Name: 単細胞間細菌相互作用の運動的可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶ単細胞レベルで細菌間相互作用を可視化・追跡するタイムラプス顕微鏡法。Pseudomonas aeruginosaとStaphylococcus aureusの動的な挙動を解析し、微生物コミュニティの生態理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、嚢胞性線維症財団ポスドク間移行賞LIMOLI18F5(DHL)、嚢胞性線維症財団ジュニア教員採用賞LIMOLI19R3(DHL)、NIH T32トレーニンググラント5T32HL007638-34(ASP)からの資金提供によって支えられました。ジェフリー・マイズナー、ミンス・キム、イーサン・ガーナーが最初のプロトコルと、イメージングとパッドの作成に関するアドバイスを共有してくれたことに感謝します。

注: このプロトコルのすべての供給の完全な説明とカタログ番号は、資料表にあります。
1. M8T最小メディアの作成
<ol><li>Na2HPO 4・7H2Oの64g、KH222PO4の15g、および2Lボトルに800mLの超純4水(UPW、抵抗率18 MΩ/cm)を溶解して、M8最小塩ベース(5x)の1Lを調製します。pH を 7.6 にする。UPWで1 Lに完全なボリューム。オートクレーブ 45分間</li>
	<li>1 Lボトルに400mLのUPWに100gのグルコースを溶解して、500mLのグルコース溶液(20%w/v)を調製します。UPWで500 mLに完全なソリューション。オートクレーブ 45分間</li>
	<li>400 mLのUPWに100 gのトリプトンを溶解して、500 mLのトリプトン溶液(20%w/v)を調製します。UPWで500 mLに完了。オートクレーブ 45分間</li>
	<li>M8+ 10% トリプトン(M8T)の1Lを調製し、200mLのM8最小塩(1x最終)、10mLのグルコース(0.2%最終)、1MLの1mLの1MLを420%のトリプトン(1mM末)に加えて、20%のトリプトン(1%最終)に50mL(1%最終)をUPWの600mLに加えます。UPWで1 Lに完了します。0.2 μmの滅菌フィルターを通して、滅菌500 mLのメディアストレージボトルにフィルターします。</li>
</ol>1日目:
2. 細菌性一晩培養物の調製
<ol><li>P.緑素吸草またはS.アウレウス(適切な場合は抗生物質を含む)の単一コロニーを有するM8T最小培地5mLを接種し、16時間以下のエアー化で37°Cで一晩インキュベートする。 注:細菌病原体 P.緑素吸 体および S.アウレウス は、一般的に慢性感染症から共分離されているため、この方法に使用され、それらの相互作用を研究することは、それらが多微生物感染中の患者の転帰にどのように寄与するかを理解することが重要である。他の細菌種は、研究の焦点に応じて使用することができます。</li>
</ol>2日目:
3. 細菌株のサブカルチャー
<ol><li>サブカルチャー P.緑素吸草症1:500およびS.アウレウス1:1000新鮮なM8Tの5mL(適宜抗生物質を含む)。培養が中間段階(OD 600=〜0.3-0.5)に達600するまで、37°Cでエアー化してインキュベートする。</li>
</ol>4. パッド金型用材料の製造
<ol><li>平らな端の半分が90°の角度に曲げられるまでブンゼンバーナーで平らで丸い実験室のへらを加熱することによって金属のスパチュラを準備する。別の平らな丸みを帯びた実験室のへらの端を加熱し、わずかに45°Cの角度に最後の10ミリメートルを曲げます。</li>
	<li>35 mm 皿の中にカビが収まるように、シリコーンモールドの四隅を切り落とします。</li>
	<li>70%エタノールを加え、ブンゼンバーナーの炎を通してスパチュラとピンセットを殺菌します。</li>
	<li>70%エタノールで皿とシリコーンモールドを洗浄し、糸くずのないワイプで乾燥させます。</li>
</ol>5. アガロースパッドの調製
注:パッドは、このプロトコルで使用される細菌の栄養源としてM8T最小メディアで調製されます。しかし、パッドに使用される栄養素は、異なる生物のために変更することができます。
<ol><li>M8Tの10mLで2%低溶融アガロースをきれいな50 mLのエルレンマイヤーフラスコに溶かします。フラスコの内容物が沸騰するのを防ぐために、短時間(2〜5s)のマイクロ波を溶液にするまで溶解する。溶けたら、50°Cの水浴で少なくとも15分間冷まします。</li>
	<li>35mm皿の開口部にシリコーンの切り抜きを合わせて金型を準備し、スパチュラで軽くタップしてシリコーンを皿に固定し、金型と皿の間のすべての気泡を取り除きます。</li>
	<li>冷めたら、915μLの溶融アガロースを金型に入れます。蓋をアジャルのままにし、パッドを室温で30分間乾燥させます。</li>
	<li>蓋で皿を覆い、室温でさらに2時間放置します。</li>
	<li>糸くずのないワイプをしっかりと巻き上げて湿度拭き取りを準備します。滅菌ペトリ皿の中に巻いたワイプを入れ、ワイプ全体に500μLの無菌水を均等に加えます。37°Cまで1時間温める。</li>
	<li>パッドと無菌35mm皿を37°Cに1時間温めます。</li>
</ol>細菌細胞の調製と接種パッド
<ol><li>各サブ培養のOD600 を測定し 、P.緑素吸塩 をOD600=0.03 に希釈し 、アウレウス を37°Cに予感させたM8T中のOD600=0.10 に希釈する。 P.緑素吸盤 と S.アウレウス を1:1の比率と渦で混ぜます。 注:株が抗生物質を必要とする場合、抗生物質は夜間およびサブカルチャーに添加することができますが、それがコカルチャーの他の種に影響を与える場合は、イメージングのために種を混合するときに追加しないでください。プラスミドの安定性と、共培養中のすべての種に対する抗生物質の影響は、使用されている各生物/プラスミドについて決定する必要があります。</li>
	<li>ピペット1 μLのコカルチャーは、事前に温め、無菌の35mmガラスカバースリップ皿の底を均等に横切ります。</li>
	<li>滅菌ピンセットを使用して金型からシリコーンカットアウトを取り外します。</li>
	<li>滅菌スパチュラを使用して皿からパッドを取り外します。<ol>
<li>パッドの端の下でわずかに曲がったへらを滑らせながら、金型を逆さまに保持しながら、滅菌ペトリプレートの蓋に落とします。 注:パッドを押し出さないと、それが裂けないように注意してください。パッドのどちら側が底面かを追跡します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>90°斜めのへらをパッドの下にスライドさせ、接種されたカバースリップの上に置くことによって、細菌細胞と一緒に皿にパッドを移します。90°の斜めのヘラを使用して、パッドをカバースリップに対してフラッシュし、気泡を軽く押し出します。</li>
	<li>湿った拭き取りから余分な水分を取り除き、皿の端の周りに置き、パッドに触れないようにします。これで、サンプルのイメージングの準備が整いました。</li>
</ol>7. ライブイメージング用の顕微鏡の設定
<ol><li>実験セットアップの少なくとも2時間前に37°Cに温かい環境室。</li>
	<li>明視野および蛍光イメージングのために顕微鏡、コンピュータ、光源を含むすべてのコンポーネントをオンにします。</li>
	<li>イメージングソフトウェアを開き、光源が接続され、動作していることを確認します。</li>
	<li>ケーラー照明27を実行して、すべての画像面を整列させる。<ol>
<li>まず、「ダミー」皿を使用して20倍の目的で焦点を当てるマークされたカバースリップを持って来ます。コンデンサタレットが「開いた」位置に設定されていることを確認します。 注: ケーラーイルミネーションは、イメージプレーンを適切に整列させるために、ユニークな目的/サンプルごとに実行する必要があります。しかし、より低い倍率の「ダミー」皿との焦点とアライメントは、セットアップと実験開始時間の間の時間を制限するために、より高い倍率でライブサンプルにセットアップを促進します。</li>
		<li>コンデンサーに焦点を合わせます。<ol>
<li>フィールドダイヤフラムを閉じます。 メモ:八角形の開口部が表示されます。コンデンサが完全に焦点を合わせなくなると、視野全体(FOV)が暗く表示されます。</li>
			<li>コンデンサのピント合わせノブを、八角形の端がカリカリになるまで回転させます。 注: イメージ プレーンが正しい位置合わせに近づくにつれて、光の強度が増加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>コンデンサを揃えます。<ol>
<li>位置合わせノブを調整してフィールドコンデンサーを中央に配置します。 注: 八角形は、FOV の中央に中央に配置する必要があります。位置合わせノブは顕微鏡によって異なります。例えば、一部の顕微鏡コンデンサーにはノブがあり、他の顕微鏡にはスクリュードライバーを必要とするネジがあります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ランプフィラメントに焦点を合わせ、コンデンサの絞りを調整します。<ol>
<li>位相望遠鏡またはベルトランレンズを光路に入れ、目的の背面焦点面を観察します。 注: 同心円が 2 つあるはずです。</li>
			<li>ベルトランレンズのフォーカスノブを回して、リングが鮮明に見えるようにします。</li>
			<li>ベルトランレンズをライトパスから取り外します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>八角形がFOVのすぐ外にあるまで、フィールドダイヤフラムを開きます。</li>
		<li>100xの目的に変更し、浸漬オイルの滴を追加する前に、一致するフェーズリングを所定の位置にスライドさせ、準備したサンプル皿を上に置きます。</li>
		<li>細菌サンプル皿で100xの目的でケーラーの照明を行います。</li>
	</ol></li>
	<li>細かい調整のみを使用して細菌に焦点を当てます。FOV内の細菌が接眼レンズを通して焦点を合わせられたら、顕微鏡のカメラボタンを押してカメラへの光路を切り替えます。</li>
	<li>イメージング ソフトウェアの [フェーズ ] オプションをクリックします。</li>
	<li>ソフトウェアで光源を選択し、使用する光の割合を手動で入力するか、または光のパーセンテージスケールでバーをスライドさせて、放出されるDIA LEDライトの割合を調整します。</li>
	<li>光源をクリックして、手動で目的の露光時間を入力するか、提供されるドロップダウンメニューから露光時間を選択して、DIA LEDライトの露出時間を調整します。 注意:露光時間は、使用するカメラによって異なります。</li>
	<li>蛍光を使用する場合は、対象の蛍光チャネルをクリックして、対応する各チャンネル(すなわち、TxRed、GFP)のカメラ設定を調整します。<ol>
<li>発光する蛍光光の割合を設定し、露光時間を調整します(DIA LEDライトのステップ7.7と7.8で実行)。</li>
		<li>または、[ビジュアリゼーション コントロール] ドロップダウン メニューで他のビット深度オプションのいずれかを選択して、ビット深度を変更してダイナミック レンジを調整します。</li>
	</ol></li>
	<li>取得コントロールメニューの XY オプションをクリックして、対象となる XY 位置を選択します。<ol>
<li>ジョイスティックでステージ位置を移動するか、画面上のFOVをクリックしてドラッグし、空のボックスをクリックして特定の位置のXとY座標を保存します。 注:タイムラプス取得には、可能な限り近い3つの異なるXYポジションの選択をお勧めします。</li>
	</ol></li>
	<li>取得制御メニューの XY タブにある PFS ボックスをクリックするか、ジョイスティックコントロールパネルの PFS ボタンを押して、完全なフォーカスシステム (PFS) をオンにします。</li>
	<li>細菌細胞に焦点を合わせるには、微調整ノブを回転させます。</li>
	<li>セルが目的のフォーカス平面に配置されたら、各 XY 位置の PFS ボタンをクリックします。 注: PFS は、タイムラプス実験中に Z 軸のドリフトを補正します。これは、時間の経過とともに細菌細胞の焦点を維持するために必要です.製造者によって報酬制度が異なります。</li>
	<li>取得制御メニューのオプションから選択して、各チャンネルの取得間隔と周波数(例えば、位相コントラストおよび各フルオロフォア)を含む画像取得条件を選択します。 注:ここで紹介する実験では、位相コントラスト画像は5~10秒間隔で取得され、GFPチャンネルとTxRedチャンネルの蛍光画像は20分ごとに取得されます。</li>
	<li>顕微鏡と取得の設定が設定されたら、イメージングを開始します。</li>
</ol>8. オプション: ライブ/デッドイメージングの変更
<ol><li>M8Tの10 mLで2%アガロースを溶かし、50°Cの水浴で少なくとも15分間冷まします。</li>
	<li>溶湯系アガロースにヨウ化プロピジウム1mMを加える。</li>
	<li>冷却したら、調製された金型に915μLのアガロースを入れます。</li>
	<li>蓋をアジャルのままにし、パッドを室温で30分間乾燥させます。光から守る。</li>
	<li>蓋で皿を覆い、室温でさらに2時間放置します。</li>
	<li>湿度拭き取りを準備します。<ol>
<li>糸くずのない紙をしっかりと巻き上げる。</li>
		<li>滅菌ペトリ皿に拭き取り、500μLの無菌水をワイプに加えます。</li>
		<li>37°Cで1時間インキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37°Cでパッドと無菌35mm皿を1時間インキュベートします。</li>
	<li>セクション6:細菌細胞の調製および接種パッドに示すように、皿を接種するに進みます。</li>
</ol>9. データ分析
<ol><li>セルの識別<ol>
<li>イメージ ファイルをイメージング ソフトウェアで開き、追跡に使用するフレームのみを含むようにファイルをトリミングし、対象セルにズーム インし、位相コントラスト チャネルにのみ拡大します。 注: トリミングされたファイルは、元のファイルに干渉することなく追跡データを保存できる新しいファイルとして保存できます。</li>
		<li>解析コントロールメニューで対象地域(ROI)を選択するオプションを選択し、解析に使用する最初のフレーム内の個々の細菌細胞または細胞のクラスターをトレースしてROIを定義します。 注: ROI は手動で定義することも、バイナリとして定義することもできます。<ol>
<li>ROI を手動で定義する<ol>
<li>個々の細菌細胞または細胞のクラスターの周囲をトレースして、ROI を手動で定義します。 注: 解析ソフトウェアでは 、P. 緑素細胞、または他の棒状の細胞は、 楕円 ROI を選択し、細菌細胞のサイズに合わせて調整された楕円を描画することによって手動でトレースできます。または、 ポリゴン ROI オプションを選択して、セルのクラスターなど、従来型以外の ROI をトレースすることもできます。</li>
			</ol>
</li>
			<li>バイナリROを特定する<ol>
<li>バイナリ ROI を定義するには、[ バイナリから ROI へのバイナリ] オプションをクリックします。 注: オブジェクトは、位相コントラスト チャネルの明るいピクセルの背景から暗いピクセル化された細菌細胞を分離して、バイナリ レイヤーで定義されます。</li>
				<li>セルをしきい値にするには、分析コントロール メニューの [しきい値 ] オプションを選択します。対象のチャンネルを選択し、蛍光ヒストグラムのバーをスライドさせて、しきい値の間隔値を調整します。 注: ROI のバイナリ オブジェクト識別は、細菌細胞を閾値にすることで蛍光画像で定義することもできます。しきい値は、どの蛍光強度が対象と見なされ、どのような蛍光強度が背景を構成するかを確立します。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>セルトラッキング<ol>
<li>ROI を手動で追跡するには、イメージング シーケンスの次のフレームを選択し、各 ROI をクリックしてドラッグして元の細菌細胞の新しい位置に合わせて ROI の位置を調整します。 注:細菌細胞の位置が変わっていない場合、ROIを移動する必要はありません。</li>
		<li>セルを追跡するすべての連続フレームで繰り返します。</li>
		<li>セルが分割されると、手順 9.1 で説明したように、ドーターのセルを新しい ROI として定義し、新しく分割されたセルの追跡を開始します。 注: セルがバイナリとして識別される場合は、 トラックバイナリ 機能を使用して、選択したフレームの ROI を自動的に追跡します。</li>
		<li>選択したすべてのフレームを通してセルを追跡したら、分析するデータをエクスポートします。</li>
		<li>データ・スプレッドシートを開き、解析に必要な測定値(オブジェクト速度、加速度、パスの長さなど)を特定します。 注: 方向を測定する場合は、パス長と線長の測定値が必要です。ライン長さはユークリッド距離、またはトラック原点から S.アウレウス コロニーの端までの直線距離の測定です。パス長は、累積距離、またはすべてのフレームからのトラックセグメントの合計の測定です。方向は、ユークリッド距離の比として計算することができ、D(E)、(ライン長)、累積距離、D(A)、(パス長)を超える。</li>
	</ol></li>
	<li>蛍光定量<ol>
<li>ステップ 9.1 で説明されているように、蛍光細菌細胞の ROI を定義します。</li>
		<li>残りの蛍光フレームで細菌細胞またはクラスターのトレースまたは ROI の移動を繰り返します。</li>
		<li>生成された表を表ファイルにエクスポートして、蛍光強度を分析します。</li>
		<li>データスプレッドシートで、トレースされた細菌細胞の平均蛍光強度を表す「平均強度」の列を探します。</li>
		<li>平均強度値をグラフ化して、時間の経過に伴う蛍光の変化を調べています。 注:時間の経過に伴う蛍光の変化は、目的の蛍光標識遺伝子の遺伝子発現の変動を表します。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lamichhane, J. R., Venturi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergisms+between+microbial+pathogens+in+plant+disease+complexes%3A+a+growing+trend%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 385(2015).</li>
<li>Cursino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+operon%2C+Pil-Chp%2C+that+controls+twitching+motility+and+virulence+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).</li>
<li>Limoli, D. H., Hoffman, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Help%2C+hinder%2C+hide+and+harm%3A+what+can+we+learn+from+the+interactions+between+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+during+respiratory+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections.</a> Thorax. 74, 684-692 (2019).</li>
<li>Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+models+of+polymicrobial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm models of polymicrobial infection.</a> Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+biofilms%3A+e+pluribus+unum%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial biofilms: e pluribus unum.</a> Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).</li>
<li>Marino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+analysis+of+dental+plaque+and+endotracheal+tube+biofilms+from+mechanically+ventilated+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients.</a> Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).</li>
<li>Frank, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+diversity+in+chronic+open+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Microbial diversity in chronic open wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).</li>
<li>Fazli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).</li>
<li>Shimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogens+in+COPD+exacerbations+identified+by+comprehensive+real-time+PCR+plus+older+methods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%22%5BJournal%5D)">Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).</li>
<li>Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+and+ventilator-associated+pneumonia+in+a+community+hospital+intensive+care+unit%3A+a+retrospective+review+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis.</a> BMC Research Notes. 7, 232(2014).</li>
<li>Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+longitudinal+analysis+of+chronic+MRSA+and+Pseudomonas+aeruginosa+co-infection+in+cystic+fibrosis%3A+a+single-center+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).</li>
<li>Limoli, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+co-infection+is+associated+with+cystic+fibrosis-related+diabetes+and+poor+clinical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).</li>
<li>Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+interactions+between+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus+enhances+elastase+production+in+Pseudomonas+aeruginosa+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures.</a> Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).</li>
<li>Michelson, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+alters+growth+activity%2C+autolysis%2C+and+antibiotic+tolerance+in+a+human+host-adapted+Pseudomonas+aeruginosa+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage.</a> Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).</li>
<li>Ngamdee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+between+Burkholderia+pseudomallei+and+B.+thailandensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis.</a> BMC Microbiology. 15, 56(2015).</li>
<li>Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+strains+show+larger+variations+in+competitive+growth+in+mixed+culture+biofilms+and+suspensions+with+bacteria+from+food+processing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments.</a> International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).</li>
<li>Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+interspecific+competition+on+trait+variation+in+Phaeobacter+inhibens+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).</li>
<li>Meisner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsEX+is+required+for+CwlO+peptidoglycan+hydrolase+activity+during+cell+wall+elongation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).</li>
<li>Coates, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-induced+population+fluctuations+and+stochastic+clearance+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria.</a> eLife. 7, 32976(2018).</li>
<li>Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+laminar+flow+velocity+on+the+kinetics+of+surface+recolonization+by+Mot%2B+and+Mot-+Pseudomonas+fluorescens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens.</a> Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).</li>
<li>Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+analysis+of+Vibrio+parahaemolyticus+variants+in+high-+and+low-+viscosity+microenvironments+by+use+of+digital+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing.</a> Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).</li>
<li>Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+diffusion+coefficients+in+biofilms+by+confocal+laser+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).</li>
<li>Limoli, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+induce+exploratory+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> eLife. 8, 47365(2019).</li>
<li>Burrows, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+twitching+motility%3A+type+IV+pili+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).</li>
<li>Lee, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenerational+memory+and+adaptive+adhesion+in+early+bacterial+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities.</a> PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).</li>
<li>Tolosa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+field-of-view+integral+imaging+display+using+multi-K%C3%B6hler+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination.</a> Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).</li>
</ol>

著者らは、開示するものは何もないと宣言している。

ここで提示される方法は、単細胞レベルでの細菌種相互作用の生細胞イメージングのためのプロトコルと、細胞追跡および細胞生存率の監視を含む他のアプリケーションの変更について説明する。この方法は、時間の経過とともに他の種との共培養における微生物の単細胞挙動を研究するための新しい道を開きます。具体的には、このプロトコルは、特に運動性のための表面および液体関連の付属物を有する生物を研究する場合に、細菌表面挙動を観察する際に、このコカルチャー法の有用性を示す。例えば、単一の焦点面で細菌の動きを表面に制限することによって、S.アウレウスに応答してP.緑内因症の増加および指向性ピリ媒介運動性を可視化することができる。
前述のように、このイメージング方法で最適な結果を得るには、サンプルの温度と湿度、イメージング機器(目標とステージ)を含むいくつかの条件を考慮する必要があります。その他のヒントとトラブルシューティングについては、補足ファイル 1を参照してください。不十分な乾燥パッドが最も一般的な問題の1つであるため、プロトコルの使用に...

多微生物群集は、環境,1、2、3、2および1人間のニッチ34、55の様々なにまたがる4自然界で一般的です。ヒト疾患における最も悪名高い多微生物感染症のいくつかは、歯科バイオフィルム6、慢性創傷77、8、8慢性閉塞性肺疾患9、人工呼吸器関連肺炎10、および遺伝性疾患嚢胞性線維症(CF)11、12を有する個人における11,12呼吸器感染症を含む。これらの感染症は、多くの場合、多様な微生物種で構成されています。しかし、最近では、グラム陽性菌黄色ブドウ球菌とグラム陰性菌シュードモナス・エルギノーサとの相互作用に注目が集まった。これらの生物に対してコイン感染した患者およびインビトロ分析を含む研究は、疾患の進行、微生物の生存、病原性、代謝および抗生物質感受性に深い影響を及ぼす可能性のある競争的および協力的相互作用の両方を明らかにする(Hotterbeekxら201713とリモリとホフマン20193によって詳細にレビュー)。
感染時の種間相互作用への関心の高まりは、多微生物群集行動を研究するための様々な方法をもたらしました。典型的には、これらの研究は、単一培養と共培養の表現型の違いを調査するためにプレートまたはブロスベースのアッセイを利用している。例えば、固体表面上のP.緑素吸草およびS.アウレウスをコキュリングすることは、コロニー表現型、顔料、または多糖産生14、15、1615,16の成長阻害または変化の視覚化14を可能にした。混合種バイオフィルムは、生物または生物的表面上、ならびに液体培養における細菌種の交成も、遺伝子およびタンパク質発現17、18,18に加えて、成長、代謝、抗生物質耐性、競合および生存率の変化の測定を可能にした。これらのバルク培養実験は、P.緑素吸盤とS.アウレウスがコミュニティ規模でどのように影響を与えるかについての洞察を明らかにしているが、単一細胞レベルで起こる相互作用に関する重要な質問に答えることができない。ここで示す方法は、時間の経過とともに共培養されたコミュニティ内の単一細胞の動き、細胞生存率、および遺伝子発現の変化に焦点を当てることによって、種間相互作用を研究するためのアプローチを追加します。
単一細胞相互作用は、細胞のバルクコミュニティで行われる相互作用とは大きく異なる場合があります。単一細胞解析を通じて、コミュニティ内の異質性を定量化して、細胞の空間配置がコミュニティダイナミクスに与える影響や、グループの個々のメンバー内での遺伝子およびタンパク質発現レベルの変化を研究することができます。また、追跡セルは、複数の世代を通じて、単一のセルがどのように移動し、動作するかを把握できます。細胞の動きと遺伝子発現の変化を同時に追跡することで、遺伝子の変動とそれに対応する表現型との間に相関関係を作ることができます。単細胞レベルで個々の細菌種を研究するための以前のプロトコルが記載されている。これらの研究は、単一の平面における経時の生画像細胞を利用し、細胞分裂および抗生物質感受性19,20,20のような表素型を観察するのに有用であった。付加的な生画像顕微鏡は単一細菌種21、22、23,22,23の成長、運動性、表面の植民地化およびバイオフィルム形成を監視するために利用されている。しかし、これらの研究は、単一培養における細菌の生理学を理解するための洞察力を有するが、共培養における複数の細菌種の単細胞挙動を観察するための実験は限られている。
ここでは、単一種のイメージングに使用される以前のプロトコルは、P.緑素吸草症とS.アウレウスの相互作用を研究するために適応されてきた。これらの生物は、その細胞形態に基づいて位相コントラスト下で分化することができる(P.緑分症はバチルス及びS.アウレウスはコッシである)。この方法の開発は、最近、S.アウレウス24の存在下でのP.緑内因性の以前に記述されていない運動性行動の可視化を可能にした。P. aeruginosaは、遠くからS.アウレウスを感知し、S.アウレウス細胞のクラスターに向かって増加し、方向単一細胞の動きに応答することができることが判明した。P.アウレウスに向かう緑素吸い動きはIV型ピリ(TFP)を必要とすることが分かったが、その協調的な伸張と引き込みが筋状運動性25と呼ばれる動きを生み出す毛髪状突起。
これらの研究は、種間の以前の相互作用を尋問するためのこの方法の有用性を示している。しかし、後で相互作用する時点で高い細胞密度でのイメージングは、細胞の単一層を識別できなくなったため困難であり、これは主にポストイメージング解析中に問題を引き起こす。この制限を考えると、この方法は、後の相互作用を代表する高い細胞密度で従来の巨視アッセイをフォローアップできる以前の相互作用に最も適しています。この方法の追加の制限は、一度に1つのサンプルしか画像化できないので、低スループットの性質と、顕微鏡、カメラ、および環境室のコストが含まれます。また、蛍光顕微鏡は、光毒性や光漂白などの細菌細胞にリスクをもたらし、蛍光画像を取得できる頻度を制限します。最後に、この方法で使用されるアガロースパッドは、環境の変化に対して非常に影響を受けやすく、条件が正しくない場合にパッドが収縮または膨張し始めることができることを考えると、温度および湿度などの条件を制御することが重要です。最後に、この方法は宿主環境を模倣するものではありませんが、異なる細菌種が表面でどのように反応するかの手がかりを提供し、環境/宿主状態を模倣するように設計されたアッセイでフォローアップすることができます。
この方法は、単一細胞の動きを追跡する以前の研究とは異なり、細胞はカバースリップとアガロースパッドの間に接種され、細胞を表面に制限する。これにより、単一平面での時間経過に従ったセルトラッキングが可能になります。しかし、細胞が液体26に沈下されたときに観察される過渡的な表面関与のサイクルを制限する。アガロースパッドの下で細菌をイメージングする追加の利点は 、P.緑化 吸引運動性25を調べるために古典的に使用される巨視的なプレートベースのサブ表面接種アッセイを模倣していることである。このアッセイでは、細菌細胞はペトリ皿の底部と寒天の間に接種され、この顕微鏡プロトコルと同様に、接種の点から皿の底を外側に移動する細胞を単一の平面に保ちます。
ここで提示される種間相互作用を視覚化するためのタイムラプス顕微鏡プロトコルは、1)細菌試料およびアガロースパッドを調製し、2)イメージング取得用の顕微鏡設定を選択し、3)画像後分析から構成される。細胞の動きと追跡の詳細な視覚化は位相コントラストによって短時間間隔で画像を集録することによって行うことができる。蛍光顕微鏡は、経時の細胞生存率または遺伝子発現を決定するために利用することもできる。ここでは、アガロースパッドに生用染料を添加して蛍光顕微鏡に適応した例を1つ示す。

<table><tbody><tr><td>アガロースパッド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm ガラス底皿、20 mm マイクロウェル付き #1.5 カバー ガラス</td><td>セルビス</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>アガロースパッド金型用1つ、実験用</td></tr><tr><td>1つ KimWipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Low-Melt Agarose Nu-Sieve</td><td>GTG/Lonza</td><td>50081</td><td>アガロースパッド</td></tr><tr><td>作成用丸底ヘラ</td><td>VWR</td><td>82027-492</td><td></td></tr><tr><td>丸型テーパースパチュラ</td><td>VWR</td><td>82027-530</td><td></td></tr><tr><td>シリコンアイソレータ、プレスツーシール、1 ウェル、D 直径 2.0 mm 20 mm、シリコン/接着剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6685-25EA</td><td>アガロース パッド金型用</td></tr><tr><td>滅菌ペトリ プレート、85 mm</td><td>Kord-Valmark /RPI</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>VWR</td><td>89259-944</td><td></td></tr><tr><td>M8T Minimal Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D (+) グルコース</td><td>RPI</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>RPI</td><td>P250500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208094</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>DF0123173</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor Sona 4.2B-11</td><td>Andor</td><td>77026135</td><td>Camera. 4.2 メガピクセル裏面照射型 sCMOS, 11 &mu;mピクセル、95%QE、48 fps、USB 3.0、Fマウント。</td></tr><tr><td>フィルターキューブ GFP</td><td>ニコン</td><td>96372</td><td>フィルターキューブ</td></tr><tr><td>フィルターキューブ TxRed</td><td>ニコン</td><td>96375</td><td>フィルターキューブ</td></tr><tr><td>H201-NIKON-TI-S-ER</td><td>Okolab</td><td>77057447</td><td>ステージトップインキュベーター</td></tr><tr><td>ニコン NIS-Elements AR GA3および2Dおよび3Dトラッキング</td><td>ニコン</td><td>77010609、MQS43110、77010603、MQS42950</td><td>データ分析用ソフトウェア</td></tr><tr><td>ニコン Ti2 エクリプス</td><td>ニコン</td><td>モデルTi2-E</td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>CFIプランアポ&#411;20倍対物レンズ (0.75NA)</td><td>Nikon</td><td>MRD00205</td><td>対物レンズ</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo &#411;100x oil Ph3 DM 対物レンズ (1.45NA)</td><td>Nikon</td><td>MRD31905</td><td>対物レンズ</td></tr><tr><td>ThermoBox with built-in fan heaters</td><td>Tokai Hit</td><td>TI2TB-E-BK</td><td>Enclosure</td></tr><tr><td>Bacterial Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT)</td><td></td><td>PMID: 7604262</td><td>非ムコイド原栄養生物</td></tr><tr><td>緑膿菌 PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)</td><td></td><td>PMID: 9361441</td><td></td></tr><tr><td>緑膿菌 PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2</td><td></td><td>PMID: 26041805</td><td></td></tr><tr><td>黄色ブドウ球菌 USA300 LAC (WT)</td><td></td><td>PMID: 23404398</td><td>USA300 CA-メチシリン耐性 LAC (プラスミド</td></tr><tr><td>なし)黄色ブドウ球菌 USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP)</td><td></td><td>PMID: 20829608</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus USA300 LAC &#916;agrBDCA</td><td></td><td>PMID: 31713513</td><td></td></tr><tr><td>Viability Stain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td>LIVE/DEAD&trade;BacLight&trade;細菌生存率キット</td></tr></tbody></table>

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

多微生物群集は自然界でユビキタスであるが、単細胞レベルでの相互作用の研究は困難である。このように、2つの細菌病原体間の種間相互作用を観察するための顕微鏡ベースの方法が開発された。この方法を用いて、モチルグラム陰性病原体、 緑膿 菌および非可動性グラム陽性病原体との相互作用を問い合う方法を用 いることが、 ここで実証されている。このプロトコルは、カバースリップとアガロースパッドの間の各種を共同接種することで構成され、細胞を単一平面に維持し、空間と時間の両方で細菌の挙動を視覚化することができます。
さらに、ここで示したタイムラプス顕微鏡は、単一培養や他の種との共培養における細菌種運動性の変化を含む、2種以上の細菌種間で起こる初期の相互作用を視覚化するのに理想的である。顕微鏡の設定では限られたサンプル空間の性質上、このプロトコルは、細胞集団が高すぎると細菌種間の後の相互作用を研究するために適用されにくい。しかし、生きた細菌細胞や死んだ細菌細胞のイメージングのための染色の使用、蛍光レポーターによる遺伝子またはタンパク質発現の定量、単一種および多種実験の両方における細菌細胞の動きを追跡するプロトコルのいくつかの異なる用途があります。

説明された方法の使用に成功すると、一連のフレームが生成され、種間相互作用が時間の経過とともに観察されるビデオが生成されます。図 1の図は、イメージング用の材料の準備に関する主要な手順を示すビジュアルを提供します。この方法の使用は、単一培養とS.アウレウスとの共培養において異なる行動を示すP.緑分化細胞のデモンストレーションを可能にした。ラフトにグループ化されたままの単一培養中のP.エルギノーサ細胞と比較して、S.アウレウスとの共培養時に、P.エルギノーサは、S.アウレウスコロニーに向けて単細胞運動性を増加させた(図2A-2B)。Figure 2A蛍光標識細菌株はまた細菌種の混合集団を視覚化することを可能にする。GFP標識P.緑素吸い道を用いて、P.緑素吸いの単細胞が運動性を増加させた後、それらはS.アウレウスコロニーを包囲し、...

この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

このプロトコルは、一つの細胞レベルでの細菌間相互作用を時間の経過とともに可視化し追跡することを可能にする。この技術の主な利点は、細胞追跡、遺伝子発現および生存性染色を含む細菌相互作用を研究するための適用性である。さらに、条件は、異なる生物を研究するために変更することができます。まず、10ミリリットルの細菌増殖培地で2%低融解アガロースを50ミリリットルのアーレンマイヤーフラスコで溶かしてアガロースパッドを調製する。アガロースが溶液になるまで短い間隔でフラスコを電子レンジし、50度の摂氏水浴で少なくとも15分間冷まします。35ミリメートル皿の開口部に切り取られたシリコンを合わせ、皿をひっくり返し、スパチュラで切り取ったシリコンを軽くタップして皿に固定し、気泡を取り除きます。アガロースが冷却されると、915マイクロリットルの溶融アガロースが金型に入り、パッドを乾燥させます。実験を設定する少なくとも2時間前に、顕微鏡環境室を実験温度まで温めます。糸くずのないワイプをしっかりと巻き上げて湿度拭き取りを準備します。滅菌ペトリ皿の中に巻いたワイプを置き、500マイクロリットルの無菌水を直接ワイプに加えます。すべての材料を平衡化するために、ワイプ、パッド、滅菌35ミリメートル皿を実験温度まで温めます。パッドが乾燥したら、ピペット1マイクロリットルの共培養は、事前に温めた無菌35ミリメートルガラスカバースリップ皿の底を均等に横切ります。無菌ピンセットを使用してアガロース型から切り出したシリコーンを取り出し、側面に傾け、アガロースパッドの端の下でわずかに曲がったへらを滑らせて滅菌ペトリプレートの蓋に落とします。パッドの下に90度斜めのヘラをスライドさせ、接種カバースリップの上に置くことによって、細菌細胞の底側を下にして皿にパッドを移します。スパチュラを使用してカバースリップに対してパッドをフラッシュし、気泡を軽く押し出します。湿った拭き取りから余分な水分を取り除き、それを皿の端の周りに置き、パッドに触れないようにします。これで、サンプルのイメージングの準備が整いました。パッドを接種する前に、すべての画像フレームを揃えるカラー照明を行って顕微鏡を設定します。接種された皿が準備ができたら、100Xの目的で料理を見て、細菌の結果に焦点を当てます。イメージングソフトウェアのフェーズオプションをクリックし、光源を選択して光のパーセンテージスケールでバーをスライドさせることで、放出されるDIA LEDライトの割合を調整します。または、露出時間を手動で入力します。フェーズチャネルを右クリックし、「現在の顕微鏡設定を割り当てる」オプションを選択して、フェーズチャネルの設定を保存します。蛍光を使用する場合は、対象の蛍光チャネルを選択し、発光する蛍光の割合を設定し、前述のとおり、露光時間を調整します。または、ドロップダウン メニューで他のオプションのいずれかを選択して、入札の深さを変更してダイナミック レンジを調整します。蛍光チャネルを右クリックし、[現在の顕微鏡設定を割り当てる]オプションを選択して、蛍光チャネルの設定を保存します。[XY] タブで、[ポイント名] 列のボックスをクリックして、選択した XY の位置を保存します。次に、タブの下部にある PFS ボックスをクリックして、完璧なフォーカス システムをオンにします。セルにフォーカスを設定し、[PFS] 列の矢印をクリックして、XY 位置のフォーカスを保存します。他のすべての XY 位置に対してこのプロセスを繰り返します。前に示したように、フェーズ タブの下に XY 位置の設定を保存します。[時間]タブをクリックし、ボックスをオンにして、取得間隔、周波数、イメージング時間を選択します。次に、波の長さタブをクリックし、ボックスをチェックして、イメージングとチャンネル間隔周波数で使用するチャンネルを選択します。設定で釣り合ったら、[今すぐ実行]をクリックして、タイムラプスイメージングを開始します。S.アウレウスとの共培養時にいかだにグループ化されたままの単一培養中のP.aeruginosa細胞と比較すると、P.aeruginosaはS.aureusコロニーに対する単細胞運動性を増加させた。P.aeruginosa単一細胞は、S.アウレウスコロニーを包囲し、最終的に侵入します。実験中に湿度が多すぎたり少なすぎたり、誤って乾燥したパッドは、パッドの移動や細胞の視野外へのドラッグによるドリフトにつながる2つの一般的な問題です。写真の漂白と光毒性は、細胞を最初に引き起こし、蛍光を緩め、その後分裂を停止し、最終的に後続のフレームで死ぬ可能性があります。最初は近すぎて近い細胞は、他の種が応答できる分泌された信号の勾配を確立するのに十分な時間がない可能性があります。細菌細胞の生存率はアガロースパッドにヨウ化プロピジウムを添加することによって可視化することができる。緑色の細胞はGFPを積極的に発現する生細胞を示し、赤色細胞はP.aeruginoa細胞遊離上清で処理された後に死んだヨウ化プロピジウム染色細胞を示す。個々のP.aeruginosa細胞の動きは、細胞がS.aureusクラスターに到達するフレームを通して細胞がいかだを残すフレームから追跡されます。P.aeruginosaいかだとS.aureusクラスター間の距離はユークリッド距離を提供し、トラックの全長は累積距離を提供します。各セルの方向付けは、累積距離に対するユークリッド距離の比として計算される。野生型P.aeruginosaは、指向性運動に必要なアグリ規制された分泌因子を欠くS.アウレウスに向かうよりも有意に高い指向性を有する野生型S.アウレウスに向かって移動する。このプロトコルを試す際には、各研究者が、地理的位置、実験室環境、およびそれらの特定の実験に基づいて、ライブイメージングでアガロースパッドを乾燥させる条件を最適化する必要があることを覚えておいてください。この技術は、バルク培養におけるそれらの行動の調査中に以前に隠されていたシュードモナス・エルギノーサと黄色ブドウ球菌との相互作用を明らかにし、これらの生物が感染中にどのように相互作用するかを理解することに近づく。

kinetic-visualization-single-cell-interspecies-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。...

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

出典: Morales-Soto、N. et al.、 細菌表面運動性アッセイの調製、イメージング、および定量化。 J. Vis. 経験。...

細菌の表面運動性を可視化するためのスウォーミングアッセイ

出典: Pioli、R.、 et al.、 シーケンシャルキャピラリティアシストアセンブリによる微生物と微粒子のパターニング。 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオでは、カーボンフリー懸濁液と制御されたフローを使用して、マイクロ流体トラップで単一の蛍光タグ付き 大腸菌(大腸菌)...

マイクロ流体パターニングと蛍光に基づく単一細胞細菌増殖の追跡

出典: Yarringto、K.D.、 et al. 単一細胞種間細菌相互作用の速度論的可視化 J. Vis. 経験。...

単一細胞細菌相互作用の可視化

出典:ケイビーン、M. T.らバチルス・サブティリスの単細胞マイクロ流体解析。J. Vis.

マイクロ流体システムにおける細菌増殖を単細胞分解能で追跡

出典: Bratton, B. P., 他、『 細菌細胞の三次元イメージングによる正確な細胞表象とタンパク質局在化のための研究』。 J. Vis. Exp.

蛍光イメージングによる細菌タンパク質分布の三次元可視化

このビデオは、単一細胞レベルでの細菌の競争を研究するための蛍光顕微鏡法に基づく方法を示しています。この方法は、細菌群集の構造と機能に関する洞察を提供します。...

Bacterial Co-Incubation Assay:単一細胞レベルでの種内細菌の競合を可視化するための蛍光顕微鏡ベースの技術

このビデオでは、蛍光タンパク質、ドナーeGFP、およびアクセプターmCherryで標識された細胞質タンパク質を発現する生きた細菌のタンパク質間相互作用を決定するためのFLIM-FRETイメージング技術について説明しています。また、この組み合わせ技術により、相互作用するタンパク質の定量も可能になります。...

生きた細菌におけるタンパク質間相互作用の特性評価のためのFLIM-FRETイメージング

単一分子追跡と組み合わさ光活性化局在化顕微鏡（PALM）は、生大腸菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の直接観察及び定量化を可能にする。...

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

この原稿は、単細胞蛍光顕微鏡を用いて、コカルチャーにおける細菌の競合を可視化し定量する方法を説明する。...

単細胞蛍光イメージングによる細菌間競争の定量化

ここでは、呈色反応に基づいて細菌の運動性を検出するためのプロトコルを提示します。この方法の主な利点は、評価が容易で精度が高く、特殊な機器を必要としないことです。...

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

学ぶ単細胞レベルで細菌間相互作用を可視化・追跡するタイムラプス顕微鏡法。Pseudomonas aeruginosaとStaphylococcus aureusの動的な挙動を解析し、微生物コミュニティの生態理解に貢献します。

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

さらに動画を探す