フローサイトメトリーと養子移植による腫瘍浸潤性骨髄細胞の機能解析

サマリー

このプロトコルは、マウスの皮内または皮下腫瘍モデルにおける固形腫瘍の解離および骨髄細胞の単離の信頼性の高い方法を提供します。フローサイトメトリーは、腫瘍微小環境内の不均一な骨髄系集団の表現型の特徴付けを可能にし、ソーティングは養子移植の文脈でそれらの機能を実証します。

要約

腫瘍浸潤性骨髄細胞コンパートメントは、腫瘍がその増殖を支援するために利用してきた広範な免疫抑制細胞の不均一な集団を表しています。腫瘍および二次リンパ組織へのそれらの蓄積は、抗腫瘍免疫応答の抑制につながるため、治療介入の標的です。局所的なサイトカイン環境が腫瘍浸潤性骨髄細胞の機能プログラミングを決定できることが知られているため、腫瘍微小環境(TME)を操作して、抗腫瘍骨髄細胞活性をより助長するサイトカインランドスケープを発現する戦略が考案されています。腫瘍浸潤性骨髄細胞の治療誘発性変化を評価するために、この論文では、白血球の回復に備えて固形担がんマウスから皮内/皮下腫瘍組織を解離する手順を概説します。フローサイトメトリー解析の戦略は、単離された白血球内の不均一な骨髄集団の同定と、ユニークな骨髄表現型の特性評価を可能にするために提供されます。最後に、この論文では、機能アッセイのために生存可能な骨髄細胞を精製し、養子縁組の文脈でそれらの治療的価値を決定する方法について説明します。

概要

腫瘍微小環境(TME)は、急速に増殖する腫瘍細胞と周囲の不均一な間質細胞コンパートメントで構成されています。成長中の腫瘍は血管新生が不十分な場合が多いため、TMEは低酸素症、栄養欠乏、およびアシドーシス1を特徴とする独自の末梢部位^です。この状況で生き残るために、腫瘍のストレス応答と代謝のリプログラミングは、組織のリモデリングと血管新生を促進する可溶性因子の分泌と、免疫細胞の選択的動員をもたらします²。骨髄細胞はTMEで最も豊富な造血細胞の1つであるため、TMEにおける腫瘍浸潤性骨髄細胞の役割を調べることへの関心が高まっています。

骨髄系細胞は、単球、マクロファージ、樹状細胞、顆粒球などの自然免疫細胞の不均一で可在なグループです。それらは組織の恒常性維持と適応免疫応答調節に重要な役割を果たしていますが、その機能は局所微小環境内の活性化シグナルの構成によっては分極する可能性があります³。腫瘍は、TME内の可溶性因子の分泌を通じて骨髄細胞の特性を利用します。これらの代替シグナルは、骨髄造成を未熟な分化に向け、既存の腫瘍浸潤性骨髄細胞の機能を歪める可能性があります³。実際、TME内の骨髄細胞は、がんの進行を促進し、抗腫瘍免疫応答....

プロトコル

注:すべての動物実験は、カナダ動物管理評議会のガイドラインに準拠し、マクマスター大学の動物研究倫理委員会によって承認されました。

1. 腫瘍の採取と解離

1. Nguyenらによって記載されたように、6〜8週齢の雌、C57BL / 6マウスに皮内/皮下×2^{10 5} B16メラノーマ細胞を接種します。
2. 子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させますが、その際に腫瘍を破壊しないように注意してください。収穫する前に、マウスに70%エタノールをスプレーします。
3. メスとハサミを使用して、周囲の組織(付着した腫瘍排出リンパ節を含む)から皮内/皮下腫瘍を外科的に切除し、腫瘍を事前に計量したマイクロチューブに入れます。氷の上を保ってください。
   注:腫瘍採取は、動物用バイオセーフティキャビネットで行ってください。より大きな腫瘍には15mLの円錐形チューブを使用してください。
4. 腫瘍の重量を量り、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPMI-1640培地500μLを各チューブに加え、ハサミを使用して腫瘍をチューブ内または6ウェルプレートで小さく切断します。
   注:腫瘍片は、消化培地が追加された後に電動ピペッターで混合できるほど小さくなければなりません。
....

結果

この結果は、この方法が固形マウス腫瘍から骨髄系細胞を高収率で生成することを示しています。受容体の完全性と細胞生存率の維持により、目的の骨髄サブセットの信頼性の高い機能解析が容易になります。骨髄細胞単離のこれらの改善により、養子T細胞療法中にクラスIヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(HDACi)であるMS-275でTMEを正常化すると、腫瘍内骨髄細胞の変化する機能を識別することができました。TIL単離プロトコルは、通常、骨髄細胞の収量を最大化するためのステップを踏まない⁹。その結果、酵素分解は通常、過酷すぎてサンプルの生存率が失われます。処理済みのB16黒色腫腫瘍をコラゲナーゼI型で1時間(一般的に使用される状態)治療した後、磁気選択によりCD45.2⁺細胞を正に濃縮すると、形態(前方散乱領域(FSC-A)対側散乱領域(SSC-A))および骨髄細胞のサブゲート(CD11b対CD11c)は、骨髄系細胞(CD11b⁺またはCD11c⁺)および非骨髄系細胞(CD11b-CD11c^-

ディスカッション

腫瘍浸潤性骨髄細胞は、腫瘍内でさまざまな活性化および分化状態で存在するが、腫瘍関連DC(TADC)、腫瘍関連好中球(TAN)、骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)、および腫瘍関連マクロファージ(TAM)など、いくつかのサブセットが同定されている¹²。残念ながら、これらの骨髄系細胞サブセットを同定するために使用される細胞表面マーカーの発現が重複しているため、腫瘍骨髄細胞を他の骨髄細胞から表現型的に区別することは現在困難である¹³。同様に、腫瘍浸潤性骨髄細胞における治療誘発性の表現型の変化は、既存の骨髄性抗体染色パネルでは容易に観察できない場合があります。まとめると、ユニークな表面マーカーの不足は、骨髄細胞生物学の理解を複雑にしています。天然の骨髄細胞、腫瘍細胞、および治療の影響を受けた骨髄細胞を描写するためには、骨髄細胞サブセットの評価は、その表現型の特徴に加えて、その機能に従って行う必要があります。

腫瘍組織を回収し解離.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 700 Mouse Anti-Mouse CD45.2	BD Biosciences	560693	1:100
APC-Cy7 マウス 抗マウス NK-1.1	BD Biosciences	560618	1:100
ビオチン マウス 抗マウス CD45.2	BD Biosciences 553771
BV421 ハムスター 抗マウス CD11c	BD Biosciences	562782	1:100
BV650 ラット 抗マウス F4/80	BDBiosciences	743282	1:100
BV711 ラット抗マウス CD8a	BD Biosciences	563046	1:100
コラゲナーゼ、IV型、粉末	Gibco	17104019
DNase I	Roche	10104159001
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18970
EasySep Mouse CD11c Positive Selection Kit II	Stemcell technologies	18780
EasySep Release Mouse Biotin Positive Selection Kit	Stemcell technologies	17655
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6C	BD Biosciences		553104 1:100
Fixable Viability Stain 510	BD Biosciences	564406	1:1000
Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Cytofix/Cytoperm)	BD Biosciences
PE Rat Anti-CD11b	BD Biosciences	557397	1:100
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	552775	1:100
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse Ly-6G	BD Biosciences	560602	1:100
Perm/Wash (BD Perm/Wash)	BD Biosciences	554723
精製ラット抗マウス CD16/CD32 (マウス BD fc ブロック)	BD Biosciences	553141
iNOS モノクローナル抗体 (CXNFT), APC	Thermo Fisher	17-5920-82	1:100
ヒト/マウス アルギナーゼ 1/ARG1 フルオレセイン標識抗体	R&Dシステム	ズIC5868F	1:100

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