Name: Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学ぶ2色単分子蛍光in situハイブリダイゼーション法で大腸菌のmRNA転写速度と分解動態を同時測定する技術。48サンプルを8時間で処理可能で、遺伝子発現の時間変動を単細胞レベルで解析できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロトコルは、ハワード・ヒューズ医学研究所とイェール大学微生物科学研究所のクリスティーン・ジェイコブス・ワーグナー博士の研究室での博士研究員の間にS.K.によって開発されました。ジェイコブス・ワーグナー博士と研究室のメンバーに対し、メソッド開発中の様々なインプットと、原稿の批判的な読み取りについてローラ・トロイヤーに感謝します。S.K.はサール・スカラーズ・プログラムからの支援を認める。K.V.は、イリノイ大学のジェームズ・スカラー・プレブル・リサーチ・アワードの支援を認めています。

<ol><li>Bervoets, I., Charlier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+versatility+and+complexity+of+bacterial+gene+regulation+mechanisms%3A+opportunities+and+drawbacks+for+applications+in+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diversity, versatility and complexity of bacterial gene regulation mechanisms: opportunities and drawbacks for applications in synthetic biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 304-339 (2019).</li>
<li>Epshtein, V., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+RNA+polymerase+molecules+in+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cooperation between RNA polymerase molecules in transcription elongation.</a> Science. 300 (5620), 801-805 (2003).</li>
<li>Vogel, U., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+chain+elongation+rate+in+Escherichia+coli+depends+on+the+growth+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The RNA chain elongation rate in Escherichia coli depends on the growth rate.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 2807-2813 (1994).</li>
<li>Tennyson, C. N., Klamut, H. J., Worton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+dystrophin+gene+requires+16+hours+to+be+transcribed+and+is+cotranscriptionally+spliced%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is cotranscriptionally spliced.</a> Nature Genetics. 9, 184(1995).</li>
<li>Singh, J., Padgett, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+in+situ+transcription+and+splicing+in+large+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rates of in situ transcription and splicing in large human genes.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16, 1128(2009).</li>
<li>Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+RNA+Half-Life+Analysis+in+Escherichia+coli+Reveals+Positional+Patterns+of+Transcript+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation.</a> Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).</li>
<li>Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. -H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+decay+and+abundance+in+Escherichia+coli+at+single-gene+resolution+using+two-color+fluorescent+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).</li>
<li>Pérez-Ortín, J. E., Medina, D. A., Chávez, S., Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+do+you+mean+by+transcription+rate%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">What do you mean by transcription rate.</a> BioEssays. 35 (12), 1056-1062 (2013).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Kuchina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+single-cell+RNA+sequencing+by+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding.</a> BioRxiv. , 869248(2019).</li>
<li>Blattman, S. B., Jiang, W., Oikonomou, P., Tavazoie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotic+single-cell+RNA+sequencing+by+in+situ+combinatorial+indexing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Prokaryotic single-cell RNA sequencing by in situ combinatorial indexing.</a> Nature Microbiology. , (2020).</li>
<li>Femino, A., Fay, F., Fogarty, K., Singer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).</li>
<li>Montero Llopis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466 (7302), 77-81 (2010).</li>
<li>So, L. -h, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+properties+of+transcriptional+time+series+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">General properties of transcriptional time series in Escherichia coli.</a> Nature Genetics. 43 (6), 554-560 (2011).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Jones, D. L., Brewster, R. C., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+architecture+dictates+cell-to-cell+variability+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoter architecture dictates cell-to-cell variability in gene expression.</a> Science. 346 (6216), 1533-1536 (2014).</li>
<li>Iyer, S., Park, B. R., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitative+measurement+of+transcriptional+kinetic+parameters+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitative measurement of transcriptional kinetic parameters in vivo.</a> Nucleic Acids Research. 44 (18), 142(2016).</li>
<li>Kim, S., Beltran, B., Irnov, I., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Distance+Cooperative+and+Antagonistic+RNA+Polymerase+Dynamics+via+DNA+Supercoiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Distance Cooperative and Antagonistic RNA Polymerase Dynamics via DNA Supercoiling.</a> Cell. 179 (1), 106-119 (2019).</li>
<li>Wang, M., Zhang, J., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+transcription+at+a+single+gene+copy+reveals+hidden+drivers+of+bacterial+individuality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Measuring transcription at a single gene copy reveals hidden drivers of bacterial individuality.</a> Nature Microbiology. 4 (12), 2118-2127 (2019).</li>
<li>Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJoo%2C+C+%22Labeling+DNA+%28or+RNA%29+for+single-molecule+FRET%22">Labeling DNA (or RNA) for single-molecule FRET</a>. 2012 (9), Cold Spring Harbor. 1005-1008 (2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Standard+Ethanol+Precipitation+of+DNA+in+Microcentrifuge+Tubes%22">Standard Ethanol Precipitation of DNA in Microcentrifuge Tubes</a>. 2006 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 4456(2006).</li>
<li>Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li>
<li>Adesnik, M., Levinthal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synthesis+and+degradation+of+lactose+operon+messenger+RNA+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The synthesis and degradation of lactose operon messenger RNA in E. coli.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 35, 451-459 (1970).</li>
<li>Campbell, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+for+rifampicin+inhibition+of+bacterial+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase.</a> Cell. 104 (6), 901-912 (2001).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaj%2C+A+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Walter, N. G. 472, Academic Press. 365-386 (2010).</li>
<li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput%2C+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Molecular Microbiology. 80 (3), 612-627 (2011).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Molecular Microbiology. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoffitt%2C+JR+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Filonov, G. S., Jaffrey, S. R. 572, Academic Press. 1-49 (2016).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+gene+expression+in+live+cells%2C+one+protein+molecule+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time.</a> Science. 311 (5767), 1600-1603 (2006).</li>
<li>Chen, H., Shiroguchi, K., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+study+of+mRNA+degradation+and+transcript+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide study of mRNA degradation and transcript elongation in Escherichia coli.</a> Molecular Systems Biology. 11 (1), 781(2015).</li>
<li>Vogel, U., Sørensen, M., Pedersen, S., Jensen, K. F., Kilstrup, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreasing+transcription+elongation+rate+in+Escherichia+Coli+exposed+to+amino+acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decreasing transcription elongation rate in Escherichia Coli exposed to amino acid starvation.</a> Molecular Microbiology. 6 (15), 2191-2200 (1992).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+translation+contribute+to+gene+locus+relocation+to+the+nucleoid+periphery+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription and translation contribute to gene locus relocation to the nucleoid periphery in E. coli.</a> Nature Communications. 10 (1), 5131(2019).</li>
<li>Zenklusen, D., Larson, D. R., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-RNA+counting+reveals+alternative+modes+of+gene+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-RNA counting reveals alternative modes of gene expression in yeast.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (12), 1263-1271 (2008).</li>
<li>Fontenete, S., Guimarães, N., Wengel, J., Azevedo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+melting+temperatures+in+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+procedures+using+thermodynamic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of melting temperatures in fluorescence in situ hybridization (FISH) procedures using thermodynamic models.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (3), 566-577 (2016).</li>
<li>Sepúlveda, L. A., Xu, H., Zhang, J., Wang, M., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+gene+regulation+in+individual+cells+reveals+rapid+switching+between+promoter+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of gene regulation in individual cells reveals rapid switching between promoter states.</a> Science. 351 (6278), 1218-1222 (2016).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+shapes+the+turnover+of+a+bacterial+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome.</a> eLife. 5, 13065(2016).</li>
<li>Fei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+in+vivo+target+search+kinetics+of+regulatory+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA.</a> Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ここでは、大腸菌のmRNA運動を測定するためのsmFISHプロトコルを発表しました。以前に公開された細菌23のsmFISHプロトコルでは、細胞は、イメージングの準備ができるまで、プロトコルの最後までチューブに保持されていました。カバースリップ表面23上の蛍光プローブの非特異的結合の最小など多くの利点を有するが、時間経過実験から多くのサンプルがある場合には、これらのプロトコルに従うことは困難である。まず、比較的大量の細胞 (>1 mL) をサンプリングし、固定前に収穫する必要があります。第二に、細胞サンプルは、溶液を交換し、ハイブリダイゼーションステップ後に洗浄するために複数回遠心分離する必要があります。我々のプロトコルでは、培養液の小さな容積(<1 mL)が1.5mLチューブの固定溶液と直接混合され、サンプリングの瞬間に細胞状態を素早く「凍結」するのに役立ちます。また、細胞は手順全体を通して表面に付着したままで、異なる溶液は、真空ろ過システムで液体を吸引し、マルチチャネルピペットで一度に溶液滴を適用することによって迅速に交換することができます。この違いは、多数のサンプルを一度に処理する必要がある場合に、プロトコルを非常に有利にします。プロトコルを使用すると、12~48個のサンプルを同時に処理でき、FISHの手順全体を約8時間以内に完了できます(図2)。例として大腸菌におけるlacZの発現を例に用いたが、このプロトコルは、以下に考察する様々な遺伝子および細菌種に広く適用可能である。
異なる遺伝子については、最初に考慮すべき事項はsmFISHプローブです。1つは、目的のmRNAをタイルするオリゴヌクレオチドプローブを設計してもよい(図1A)13.この「タイリング」プローブアプローチでは、各プローブは~20塩基長であり、5'または3'末流部で蛍光色素で標識される。この戦略は、遺伝子操作が必要とされていないので便利です。あるいは、タンデム反復~20bp配列は、ゲノム配列に対して異質(例えば、コーロバクター三日月14日のlacO配列)、目的の遺伝子の非翻訳領域に挿入され、かつ、反復単位に相補的な単一のプローブがmRNA(「配列」アプローチ)に標識するために使用される。図1B)。いずれの場合も、複数の蛍光体がmRNAを飾り、細胞内に非特異的に結合した単一のプローブから容易に分化できる増幅蛍光シグナルを与える。
「タイル」または「アレイ」アプローチを選択するかどうかは、陰性制御に依存し、プローブの非特異的結合が標的mRNAを欠いているために試験されるサンプルである。タイリングプローブ(図1A)の場合、対象遺伝子または条件のない変異株は、遺伝子が転写されない(例えば 、lacZの抑制)プローブの非特異的結合を試験するための陰性制御として機能し得る。アレイベースのsmFISH(図1B)では、プローブの結合部位が含まれていないため、アレイを欠いた野生型のひずみは負のコントロールとして機能します。
最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブ配列、さらにはフルオロフォア色素の選択に依存する可能性があります。37°Cのハイブリダイゼーション温度を保ち、ハイブリダイゼーション液中のプローブセットとフォルミドの異なる濃度をテストすることで、lacZプローブセットのハイブリダイゼーション条件を最適化しました。より高濃度のホルムアミドは、非特異的および特異的結合の両方を減少させる傾向がある26,,35.ハイブリダイゼーション時間と温度を同じに保ちながら、ハイブリダイゼーションとその洗浄条件を体系的に変更することをおすすめします。条件がより厳しくなるにつれて、非特異的および特異的結合の両方が減少する(図6)。非特異的結合が許容可能なしきい値を下回り始めるポイントを見つけることが重要です。たとえば、プローブなしで得られた信号レベル(「プローブなし」)をしきい値として使用しました(図6)。
mRNAの2つの別個の領域を標識する2色smFISH法は、長い遺伝子に限定される。転写伸びの速度を測定するために 、lacZ が長く(3075 bp)であり、その発現がIPTGによって誘導され得るという事実を利用した。遺伝子が短いとき、2つのタイリングプローブセット(5'と3'の端の近く)を設計し、5' と 3' mRNA 領域の出現の間の時間遅延を解決することは困難です。この場合、smFISHによって安定状態で新生mRNAを数え、転写率がフィッティングパラメータ20としてある解析モデルを用いて分布を分析することができる。また、目的の遺伝子が誘導できない場合、リフィンピシンを有する細胞を時間0で治療し、5'および3'mRNAサブ領域の時間変化を測定することができる。5'mRNAシグナルの減少から3'mRNAシグナルのそれへの遅延は、次いで、31以前に行われた転写伸びの速度を計算するために使用することができる。
最後に、smFISHプロトコルは汎用性があり、他のラベリングスキームと組み合わせることができます。以前は、DNAの遺伝子座をmRNA FISHとDNA FISH14または蛍光レポーターオペレータシステム20と組み合わせることにより、mRNAと共に可視化した。タンパク質産物は、mRNA FISH14,36,36と共に免疫蛍光を行うことによって可視化され得る。また、3次元超解像顕微鏡37と組み合わせることで、3次元38、39の全ての3次元でmRNAを可視化することができる。39

DNAからmRNAおよびタンパク質への遺伝情報の流れは、細胞の適合性にとってその調節が重要である最も基本的な細胞プロセスの1つである。細胞内のmRNAの数は、2つの動的プロセス、転写、およびmRNA分解によって決定されます。しかし、単一の細胞の時間と空間における転写およびmRNA分解がどのように調節されているかは、主に生体内でのそれらの動力学を定量的に測定する実験方法の不足のために、完全には理解されていない。
ノーザンブロット、RT-PCR、RNAシーケンシング、遺伝子発現マイクロアレイなどの細胞集団から抽出された総mRNAに基づく方法は、mRNAレベルの相対的な差を測定することができ、転写伸長率2、3、4、53,4,5またはmRNA分解率66、77を分析するために広く使用されている。しかし、それらは細胞あたりのmRNAの絶対数を提供しない、したがって、彼らは転写開始率8を調査するのに適していない。また、mRNAは細胞集団から抽出されるため、単一細胞内のmRNAの空間分布や細胞間のmRNAコピー数の変動性を測定することはできません。
個々の細胞に対する次世代RNAシーケンシング(scRNAEq)は、ゲノムスケール9における細胞当たりのmRNA数を定量することができる。しかし、サンプル調製と高コストの課題により、転写動態を測定するためにこの技術を使用することは依然として困難です。特に、細菌へのscRNAEqの適用は、mRNAの存在量が低い10,11,11のために技術的に困難であった。
この場合の一分子蛍光は、その蛍光標識された一本鎖プローブのハイブリダイゼーションに基づいており、その配列は目的とする標的mRNA12,13,13と相補的である。配列特異的ハイブリダイゼーションの概念は、ノーザンブロットまたはRT-PCRで使用される概念と同様であるが、mRNAのネイティブな局在を維持するために、ハイブリッド化は固定細胞内のその時点で行われる。単一mRNAのシグナルは、多くのプローブを用いて増幅され、〜20ヌクレオチド(nt)長さ、mRNAの異なる部分にハイブリダイズする(図1A)13。13この「タイリング」プローブアプローチでは、単一のmRNAを検出するために必要なプローブの数は、アッセイできるmRNAの長さに下限を設定します。あるいは、目的のmRNAは、タンデムLacオペレータ配列の非コード配列に転写的に融合していてもよいし、蛍光標識されたlacOプローブの複数のコピーが単一のmRNAにハイブリダイズするように(図1B)14。14
smFISHは、定常状態(すなわち、合成と崩壊のバランスが取れている場合)における細胞当たりのmRNA数を定量化し、細菌細胞15、16、17,16,17の間でmRNAの平均および変動性を分析するために使用されてきた。近年、smFISHは、大腸菌18、19、20,19,20における遺伝子発現の誘導または抑制直後に、非定常状態でのmRNA数の定量化に適用されている。その後、絶対mRNAコピー数の時間変化を使用して、転写開始率、伸長率、および終了率、ならびにmRNA分解率を計算した。このアプリケーションでは、従来のsmFISH手順は、多くのサンプルがあり、それぞれが1つの時点を表し、複数のバッファ交換ステップ(すなわち、遠心分離および洗浄)を経る必要があるため、煩雑な場合があります。ここでは、細胞をカバースリップの表面に付着させ、真空ろ過システム14,19,19で液体を吸引することによりサンプル処理工程が劇的に単純化されるsmFISHプロトコルについて説明する。大腸菌におけるlacZの発現を例として、画像解析(図3)を含む完全なワークフロー(図2)が、転写(開始、伸長、および終了)およびmRNA分解のインビボ運動を生み出す、mRNA発現における細胞間変動性、およびmRNA局在化を含む、完全なワークフロー(図2)を示す。このプロトコルは、生体内運動学のプローブや、様々な細菌種における他のmRNAの局在化に広く適用可能であることを期待しています。

<table><tbody><tr><td>Bacterial strain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MG1655</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, peptides, and others</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td>UPLC buffer B</td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Fisher Chemical</td><td>A661-500</td><td>M9培地を作るには</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td>プローブハイブリダイゼーション</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Acros Organics</td><td>349610250</td><td>M9培地を作るには</td></tr><tr><td>カサミノ酸</td><td>BD Difco</td><td>223050</td><td>M9培地を作るには</td></tr><tr><td>Cy3B NHSエステル</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>PA63101</td><td>FISHプローブ用フルオロフォア</td></tr><tr><td>Cy5 NHSエステル</td><td>GEヘルスケアライフ科学</td><td>PA15101</td><td>FISHプローブ用蛍光色素</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸塩</td><td>ミリポア</td><td>S4030</td><td>プローブハイブリダイゼーション</td></tr><tr><td>デキストロース</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>D16</td> lacZジメチルスルホキシド(DMSO)<td>の発現を抑制するために</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>蛍光色素を溶解するには</td></tr><tr><td>大腸菌tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td>プローブ ハイブリダイゼーション</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デコン ラボラトリ</td>ーズ <td>2701</td><td>DNA 精製、溶解、およびクリーニング カバースリップに使用</td></tr><tr><td>FISH プローブ</td><td>バイオサーチ テクノロジー</td><td></td><td>配列は ref#16</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Ladd Research Industries</td><td>20295</td><td>Fixation</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bio</td><td>AB00600</td> <td>に掲載されていますプローブハイブリダイゼーション、プレハイブリダイゼーション、および洗浄</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Americanbio</td><td>AB00751-01000</td><td>M9培地を作るには</td></tr><tr><td>イソプロピルチオ-&β;-ガラクトシド (IPTG)</td><td>Invitrogen</td><td>15529019</td><td>lacZ 誘導</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>M65-500</td><td>M9 培地を作るには</td></tr><tr><td>2-ニトロフェニル &β;-D-フコピラノシド (ONPF)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-216258</td><td>lacZ repression</td></tr><tr><td>Picodent twinsil 22</td><td>Picodent</td><td>1300 1000</td><td>シーラント</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>カバースリップ表面を処理するには</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP362-500</td><td>PBS と M9 媒体を作るには</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>転写開始を止めるために</td></tr><tr><td>生理食塩水-クエン酸ナトリウム緩衝液(SSC)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9763</td><td>プローブハイブリダイゼーション、プレハイブリダイゼーション、および洗浄</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP328-500</td><td>蛍光色素プローブ結合</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>DNA精製用、PBSおよびM9中</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>PBSおよびM9中</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム単塩基性</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP329-500</td><td>リン酸ナトリウム緩衝液を作るには</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>Invitrogen</td><td>8899</td><td>カバースリップ用疎水性マーカー</td></tr><tr><td>TetraSpek microspheres</td><td>Invitrogen</td><td>T7280</td><td>Controls forマルチチャンネル登録</td></tr><tr><td>チアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>M9 中</td></tr>酢<tr><td>酸トリエチルアンモニウム</td>を作るには <td>Sigma-Aldrich</td><td>90358</td><td>UPLC バッファー A</td></tr><tr><td>バナジル リボヌクレオシド錯体 (VRC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>94742</td><td>プローブ ハイブリダイゼーションとプレハイブリダイゼーション</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18カラム</td><td>Waters</td><td>Acquity BEH C18 カラム</td><td></td></tr><tr><td>カウンタートップ遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>カウンタートップインキュベーター</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer F1.5</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター(オーブン)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030514</td><td>Gravity convection</td></tr><tr><td>Water purification system</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Reference</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td></td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>ビルディング</td><td></td><td>カバースリップやスライドガラスのブロー乾燥用</td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC システム</td><td></td></tr><tr><td>真空・吸引器</td><td>ビルディング</td><td></td><td>吸引器は、サイドアーム付きのろ過フラスコでできています。</td></tr><tr><td>真空濃縮器</td><td>Labconco</td><td>7810010</td><td>Centrivap;UPLCから採取したサンプルを乾燥させます。</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>Genie-2 SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバスシェーカー</td><td>ニューブランズウィック</td><td>イノーバ 3100</td><td>タイムコース実験に重要</td></tr><tr><td>ウォーターバスソニケーター</td><td>VWR</td><td>97043-960</td><td>カバースリップとスライドガラスをきれいにするには</td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mLチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>DNAローバインドチューブ</td></tr><tr><td>1000-uLピペットチップボックス</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>P1126</td>すべての<td>チップを使用した後の空のボックス</td></tr><tr><td>Coplin</td><td>ジャーSPI</td><td>01240-AB</td><td>カバースリップとスライドガラスをきれいにするにはカバー</td></tr><tr><td>スリップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-050-230</td><td>24x60 No1</td></tr><tr><td>フィルター付きピペットチップデン</td><td>ビルサイエンティフィック</td><td>P1121、P1122、P1126</td>シャープ<td>&reg;精密バリアチップ</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>SPI</td><td>K35a</td><td>清潔なカバースリップやスライドガラスの取り扱いに</td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>グローブ</td><td>マイクロフレックス</td><td>MK-296-M</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペッター</td><td>エッペンドルフ</td><td>2231300045</td><td>洗浄ステップ</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>ギルソン</td><td>P1000, P200, P20</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー</td><td>MTC Bio</td><td>P8025-1S</td><td>洗浄ステップで使用する</td></tr> <tr><td>シリンジフィルター (0.22 um)</td><td>ミリポア</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェアとアルゴリズム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013 およびそれ以上</td><td>https://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>MicrobeTracker または Oufti</td><td></td><td></td><td>https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker</td></tr><tr><td colspan="4">https://oufti.org/</td></tr> <tr><td>Stellaris Probe Designer</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designerMicroscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD カメラ</td><td>浜松Photonics</td><td>Orca-II-ER</td><td></td></tr><tr><td>Cy3フィルターセット</td><td>Chroma</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5フィルターセット</td><td>Chroma</td><td>49006</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td>位相差および落射蛍光の場合</td></tr><tr><td>蛍光励起源</td><td>Lumencor</td><td>SOLA-E</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Elementsソフトウェア</td><td>Nikon</td><td></td><td>顕微鏡のセットアップを制御するソフトウェア</td></tr><tr><td>位相差 100倍対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>プランアポクロマート (NA 1.45)</td><td></td></tr><tr><td>Probe sequence</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos with C6 amino modification at the 5'</td><td>end Biosearch Technologies Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lacZ1</td><td></td><td>GTGAATCCGTAATCATGGTC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ2</td><td></td><td>TCACGACGTTGTAAACGAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ3</td><td></td><td>ATTAAGTTGGGTAACGCCAG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ4</td><td></td><td>TATTACGCCAGCTGGCGAAA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ5</td><td></td><td>ATTCAGGCTGCGCAACTGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ6</td><td></td><td>AAACCAGGCAAAGCGCCATT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ7</td><td></td><td>AGTATCGGCCTCAGGAAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ8</td><td></td><td>AACCGTGCATCTGCCAGTTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ9</td><td></td><td>TAGGTCACGTTGGTGTGTAGAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ10</td><td></td><td>AATGTGAGCGAGTAACAACC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ11</td><td></td><td>GTAGCCAGCTTTTTCATCAACA</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ12</td><td></td><td>AATAATTCGCGTCTGGCCTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ13</td><td></td><td>AGATGAAACGCCGAGTTAAC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ14</td><td></td><td>AATTCAGACGGCAAACGACT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ15</td><td></td><td>TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ16</td><td></td><td>ATCTTCCAGATAACTGCCGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ17</td><td></td><td>AACGAGACGTCACGGAAAAT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ18</td><td></td><td>GCTGATTTGTGTAGTCGGTT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ19</td><td></td><td>TTAAAGCGAGTGGCAACATG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ20</td><td></td><td>AACTGTTACCCGTAGGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ21</td><td></td><td>ATAATTTCACCGCCGAAAGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ22</td><td></td><td>TTTCGACGTTCAGACGTAGT</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ23</td><td></td><td>ATAGAGATTCGGGATTTCGG</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ24</td><td></td><td>TTCTGCTTCAATCAGCGTGC</td><td>5' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ25</td><td></td><td>ACCATTTTCAATCCGCACCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ26</td><td></td><td>TTAACGCCTCGAATCAATCAAGCAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ27</td><td></td><td>ATGCAGAGGATGCTCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ28</td><td></td><td>TCTGCTCATCCATGACCTGA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ29</td><td></td><td>TTCATCAGCAGGATATCTCG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ30</td><td></td><td>CACGGCGTTAAAGTTGTTCT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ31</td><td></td><td>TGGTTCGGATAATGCGAACA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ32</td><td></td><td>TTCATCCACACATACAGGC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ33</td><td></td><td>TGCCGTGGGTTTCAATATTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ34</td><td></td><td>ATCGGTCAGACGATTCATTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ35</td><td></td><td>TGATCACACTCGGGTGATTA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ36</td><td></td><td>ATACAGCGCGTCGTGATTAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ37</td><td></td><td>GATCGACAGATTTGATCCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ38</td><td></td><td>AAATAATATCGGTGGCCGTG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ39</td><td></td><td>TTTGATGGACCATTTCGGCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ40</td><td></td><td>TATTCGCAAAGGATCAGCGG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ41</td><td></td><td>AAGACTGTTACCCATCGCGT</td><td></td></tr><tr><td>lacZ42</td><td></td><td>TGCCAGTATTTAGCGAAACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ43</td><td></td><td>AAACGGGGATACTGACGAAA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ44</td><td></td><td>TAATCAGCGACTGATCCACC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ45</td><td></td><td>GGGTTGCCGTTTTCATCATA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ46</td><td></td><td>TCGGCGTATCGCCAAAATCA</td><td></td></tr><tr><td>lacZ47</td><td></td><td>TTCATACAGAACTGGCGATC</td><td></td></tr><tr><td>lacZ48</td><td></td><td>TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG</td><td></td></tr><tr><td>lacZ49</td><td></td><td>ACGGAACTGGAAAAACTGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ50</td><td></td><td>TATTCGCTGGTCACTTCGAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ51</td><td></td><td>GTTATCGCTATGACGAACA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ52</td><td></td><td>TTTACCTTGTGGAGGACAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ53</td><td></td><td>GTTCAGGCAGTTCAATCAAC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ54</td><td></td><td>TTGCACTACGCGTACTGTGA</td><td>3'mRNA</td></tr><tr><td>lacZ55</td><td></td><td>AGCGTCACACTGAGGTTTTC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ56</td><td></td><td>ATTTCGCTGGTGGTCAGATG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ57</td><td></td><td>ACCCAGCTCGATGCAAAAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ58</td><td></td><td>CGGTTAAATTGCCAACGCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ59</td><td></td><td>CTGTGAAAGAAAGCCTGACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ60</td><td></td><td>GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ61</td><td></td><td>TACGCCAATGTCGTTATCCA</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ62</td><td></td><td>TAAGGTTTTCCCCTGATGCT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ63</td><td></td><td>ATCAATCCGGTAGGTTTTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ64</td><td></td><td>GTAATCGCCATTTGACCACT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ65</td><td></td><td>AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ66</td><td></td><td>ATGTCTGACAATGGCAGATC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ67</td><td></td><td>ATAATTCAATTCGCGCGTCC</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ68</td><td></td><td>TGATGTTGAACTGGAAGTCG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ69</td><td></td><td>TCAGTTGCTGTTGACTGTAG</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ70</td><td></td><td>ATTCAGCCATGTGCCTTCTT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ71</td><td></td><td>AATCCCCATTGGAAACCGT</td><td>3' mRNA</td></tr><tr><td>lacZ72</td><td></td><td>AGACCAACTGGTAATGGTAG</td><td>3' mRNA</td></tr></tbody></table>

situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmrna運動学の探査

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

その場合の単一分子蛍光(smFISH)は、個々の細胞内のmRNAの絶対数を数える。ここでは、 大腸菌における転写およびmRNA分解率を測定するためのsmFISHの適用について述べた。smFISHは固定細胞に基づいているため、時間経過実験中、すなわち細胞が遺伝子発現の誘導または抑制時に同期変化を起こしているとき、複数の時点でsmFISHを実行します。各時点で、mRNAのサブ領域は、プローブ転写伸長および早期終了とスペクトル的に区別される。このプロトコルの結果はまた、細胞間のmRNAコピー数におけるmRNAおよび異質性の細胞内局在化を分析することを可能にする。このプロトコルを使用すると、多くのサンプル(〜50)を8時間以内に処理することができます。細菌細胞における異なるmRNAの転写および分解動態を研究するために、このプロトコルを適用する方法を議論する。

このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...

smFISHは、mRNAの細胞下位置として絶対数を測定するために知られています。当社の2色sMFISHプロトコルは、転写およびmRNA分解の運動を測定する追加機能を有する。この方法を使用すると、余分な時間や労力をかけずに多くのサンプルを同時に処理できます。例えば、48サンプルを得る4つのタイムコース実験は、8時間でイメージングのために処理することができる。当社のプロトコルは、多くの遺伝子や細菌種に広く適用されます。実験用のカバースリップとガラススライドを準備する。100%エタノールを含むコプリン瓶にカバースリップとスライドを入れ、15〜20分間水浴超音波ケータリングに瓶を置くために鉗子を使用してください。超音波処理の終わりにスライドを洗浄し、70%エタノールで瓶を補充し、超音波処理を繰り返す前に、超純水で3〜4回スリップカバー。すべての超音波処理ステップが完了したら、カバースリップを乾燥させ、窒素ガスでスライドします。カバースリップを空の1000マイクロリットルピペットチップボックスに入れ、スライドをきれいなスライドボックスに入れます。次いで、ピペットチップボックスの穴に続いて、疎水性マーカーを使用してカバースリップに円を描き、これらのウェルのそれぞれに0.1%Poly lリジンの20マイクロリットルのドロップを適用します。タイムコース実験を設定するには、指数関数的に成長している20ミリリットルの大腸菌培養物から、タイムゼロとマークされた1.5ミリリットルの培養チューブに750マイクロリットルを加えます。そしてすぐに管を反転する。0.2 から 1 ミリモル IPTG で lac Z の発現を誘導し、タイマーを開始します。タイマーを確認した後、ちょうど示したように、連続した実験時点の細胞培養を収集する。実験中の適切な時点で、フラスコに5ミリモルONPFを加え、lac Z発現を抑制し、培養物をサンプリングし続けてmRNA分解を追跡する。タイムコースサンプルの取得終了時に、室温でサンプルを15分間インキュベートし、氷上で30分間インキュベーションします。インキュベーション遠心分離機の終わりには、固定剤を除去し、ピペットを使用して上清を除去するためにサンプルを遠心分離する。DEPC PBSの1ミリリットルで細菌を再懸濁し、洗浄ごとに新鮮なDEPC PBSの1ミリリットルでさらに2回細胞を洗浄します。最後の洗浄後、新鮮なDEPC PBSの30マイクロリットルで細胞を再懸濁します。細胞の透過性のため。まず、エタノール滅菌ガラスカバースリップの1つに個々の疎水性井戸に各時間ポイントからサンプルを追加します。そして、細胞が室温で10〜30分のインキュベーションでカバースリップに付着するようにします。インキュベーションの終わりに、各ウェルに70%エタノールの15マイクロリットルを加えます。4分後、各ウェルからエタノールを吸引し、井戸が完全に乾燥するようにする。洗浄後、透過化された細胞の各ウェルに30マイクロリットルのプレハイブリダイゼーション溶液を加え、37°Cのオーブンで30分間培養します。プレハイブリダイゼーション溶液をウェルあたり約30マイクロリットルのプローブハイブリダイゼーション溶液に置き換えます。そして37°Cのオーブンで2時間のインキュベーションのためのアルミニウムホイルで部屋をカバーする。インキュベーションの最後に、マルチチャンネルピペットを使用して、洗浄ごとに30マイクロリットルの洗浄液でウェルを3〜5回洗い流します。最後の洗浄の後、37°Cで15〜30分間細胞をインキュベートしてから、1回の洗浄ごとに30マイクロリットルの新鮮なDEPC PBSで井戸を5回洗浄します。最後の洗浄後、カバースリップからすべての液体を吸引します。そして、各井戸に新鮮なDEPC PBSの4マイクロリットルを追加します。鉗子を使用して、カバースリップをエタノール滅菌ガラススライドサンプル側の下に慎重に置き、シリコーンデンタルガムを使用してカバースリップの端を密封します。対象領域を特定するには、位相コントラストイメージングのライブモードを選択し、井戸内の視野を変更するためにステージジョイスティックを操作します。位相コントラストのセル画像が焦点を合わせ、Zフォーカスを調整して最適な領域に位置する。次に、4秒露光を伴うC 5画像、2秒露光を伴うC3画像、およびウェルあたり約10の異なる領域に対して0.2秒の露出を有する位相コントラスト画像を取得する。あるいは、直列にC5、C3及び位相コントラスト画像が取得されるNDI取得を実行することができる。すべてのウェルがイメージ化されたら、適切なセルセグメンテーションツールを開き、スタックをクリック解除します。対象の位相コントラスト画像をロードして独立したフレームを選択し、フェーズプロファイルをゼロとして計算します。セルが識別され、それらの輪郭が計算されるセグメント化プロセスを開始します。GitHub フォルダーに指定されたパラメーターを読み込み、すべてのフレームをクリックします。処理の最後に輪郭を選択してメッシュを視覚化します。次に、スポット検出タブで、スタックをオフにし、メッシュをチェックし、2つのDガウスフィッティングに基づいてスポット識別と定量を開始するためにこすりをクリックします。蛍光画像と、細胞検出手順から計算したメッシュファイルを含むフォルダを選択し、スポット検出結果を保存するファイル名を指定します。次に、GitHub で提供されている画像分析ワークフローを使用して、蛍光画像を分析します。この全視野では、細胞のセグメンテーションに適した密度で約500個の大腸菌細胞が観察できる。位相コントラスト画像の細胞の形態は、セグメンテーション目的で生細胞の形態と同等であり続けるべきである。細胞が透過性を超える場合、その形態はセグメンテーションには適さない。誘導前のラックZ mRNAスポット強度の分布は、高強度のスポットの存在により、正常分布またはポアソン分布とは適合しません。ラックZの発現が誘導されると、3つのプライムラックZmRNAシグナルが増加する前に5つのプライムラックZmRNAのシグナルが増加する。ラックZの発現が抑圧された場合、5個と3つのプライムラックZmRNAシグナルが減少する。転写伸長の速度を得るために、5および3つの主要信号の上昇は線に適合する。mRNA分解の速度は、指数関数を有する崩壊領域を適合させることによって得られる。単一分子魚は単一細胞の技術であるため、転写における細胞間の変動性も分析できる。さらに、5つの素数と3つのプライムラックZ mRNAの共局在化の分析により、lac Z遺伝子上のRNAポリメラーゼの密度を定量化することができます。異なる時間ポイントからのサンプルは、この手順の間に同時に処理されます。チューブとカバースリップの間、サンプルを分離しておくことが重要です。この単一分子単一細胞顕微鏡法を用いた。研究者は、トランスクリプションおよびmRNA分解動態がmRNAの絶対数または細胞内位置にどのように関連しているかを調べることができます。

probing-mrna-kinetics-space-time-escherichia-coli-using-two-color

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、画像への開裂により蛍光顕微鏡法、共同翻訳活性化（CoTrAC）、タンパク質の機能を乱すことなく、単一分子の精度で生細胞中のタンパク質分子の製造を記述している。このメソッドは、転写因子、λリプレッサーCIの確率の発現動態を追跡するために使用されています...

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

このプロトコルは、蛍光を実行するための実験手順を説明...

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

スパイクの追加に基づく異なるサンプル間転移 RNA の相対的なレベルまたは他の短い RNA を比較する方法と同様、精製されたエシェリヒア属大腸菌RNA からレベルを充電転送の RNA...

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

この単一分子蛍光その場で交配のプロトコルは、栄養生長と減数分裂中出芽酵母の RNA...

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

サイト指示された突然変異誘発は、デオキシリボ核酸 (DNA) の特定の突然変異を導入する技術です。このプロトコルは、2 ステップでサイト指示された突然変異誘発を行う方法をについて説明し、3 ステップのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) ベースのアプローチは、興味の DNA...

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

個々の翻訳イベントを追跡することで、キャップ依存翻訳メカニズムの高解像度の運動研究が可能になります。ここでは、蛍光標識抗体とエピトープタグ付き新生ペプチドとのイメージング相互作用に基づく インビトロ 単分子アッセイを示す。この方法は、 インビトロ...

キャップ依存翻訳キネティクス解析のための インビトロ 単分子イメージングアッセイ

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

単一分子蛍光エネルギー移動は、リボソームタンパク質合成中のtRNAダイナミクスを追跡する方法である。個々のリボソームを追跡することにより、不均一な集団が同定され、メカニズムに光が当たります。この方法は、生物学的立体構造の変化を一般的に追跡し、他の多くの複雑なバイオシステムにおける動的機能関係を明らかにするために使用することができる。単一分子法は、平均効果のために従来のアンサンブル法ではアクセスできない非レート制限ステップおよび低人口のキー中間体を観察することができる。...

リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

細胞外細菌やオルセーウイルスや微胞子虫(真菌)などの細胞内病原体を含む腸内微生物は、野生の カエノラブディティス 線虫と関連していることがよくあります。この記事では、 C.エレガンス...

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

学ぶ2色単分子蛍光in situハイブリダイゼーション法で大腸菌のmRNA転写速度と分解動態を同時測定する技術。48サンプルを8時間で処理可能で、遺伝子発現の時間変動を単細胞レベルで解析できます。

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた大腸菌における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

さらに動画を探す

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査

さらに動画を探す

Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた大腸菌における空間と時間におけるmRNA運動学の探査