかし以前は認識されなかった分担を構成する細胞破片管理の保存メカニズムであり、不均衡になると神経変性疾患に積極的に寄与する可能性がある。破片の識別および選別に関与する分子の同定、細胞外皮の異なる細胞外への輸送、押出、顎腺外射体と後期エキソファーを結ぶ筒状の結びつきの形成/sssion、および隣接する細胞による遠隔分解のための大押し出し小胞の認識は、将来の作業のために残っている。線虫モデルおよびフライモデルの研究は、これらのモデルが提供する公平な遺伝的アプローチと強力な細胞生物学的ツールを利用して生理学的文脈に参加する分子を同定するために、集合体およびオルガネラの収集および移動のメカニズムを定義する上で極めて重要である。
エキソファー生物学におけるメカニズムの解読における重要な第一歩は、生体内で再現可能な インビボ exopher定量のためのプロトコルを定義することを含む。 C.エレガンス モデルは、身体が透明であり、蛍光タグ付きタンパク質またはオルガネラを含むと容易に観察することができるので、そのような努力のための特定の利点を提供する。エキソファーは 、C.エレガンス ドーパミン作動性ニューロンPDEおよびCEP、ASEおよびASER感覚ニューロン、および色素充填アンフィドニューロン5によって生成されると報告されている。タッチ受容体ニューロンによって産生されるエキソファーが最も特徴付けられるので、ここで焦点は、エキソファー分析のためのタッチニューロンの使用である。しかし、基本的なアプローチは、任意のセルからのエキソファーの生産を測定するために適用することができます。 C.エレガンス が産生するエキソファーを検出して定量化するプロトコルは、mCherryタンパク質をトランスジェニックに発現する受容体ニューロンを検出し、定量化し、モニタリング可能な貨物とスコアリングにおける時間的制約に重点を置いて概説されている。この記事では 、インビボ エキソファー同定に向けたアプローチと、エキソファー産生を調節する環境および遺伝的条件の定量を定義する。プロトコルは、ベースラインエキソファーの生産の決定と遺伝子型間の比較のための一定の非ストレス条件に対する重要な注意を強調する。

<table><tbody><tr><td>95B Scientific CMOSカメラ</td><td>Photometrics Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &mu;L ローリテンションチップ</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清学的ピペット</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;L 低保持チップ</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>13% 次亜塩素酸ナトリウム</td><td>Acros Organics AC219255000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>2 L 三角フラスコ</td><td>サイエンティフィック ラボ用品</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清ピペット</td><td>アップルトン ウッズ</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300&mu;L 低保持チップ</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 血清ピペット</td><td>アップルトンウッズ</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>9 cm 滅菌ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>C.エレガンス株 野生型</td><td>CGC</td><td>N2</td><td>C.エレガンス株</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 OP50</td>株 <td>CGC</td><td>Op50</td><td>大腸菌株</td></tr><tr><td>FBS10 標準顕微鏡</td><td>マイヤー・インスツルメンツ</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 スタンダード プレートベース、100/100 三眼ヘッド&フリップズーム</td></tr><tr><td>ガラスピペット 270 mm</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>ヘレウス マルチフュージ X3R</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>接種スプレッダー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LBミディアムカプセルMP</td><td>バイオメディカル</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI&ndash;レーザーダイオードイルミネーター89</td><td>ノース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レバミソール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>16595-80-5M4</td><td></td></tr><tr><td>マルチペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M7506</td><td></td></tr>一<tr><td>塩基性リン酸カリウム</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>マルチトロン標準振とうインキュベーターInforsHT</td><td></td><td></td><td></td>INFO28573</tr><tr><td>Nalgene 1 L 遠心分離機</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>P10 ピペット</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td> 3123000020 <td></td></tr><tr><td>P1000 ピペット</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 ピペット</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>pipeteboy 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンマイクロビーズ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C プラス 床置き型遠心分離機</td><td>ソルバル</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>再利用可能なリング状細胞診スライド</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>22037242スライド</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>GFP タッチで発現 ニューロン</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 オートクレーブ</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>サーモフィッシャー scientific</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 スピニングディスク 共焦点ユニット</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166[PMEC-4mCherry]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>mCherry expressed in touch neurons</td></tr><tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>Q128 expressed in touch neurons</td></tr><tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>mitoROGFP で発現</td></tr><tr><td>ZB4528 bzIs166 [PMEC-4mチェリー];zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP]</td>接触ニューロンで発現する<td>Driscoll研究室</td><td></td><td>オートファジーマーカー</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c.エレガンスにおける大エキソファー小胞における生体内ニューロン集合体およびオルガネラ押出におけるスコアリングのための定量的アプローチ

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

誤って折り畳まれたタンパク質およびミトコンドリア機能障害の毒性は、種を越えて、年齢に関連する機能的神経細胞の衰退および神経変性疾患を促進する極めて重要な因子である。これらの神経毒性の課題は、長い間細胞組み込みであると考えられてきましたが、1つのニューロンに由来する誤って折り畳まれたヒト疾患タンパク質が隣接する細胞に現れることができることを裏付けるかなりの証拠が、ヒト神経変性疾患における病理の広がりを促進するために提案された現象である。
凝集タンパク質を発現するC.エレガンス成体ニューロンは、凝集タンパク質、ミトコンドリア、リソソームを含むことができる大きな(約4μm)膜に取り囲まれた小胞を押し出すことができます。これらの大きな小胞は「エキソファー」と呼ばれ、エキソソーム(約100倍小さく、異なる生物形成を有する)とは異なる。エキソファーに細胞の破片を投げ出すは、ヒト神経変性疾患に凝集体が広がるプロセスに関連する、ニューロンプロテオースタシスとミトコンドリア品質管理の基本的な、しかし以前は認識されなかった枝を構成する保存されたメカニズムによって起こり得る。
エキソファーはタッチニューロン内で高コピートランスジェニックmCherryを発現する動物で主に研究されてきたが、これらのプロトコルは、蛍光タグ付きオルガネラまたは様々なクラスのニューロンに関心のある他のタンパク質を使用した発熱の研究にも同様に有用である。
ここに記載されている C.エレガンス の外因の物理的特徴、検出のための戦略、識別基準、定量のための最適なタイミング、およびエキソファーの生産レベルを調節できるストレスを制御する動物の成長プロトコルがあります。一緒に、ここで概説するプロトコルの詳細は、実験室全体のエキソファーの定量分析のための標準を確立するのに役立つはずです。この文書は、エキソファーが産生され、エキソファーが隣接する細胞および遠くの細胞によって反応される分子メカニズムを精巧にしようとする実験室の分野の資源として機能することを目指している。

このプロトコルは、膜結合エキソファーの形態で C.エレガンス 細胞によって生成された大きな凝集および/または小器官押出(〜4μm)の検出および定量のアプローチを記述する。我々は、この破片の剥離メカニズムの解剖を容易にするために必要な株、成長条件、スコアリング基準、タイミングおよび顕微鏡観察の考慮事項について述べる。

C.エレガンスにおける大エキソファー小胞における生体内ニューロン集合体およびオルガネラ押出におけるスコアリングのための定量的アプローチ

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

我々は、神経変性疾患病理の広がりに関連する可能性が高い、興奮性、理解の不十分な生物学と呼ばれるプロセスを介してニューロンからの骨および小器官押出のインビボメカニズムを特徴付ける。これらのアプローチは、押し出された神経細胞のエキソファーの再現可能なスコアリングを達成するために必要であり、近隣細胞へのニューロン伝達を介した細胞ゴミ除去の機械化解剖のためのプラットフォームを実証する。ニューロンが凝集体を排出する方法のin vivoメカニズムを定義することは、実際にヒト神経変性状態の治療を助ける新しい戦略の設計に影響を与える可能性があります。基礎条件の場合、摂氏20度の一定温度で同じ生物学的年齢の家C.エレガンス。細胞内ダイナミクスの生画像化と外発性の特性については、最大20匹の動物をガラス顕微鏡スライド上のアガロスパッドに置き、動物を固定化します。麻痺したワームの上にカバースリップを慎重に置き、スライドを共焦点蛍光顕微鏡のステージに置きます。10 ~40x の目的を使用して、Brightfield で目的の Z 平面を特定し、ワームの位置、頭部の尾方向、および後の神経および外膜の識別のランドマークである外陰部の位置をメモします。同じZ面に留まり、選択した細胞質レポーターに対して10〜40倍の広視野蛍光観察に切り替え、Z軸内をスクロールして動物の深さと焦点面の蛍光発現を観察する。頭部には蛍光神経環があり、より尖った尾には1〜2個の目に見える後方タッチニューロンソマが含まれる。63xレンズでより高い倍率は、神経環、神経細胞のプロセス、および相馬体を識別するのに役立ちます。動物の頭部および横神経プロセスに位置する神経環を特定することは最初に有用である。これを行うには、ワームの先頭から開始し、ゆっくりとZ軸をスクロールして、神経プロセスが取り付けられている神経リングの平面を識別します。神経環が同定されると、蛍光図では、付着したニューロンプロセスを後方から外陰部に向かって横方向に進み、そこで相腫が明らかとなる。丸い体や体に焦点を当てたら、近くにあるすべてのニューロンを特定することが重要です。タッチニューロンの同定のために、最初にALML、ALMR、およびAVM相腫を見つけ、最も明るい信号で、プロセスの最後に丸い細胞体によってマークする必要があります。最も焦点が合っていない神経細胞ソーマが見つかったら、腹側細胞であるAVM細胞を使用して、方向を割り当てるのに役立ちます。AVMニューロンがALMと同じ平面にある場合、動物はその側で休んでおり、横ニューロンはALMRです。AVMニューロンが問題のALMと同じ平面にない場合、焦点面に最も近いタッチニューロンはALMLニューロンである。また、尾部付近に位置する腹側タッチニューロンであるPVMニューロンを同定するのにも有用である。PVMのフォーカス面は、前タッチニューロンがALMLかALMRかを示す。問題のALMがPVMと同じ平面にある場合、観察されたタッチニューロンはALMLニューロンである。最も焦点が合ったALMが同定され、割り当てられた後、エキソファーと間違えないために、関心領域の近くおよびすべてのZ平面の他の相馬体の位置を決定することが重要です。目的のタッチニューロンが見つかったら、ALMRまたはALMLは、ニューロンが大きく突き出た外発ドメインについて検査し、芽出動と見なされるのに十分な大きさであり、これは元の相馬の少なくとも5分の1の大きさである。芽またはエキソファードメインが観察されない場合は、さらに、身体から発せられる付着した薄いフィラメントについて神経細胞ソーマを検査する。アタッチされたエキソファーは、元のソーマに近く、同様のZ平面に位置する傾向があります。取り付けられていないエソファーを同定するには、相馬よりも明るい蛍光タンパク質を濃縮して探します。ここに描かれているが、1つの大きなエポファーがある。単一の相腫に由来する蛍光体が複数存在する場合があります。異なる焦点面と、元の相馬が見つかった遠くの横領域で、未接続のエソファーを探します。エキソファーは通常、ニューロンプロセスから後方向に相腫から遠ざかっている。大きな球状オブジェクトが位置付けされず、ニューロンソマとして識別されていないかどうかを確認します。エコファーは通常、生理学的構造であるが、時間の経過とともに劣化し、より不規則な形状を得る可能性がある。星空の夜のイベントの存在と複数のエキソファー イベントの例を検索します。外発性相馬を外発させないようにするには、観測開始時に焦点が合っていないソマでさえ、近くの相馬体をすべて特定することが重要です。拡張または尖った相腫は観察することができるが、明確な狭窄部位のない延長は、エポファーとして採点されるべきではない。エソファーイベント定量化でソーマの5分の1の大きさを達成していない小さな解決された芽を拒否します。成熟した神経突起は年齢とともに劇的に拡張することができ、蛍光タンパク質はそのような構造の遠位端に移行する可能性がありますが、エキソファーとしてノイライトの伸びを数えないでください。エソファーではない蛍光体を同定するには、広視野蛍光の下で星空の夜の大きな破片と間違えられる可能性のある自己蛍光を必ず除外してください。胚性蛍光シグナルを除外するには、蛍光と明視野照明を切り替え、子宮内の卵とのシグナルの関連を確認します。この表は、エキソファーの産生を監視するために使用されてきた蛍光レポーターを発現する異なるタッチニューロンの概要を示す。エキソファーで押し出されることが知られているカルゴには、Q128、ヒトハンチントン拡張ポリグルタミン反復の融合、リソソーム関連膜タンパク質でタグ付けされたリソソームGFP、マトリックスに局在するGFPでタグ付けされたミトコンドリアなどの凝集体が含まれる。細胞質GFPは強く排出されず、優れた体腫に保持されるが、GFPはエキソファーを弱く可視化するために使用することができる。一般に、基礎条件下でのALMRニューロン発現mCherryによるエキソファー産生は成人期の1日目に始まり、成人1日目から3日目の主要なエキソファー産生時間枠内で調べられたAlMRの約5〜25%の範囲である。特定のストレスおよび遺伝的摂動はALMRニューロン内のエキソファー産生を大きく増加させることができる。エキソファードメイン、無傷のエソファ、または星空の夜のイベントのために関心のあるニューロンとその周辺領域を検査する前に、近くのニューロンのすべてを見つけることが重要です。手動でエキソファーを同定する場合、高含有イメージングを用いた大規模スクリーニングのスループット手法を強化し、全ゲノム解析や機械化的な外発性解剖を可能にします。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶエクソファー形成のメカニズムと定量的スコアリング法。C. elegansを用いた生体内イメージングで神経細胞からの凝集体・オルガネラ押出を観察し、神経変性疾患の病態理解と治療戦略開発に貢献する研究手法を解説します。

C.エレガンスにおける大エキソファー小胞における生体内ニューロン集合体およびオルガネラ押出におけるスコアリングのための定量的アプローチ

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