Name: サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶサッカロミセス・セレビシエにおけるサプレッサースクリーンによる寿命調節遺伝子の同定法。SIR2遺伝子の過剰発現効果を評価し、老化メカニズムの解明に役立つ実験手法を習得できます。

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ジェームズ・T・アーノーネは、ウィリアム・パターソン大学の2017年と2018年の組換えDNA技術コースの学生の支援を認めたいが、その努力は著者のしきい値を超えなかった:クリストファー・アンディーノ、フアン・ボテロ、ジョセフィーヌ・ボザン、ブレンダ・カルパ、ブレンダ・キューバズ、ヘッドラブ・エッセル・ダッセル、ウェイン・コ、ネルソン・メヒア、ヘクター・モットーラ、ラビア・ナズ、アブドゥッラー・オデ、パール・パグンタラン、ダニエル・ラザエ、ガブリエラ・レクター、アイーダ・ショノ、マシュー・ソー。あなたは偉大な科学者であり、私は皆さんがいなくて寂しいです!
著者らは、ウィリアム・パターソン大学の指導研究技術の支援(グレッグ・マティソン、ピーター・カンナロッツィ、ロブ・マイヤー、ダンテ・ポルテラ、ヘンリー・ハイニッシュ)の貴重な支援を認めたいと考えています。著者らはまた、ARTサポートのためのプロボストのオフィス、学部長と科学と健康の大学研究センターは、この仕事のサポート、およびこのプロジェクトをサポートするための生物学部門を認めたいと思います。

<ol><li>López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li>
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<li>Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+and+longevity+in+the+simplest+animals+and+the+quest+for+immortality%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality.</a> Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).</li>
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<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversibility+of+irreversible+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Reversibility of irreversible aging.</a> Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).</li>
<li>Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+physiological+manifestations+and+measurement+of+aging+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans.</a> Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).</li>
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<li>Bitto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+rapamycin+treatment+can+increase+lifespan+and+healthspan+in+middle-aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice.</a> elife. 5, 16351(2016).</li>
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<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+screen+in+Saccharomyces+cerevisiae+identifies+vacuolar+protein+sorting%2C+autophagy%2C+biosynthetic%2C+and+tRNA+methylation+genes+involved+in+life+span+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation.</a> PLoS Genetics. 6 (7), (2010).</li>
<li>Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+and+chronological+aging+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae.</a> Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).</li>
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<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).</li>
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</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

老化の遺伝学を解明することは困難な課題であり、存在する複雑な相互作用に関する重要な洞察を得ることができるさらなる研究の機会が多い。酵母45,46,46のヌル株の研究のための機能喪失変異体の迅速な生成を可能にする多くの方法がある。この方法は、過剰発現サプレッサー研究のためにpRS315ベクター上の遺伝子を同定し、クローン化するための簡単なアプローチを提示する。このアプローチの利点の1つは、安定したベクターからの中程度の過剰発現を可能にし、染色体積分47の使用から生じる可能性のある予期せぬ課題を回避できることである。このアプローチは、科学的キャリアの様々なレベルでの研究者の採用を奨励する方法で提示され、この出版物の著者の多くは、彼らの教育の構成要素として推定サプレッサーの同定とクローニングを通じて貢献しています。
本研究では、Saccharomycesゲノムデータベースに組み込まれた豊富なデータを使用して...

老化は、最終的に生物死亡の確率を高める無数の生物学的プロセスにおける誠実さの時間依存的喪失である。老化は、すべての種のためにほぼ避けられません。細胞レベルでは、ゲノム不安定性、エピジェネティック変化、プロテオスタシスの喪失、ミトコンドリア機能不全、規制緩和された栄養センシング、細胞老化、およびテロメア消耗11、22など、老化に関連するいくつかの特徴があります。酵母のような単細胞生物では、これは複製電位および年代的寿命33、44の減少をもたらす。これらの細胞変化は、癌、心不全、神経変性、糖尿病、骨粗鬆症55、6、76,を含む病理として、ヒトのようなより複雑な生物に現れる。老化のプロセスを特徴づける多くの複雑さにもかかわらず、広く発散する生物,8、9、109に渡ってこのプロセスの根8底にあるこれらの分子的特徴の保全がある。10老化時にこれらの経路の変化を同定すると、生活習慣の変化によって操作できることが実現した- 食事制限は、多くの生物の寿命を大幅に延ばすことを示している11.これらの経路は、複雑な方法で互いに収束し、交差し、他の多くの経路。これらの相互作用の解明と特徴付けは、寿命と健康寿命を延ばすために治療介入の可能性を提供します12,,13,,14.
老化の分子基盤の保全は、より単純なモデル生物の使用を通じてプロセスの基礎となる遺伝的相互作用の機能的解剖を可能にする - 出芽酵母、サッカロマイセスcerevisiae15、16,16を含む。出芽酵母によってモデル化された老化の2つの確立されたタイプがあります:時系列老化(時系列寿命、CLS)および複製老化(複製寿命、RLS)17。時系列のエージングは、細胞が非分割状態で生き残ることができる時間を測定します。これは、細胞4などG0で人生の大半を過ごす細胞に見られる老化に似ています。あるいは、複製寿命は、細胞が枯渇前に分裂できる回数であり、有糸分裂的に活性な細胞型(例えば、細胞が有することができるドーター細胞の数)18である。
この方法の全体的な目標は 、S.cerevisiaeを使用して老化の遺伝学の機能的解剖を可能にするプロトコルを提示することです。多くの研究者が多くの優れた研究を行い、現在の理解を得ていますが、新進研究者が学業の早い段階から高齢化に貢献する機会は数多く残っています。研究者が老化の分野をさらに進めることを可能にする明確な方法論を提示します。このプロトコルは、独自の新しい仮説を策定し、テストするために必要なツールを提供することにより、彼らの学術的なキャリアの段階に関係なく、すべての研究者のためにアクセスできるように設計されています。私たちのアプローチの利点は、これは、機関に関係なく、すべての研究者が容易にアクセスできる費用対効果の高い方法であるということです - そして、いくつかのプロトコル19に必要な高価な、特殊な機器を必要としません。このタイプのスクリーンを設計する方法はいくつかありますが、この研究で概説されているアプローチは、酵母の等原性野生型株と比較して時系列寿命の著しい減少を示す非本質的遺伝子のヌル突然変異体をスクリーニングするのに特に適しています。
我々の原理証明として、我々はSIR2、リジンデアセチラーゼを過剰発現時に延長および短縮CLSの両方を示すと報告したクローンを作成する。SIR2過剰発現は最近、ワイン造酵母のCLSを増加させることが判明した。しかし、いくつかのグループはSIR2とCLS拡張間のリンクを報告していない、 特徴付けられる20、21,、22の下でその役割を残す 。文献のこれらの矛盾する報告のために、我々は、ある場合、時系列老化におけるSIR2の役割を明確にするために独立した研究を追加するために、この遺伝子を選択しました。さらに、SIR2ホモローグのコピー数を増やすと、線虫モデルシステム23の寿命が延びる。
オートファジーは、細胞内分解系であり、タンパク質やオルガネラなどの細胞質製品をリソソーム24に送達する。オートファジーは、細胞の恒常性を維持するために損傷したタンパク質およびオルガネラを分解する役割を通じて長寿と密接に結びついている。オートファジーの誘導は、多くの遺伝子の発現を調整することに依存し、そしてATG1遺伝子の欠失は出芽酵母26において異常に短いCLSをもたらす。オートファジーおよび細胞質-液胞(真菌リソソーム等価)経路27,28,28における小胞形成に必要なタンパク質セリン/スレオニンキナーゼに対するATG1コード。ここでは、コピー数の増加画面のメソッドを紹介し、野生型のCLSおよびatg1-nullバックグラウンドでSIR2コピーが増加した場合の効果をテストします。この方法は、主に学部の機関の若手研究者や研究グループに特に適しています, その多くは、科学で過小評価され、限られたリソースを持っているコミュニティにサービスを提供しています.

<table><tbody><tr><td>菌類/細菌DNAキット</td><td>Zymo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HindIIIHF酵素</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12123</td><td></td></tr><tr><td>SacII酵素</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td></td></tr><tr><td>サーモン精子DNA</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAM9680</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202S</td><td></td></tr></tbody></table>

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae

老化は、死の確率を高める生物の正常な生物学的プロセスの時間依存性の悪化である。多くの遺伝的要因は、通常の老化プロセスの変化に寄与する。これらの要因は、多くの生物で同定され保存された豊富な文書化されたリンクによって証明されるように、複雑な方法で交差します。これらの研究のほとんどは、多くの遺伝子を同時に迅速にスクリーニングすることを可能にする機能喪失、ヌル突然変異体に焦点を当てています。このプロセスにおける遺伝子の過剰発現の役割を特徴付けすることに焦点を当てた作業ははるかに少ないです。本研究では、多くの遺伝的背景に見られる短命の年代順寿命表現型の抑制に関する研究のために、出芽酵母サッ カロミセス・セレビシエの遺伝子を同定し、クローン化するための簡単な方法論を提示する。このプロトコルは、さまざまな背景から、様々な学問段階で研究者がアクセスできるように設計されています。ヒストンデアセチラーゼをコードする SIR2 遺伝子は、時系列寿命への影響に関する矛盾する報告があったため、pRS315ベクターのクローニングに選択された。 SIR2 はまた、オートファジーにおいて役割を果たし、転写因子 ATG1を含む複数の遺伝子の欠失を介して破壊された場合に生じる。原理の証明として 、SIR2 遺伝子をクローン化し、オートファジー欠損型 atg1Δ 変異体の短寿命表現型特性にサプレッサースクリーンを実行し、それ以外のアイソジェニックで野生型の遺伝的背景と比較する。

加齢時のSIR2の役割に関する矛盾する報告があるので、atg1Δ変異体の短縮CLS表現型26の潜在的な抑制剤としてこの遺伝子を研究に選んだ。SIR2の役割はやや議論の余地があり、CLSを拡張する役割に関する矛盾する報告がありますが、少なくとも1つの酵母バックグラウンドにおけるCLSの増加に明確に関連しており、オート22ファジーと31、32、41,32の両方の役割を果たしています。,41,
プラスミドベクターの私達の選択は、出芽酵母および細菌42の両方における遺伝子操作、伝播、および維持の容易さのために構築されたpRS315シャトルベクターである。このベクターは、LEU2</...

ここでは、 サッカロミセスセレビシエの増加したコピー数サプレッサー画面を介して遺伝的相互作用を識別するためのプロトコルです。この方法により、研究者は短命酵母変異体のサプレッサーを同定、クローン化、および試験することができます。オートファジーヌル変異体における SIR2 のコピー数増加が寿命に及ぼす影響を試験する。

Aging is the time dependent deterioration of an organism&#8217;s normal biological processes that increases the probability of death. Many genetic factors ...

老化は、最終的に生物死亡の確率を増加させる複数の細胞プロセスの時間依存的な悪化によって特徴付けられる。集団内では、このプロセスは可変であり、多くの遺伝的および環境的要因がそれに影響を与える可能性があります。最もよく研究され、理解された変数の一つは、寿命に対する食事の役割です。食事制限は、最終的に老化と加齢に伴う変化の発症を遅らせる介入である。これは、生物の寿命と健康寿命、または生物が正常で健康的な生活を持っている時間の長さを増加させます。我々の現在の理解は、突然変異の蓄積、テロメアの調節緩和、タンパク質ホメロスの喪失、呼吸障害、活性酸素種など、老化の特徴と呼ばれる細胞変化の明確なセットの同定につながっています。今、この理解の多くは、多くの異なるモデル生物を使用する研究から来ています。寿命を短くし、寿命を延ばす遺伝子を同定した多くの遺伝子スクリーンがありました。これには、この方法論の焦点である出芽酵母サッカロミセス・セレビシエの研究や、C.elegansやマウスシステムのようなより複雑な多細胞生物の研究が含まれます。しかし、これらの中で、出芽酵母は、その短い自然寿命と複雑な遺伝的関係を解明することができる遺伝的アプローチの数のために老化研究に特に適しており、老化の遺伝学の機能的解剖のための優れたシステムとなっています。酵母は、老化のいくつかの異なる側面を研究するために利用することができる。そして、私たちは、細胞が生き残ることができる期間である時系列の寿命に焦点を当てます。本研究の目的は、過剰発現抑制画面を実行するための簡単な遺伝的アプローチを提示することにある。時系列寿命が異常に短くなる遺伝的背景を利用します。そして、標的型アプローチを利用して、寿命の短縮表現型を救出または抑制できる遺伝子を同定し、正常な寿命を回復させる遺伝子を同定しようとします。最初の遺伝的背景は、酵母のオートファジー欠乏株である。オートファジーは、ゆるやかに自己食と訳され、細胞内分解システムであり、タンパク質やオルガネラなどの細胞質製品をリソソームに送達します。これは、損傷したタンパク質だけでなく、彼らの人生を超えているものを排除することによって細胞の恒常性を維持するのに役立ちます。ATG1遺伝子の欠失を有する変異株を扱う。細胞質から真空胞への標的経路におけるベシクル形成およびオートファジーに必要なタンパク質セリン/スレオニンタンパク質キナーゼのATG1コード。ATG1ヌル突然変異体は、異常に短い年代順寿命を有する表現型を有する。この老化研究室では、ATG1ヌル変異体の異常に短い寿命特性を救助または抑制できる遺伝的要因を設計し、テストします。しかし、これは他の短命の遺伝的背景にも拡大することができます。このプロセスの最初のステップは、寿命を延ばすためにリンクされている遺伝子を同定することです。私たちは、特に、時系列の寿命を延ばす遺伝子が過剰発現したときに焦点を当てるつもりです。これを行うために、酵母ゲノムデータベースからアクセス可能な一般に公開されているデータを使用します。私たちはここに上がるつもりです。表現型で検索します。そして、途中で、私たちは時系列の寿命を選択できることがわかります。寿命を延ばす遺伝子を探すために、あなたが見ることができるのは、この特定の表現型にリンクされた遺伝子を持つ豊富なデータです。今日、私たちはSIR2、それが過剰に表現されたときに延長時系列寿命にリンクされているヒストンリジンデアセチラーゼを研究します。まず、コード領域のDNA配列と、この遺伝子の両側に隣接する調節領域にアクセスします。400個の塩基対を上流と下流に持ち込み、すべての規制地域を確実に包含します。このDNA配列を用いて、この遺伝子をプラスミドベクターにクローン化できるPCRプライマーを設計します。PCRを用いて遺伝子を増幅し、pRS315ベクターにクローン化します。これを行うために、HindIIIおよびSacII制限サイトを組み込んだ制限消化部位を含むプライマーを設計します。ご覧のとおり、プラスミドには、ヒンドIIIとSacIIの両方の制限サイトが含まれているため、クローニングが容易になります。PCR プライマーは、増幅したい領域に対して約 21 または 22 個の配列を含む配列を含む設計を行う必要があります。配列に加えて、前方プライマーのHindIII、または逆プライマーのSacIIのいずれかの適切な制限部位にそれぞれ赤と紫で示されている5つのプライムエンドに追加し、さらに上流に制限酵素が結合し、より高い効率で制限消化部位を作成することを可能にするいくつかのヌクレオチドを追加します。YPADなどの濃縮培地中でログ後段階に野生型酵母の5ミリリットル培養を一晩成長させる。真菌ゲノム分離に特化した市販キットを使用してゲノムDNAを収穫します。彼らは浸透する非常に剛性とタフな細胞壁を持っているので、キットは、酵母に特異的であることが重要です。ジモリアーゼ処理は、細胞壁を消化するのに有効であり、ゲノム収率を大幅に増加させます。分光光度計を使用して、DNAの量と品質を決定します。クローニングに適したアンプリコンを製造するには、増幅プロセス中の変異を避けるために高忠実性PCRポリメラーゼを利用する必要がある。市販されている多くの異なる忠実度 PCR キットがあります。反応の最適化を容易にするために、複数のバッファリングシステム、標準の高忠実度バッファ、および複雑なアンプリコンの高いGC含有量に最適化されたシステムを提供するキットを選択することをお勧めします。私たちはゲノムDNAの200ナノグラムを追加するつもりです。バッファーの 5 マイクロリットルを追加します。私たちは、フォワードとリバースプライマーの2 1/2マイクロリットルを追加するつもりです。ポリメラーゼ1マイクロリットル、Dの2マイクロリットルを追加します。そして最後に、滅菌蒸留水で50マイクロリットルに対する反応全体をQSに行きます。使用している酵素に固有のプロトコルと、この実験で設計したプライマーに応じて反応を実行します。PCR反応をクリーンアップし、濃縮します。選択培地で一晩大腸菌の5ミリリットル培養を成長させます.ペレットは遠心分離により培養し、上清を捨てる。提供されたカオトロピックバッファー内の細胞を再中断し、5 分間ライスします。反応を中和し、反転によって2つを5〜6回混ぜます。サンプルを最大速度で10分間遠心分離します。上清をシリカカラムに移し、用意されたバッファーで洗浄します。流れを捨て、その間に30秒の遠心を入れて他の適切なバッファーで洗浄を繰り返し、それぞれ後に流れを捨てます。最後に、遠心分離機は残留エタノールを除去し、プラスミドを20マイクロリットル溶出バッファーに溶け出し、分光光度計で量と品質を決定します。今度は、ベクトルとインサートの制限消化を設定する時間です。625ナノグラムのDNA、ベクターまたはインサート、CutSmartバッファーの5マイクロリットル、SacIIの1マイクロリットル、HindIIIの1マイクロリットル、およびQSを水との反応に加え、最終的な反応量を50マイクロリットルにします。制限消化器を37°Cで3時間インキュベートし、続いて80°Cで20分間酵素を加熱して活性化させます。この時点で、次のステップに進む前に、消化器を4度で保存できます。次に、消化されたゲノムフラグメントと、完成したばかりのベクターを使用して15マイクロリットルのライゲーションを設定します。まず、6マイクロリットルの水を加えます。我々は、我々の消化されたベクトルの2マイクロリットルを追加するつもりです。これは私たちのpRS315プラスミドです。私たちは、私たちのインサー2遺伝子の4マイクロリットルを追加するつもりです。私たちはリガーゼバッファの2マイクロリットルを追加するつもりです、ケース10Xバッファ。そして最後に、リガーゼの1マイクロリットルを追加します。これを一晩16度でインキュベートし、摂氏80度で酵素を20分間熱死させるつもりです。私たちの正常に作成されたプラスミドをスクリーニングするために、私たちはそれを大腸菌に変換するつもりです。私たちは、化学的に有能な細胞の50マイクロリットルを使用するつもりです。氷の上で解凍し、解凍するとすぐにライゲーション反応を追加し、内容全体を追加します。そこで、インサートで15マイクロリットルのライゲーションを追加し、15マイクロリットルの無挿入制御を別の反応に追加します。追加したら、チューブを数回フリックして混ぜます。そして、私たちは氷の上でこれをインキュベートするつもりです。氷上での30分間のインキュベーションを完了した後、サンプルを42度の加熱ブロックに追加し、20秒間インキュベートしてヒートショックを受け、そこでそれらを取り出し、回収メディアを追加します。ヒートショックの後、我々は回復期間を許可するつもりです。私たちはサンプルを採取し、450マイクロリットルのSOCメディアを追加します。我々は、プラスミドを拾うことを可能にし、アンピシリン耐性遺伝子が発現し始めるために、摂氏37度でこれらをインキュベートします。これらのサンプルは37度で45分間回復します。そのインキュベーションの後、私たちは一連の希釈物、1〜10、および1〜100を設定し、LB / Ampメディアにこれらをプレートし、細胞が一晩で成長できるようにするつもりです。滅菌技術を使用してプレートを打ち上げします。適切なプレートを取ります, 我々はそれに従ってラベル付けし、私たちの選択可能なマーカーが含まれています.私たちは、私たちの変換された大腸菌の150マイクロリットルを取ります。滅菌接種ループを使用して、プレート全体と全体に細胞を穏やかに広げるので、素敵な均等な分布を得ます。すべての希釈液のめっきを終えたら、これらのプレートを摂氏37度で一晩インキュベートして、何が成長するかを確認します。約1日後、私たちが作ろうとしていたプラスミドを含むコロニーが成長しているのを見るべきです。彼らはこのようなものに見えるはずです。滅菌技術を使用して、前に概説された手順に従って5ミリリットルLBプラスアンピシリンにあなたの変換から成長した潜在的な形質転換体を接種する。プラスミドをあらゆる潜在的な変換剤から分離し、前述のように制限消化を実行します。アガロースゲル上で反応生成物を実行し、潜在的な形質転換体を空のベクターと比較します。さらに研究するために、適切なサイズの挿入物の切除につながる変換剤を保存します。プラスミドの作成に成功したので、ATG1ヌル酵母の背景に変換します。私たちは15ミルの細胞を取るつもりです、そして、私はすでにここでやったそれらをペレットするつもりです。ペレット化した後、成長していたYPAD培地を取り除き、蒸留水で細胞を洗います。その後、細胞を取り、100ミリモル酢酸リチウムで再中断するつもりです。私たちは、その200マイクロリットルでそれらを再中断するつもりです。上下に穏やかなピペットを使用して細胞ペレットを再懸濁します。このミックスを変換ごとに 50 マイクロリットルを使用して、実行する変換のそれぞれについて、セルを別々のマイクロフュージ チューブに分割します。変換のそれぞれに、50%PEGの240マイクロリットルを追加する必要があります。PEGは非常に粘性、ピペットであり、非常に慎重に測定します。PEGの添加後および追加の各成分の後にピペットによって混合する。次に、酢酸大臼歯リチウム36マイクロリットル、5マイクロリットルのサケ精子DNA、または他のキャリアDNAを加え、5分間沸騰して氷の上に置き、最後に各変換のためにプラスミドの5マイクロリットルを加えます。各チューブを完全に渦を混ぜ合わせます。摂氏30度でサンプルを45分間インキュベートします。42°10分間熱ショックを受け、滅菌水で細胞を一度洗い、最終的に200マイクロリットルの無菌水で再懸濁します。SCマイナスロイプレートに酵母とプレート150マイクロリットルの形質転換株のそれぞれ1〜10〜100の希釈液を設定し、プラスミドを選択します。細胞を均一に均等に広げ、プレートを30度で反転してインキュベートする前に乾燥させ、48〜72時間成長させます。遺伝子のクローンを正常にクローン化してテストしたら、生物の時系列寿命への影響をテストします。我々は、時間の関数として残っている実行可能なコロニー形成ユニットの数を監視し、酵母を成長させます。SCからロイシンを差し引いた液体培地で酵母を摂氏30度で最初に72時間成長させます。血球計を使用して、500個の細胞をプレートするために必要な希釈を決定します。滅菌技術を使用して、細胞をSCマイナスleuプレートにプレートし、摂氏30度で3日間逆に乾燥させてインキュベートできるようにし、その時点で成長し、コロニーの成長をスコアリングし、その時点を記録することができます。プレートを作った後、振ることなく摂氏30度で酵母をインキュベートし続けます。当初は、毎週の間隔でめっきを繰り返し、予備的なデータが老化表現型の抑制を示唆する場合は、より頻繁な時点を取ります。生存率を決定するために、分析のために1日の1つのタイムポイントに正規化します。すべての間隔で同じ希釈液をプレートしてください。コロニーが成長しなくなるまで、このプロセスを続行します。Excel スプレッドシートに情報を入力すると便利です。これにより、実験の終了時に各菌株の生存率をすばやく判断できます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

酵母の老化時系列は定常期での時間に関連付けられている細胞の生存率の損失を指します。ここでは、定量的に酵母系列寿命を決定するためのハイスループット法を説明します。...

高齢者の細胞の伸長によって酵母年表寿命の定量化

ここでは、エージング中規制またはゲノムDNAの不安定性に寄与する遺伝子/経路を研究するために酵母の時系列の寿命モデルと組み合わせることができるDNAの突然変異試験のセットを説明します。...

使用年齢に依存するゲノム不安定性を研究して S.出芽酵母時系列寿命モデル

変動試験により測定された若いサッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞における突然変異率が異なる複製年齢の母細胞のための突然変異頻度を予測するために使用される。磁気ソーティングフローサイトメトリー予測さ突然変異周波数からの逸脱を識別するために、実際の突然変異頻度及び母細胞の年齢を測定するために使用される。...

母細胞と変動試験の磁気ソーティングを組み合わせることでの有糸分裂細胞老化中に、ゲノム不安定性を分析するためにサッカロマイセス·セレビシエ

酵母分裂簡便なサプレッサー スクリーンのプロトコルを提案します。この方法は、効率的な変異原無料、頻繁に単一の genomic 位置で起こる突然変異の選択です。...

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

細菌病原体は、重要な生物学的プロセスを標的とする宿主にタンパク質を分泌する。細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を同定することは、分子病因に対処する鍵となる。ここで、毒性細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を解明するために改変酵母サプレッサーおよび毒性スクリーンを用いる方法について説明する。...

酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いた細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路の同定

この研究は、 シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー遺伝子スクリーニングのプロトコルについて説明しています。このスクリーニングでは、ゲノムワイドなプラスミドライブラリを使用して、クエリ変異株に関連する機能喪失表現型のサプレッサークローンを特定します。 ell1...

シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー同定のための遺伝子スクリーニング

我々は遺伝的にウスチラゴがmaydisスマット菌を操作する堅牢な遺伝子置換戦略を説明します。このプロトコルは、感染症の表現型を調べるために、欠失変異体を生成する方法について説明します。蛍光タンパク質タグをコードする配列を付加することによって、 例えば 、任意の所望の方法で遺伝子を修正するために拡張することができます。...

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

ここでは、RNA シーケンスを使用して酵母細胞の低酸素応答中に時間をかけての mRNA...

S の酵母酵母の低酸素応答中に時間をかけての mRNA のレベルを測定

小さいヘアピン RNA (shRNA) とホタルのルシフェラーゼとマウス細胞における x 染色体不活性化のレギュレータを識別するの次世代シーケンス ベースのプロトコルについて報告して、メチル CpG 結合蛋白質 2 (hygromycin 抵抗性遺伝子融合MeCP2)不活性 X...

プールされた shRNA MeCP2 再アクティブ化非アクティブ X 染色体上の画面

学ぶサッカロミセス・セレビシエにおけるサプレッサースクリーンによる寿命調節遺伝子の同定法。SIR2遺伝子の過剰発現効果を評価し、老化メカニズムの解明に役立つ実験手法を習得できます。

サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン

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