Name: 有害刺激センシングのための定量的行動読み出しとしてのプラナリアンスクランチング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぶプラナリアの有害刺激応答としてのスクランチング行動の定量的解析法。熱や切断刺激を用いてスクランチングを誘導し、神経系機能障害の評価に応用可能な表現型リードアウトを提供します。

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著者らは、原稿に関するコメントに対するタタン・ゴエル氏に感謝する。この作品は、NSFキャリアグラント1555109によって資金提供されました。

<ol><li>Rink, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+systems+and+regeneration+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Stem cell systems and regeneration in planaria.</a> Development Genes and Evolution. 223, 67-84 (2013).</li>
<li>Reddien, P. W., Alvarado, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+Planarian+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of Planarian Regeneration.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 20, 725-757 (2004).</li>
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<li>Mc Connell, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMc+Connell%2C+J+%22A+Manual+of+Psychological+Experimentation+on+Planarians%22">A Manual of Psychological Experimentation on Planarians</a>. , Planarian Press. (1967).</li>
<li>Talbot, J., Schötz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+planarian+wild-type+behavior+as+a+platform+for+screening+locomotion+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of planarian wild-type behavior as a platform for screening locomotion phenotypes.</a> Journal of Experimental Biology. 214, 1063-1067 (2011).</li>
<li>Cochet-Escartin, O., Mickolajczk, K. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrunching%3A+a+novel+escape+gait+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Scrunching: a novel escape gait in planarians.</a> Physical Biology. 12, 055001(2015).</li>
<li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+shows+decision-making+behavior+in+response+to+multiple+stimuli+by+integrative+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Letters%22%5BJournal%5D)">Planarian shows decision-making behavior in response to multiple stimuli by integrative brain function.</a> Zoological Letters. 1, 1-15 (2015).</li>
<li>Arenas, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+planarian+TRPA1+by+reactive+oxygen+species+reveals+a+conserved+mechanism+for+animal+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activation of planarian TRPA1 by reactive oxygen species reveals a conserved mechanism for animal nociception.</a> Nature Neuroscience. 20, 1686-1693 (2017).</li>
<li>Shomrat, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+training+paradigm+reveals+long-term+memory+in+planarians+and+its+persistence+through+head+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration.</a> Journal of Experimental Biology. 216, 3799-3810 (2013).</li>
<li>Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Second-Generation+device+for+automated+training+and+quantitative+behavior+analyses+of+Molecularly-Tractable+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Second-Generation device for automated training and quantitative behavior analyses of Molecularly-Tractable model organisms.</a> PLoS One. 5, 1-20 (2010).</li>
<li>Ross, K. G., Currie, K. W., Pearson, B. J., Zayas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+system+development+and+regeneration+in+freshwater+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews-Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nervous system development and regeneration in freshwater planarians.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews-Developmental Biology. 6, 266(2017).</li>
<li>Cebrià, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+neural-specific+genes+reveals+the+structural+and+molecular+complexity+of+the+planarian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The expression of neural-specific genes reveals the structural and molecular complexity of the planarian central nervous system.</a> Mechanisms of Development. , 116-204 (2002).</li>
<li>Mineta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 7666-7671 (2003).</li>
<li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SoxB1+Activity+Regulates+Sensory+Neuron+Regeneration%2C+Maintenance%2C+and+Function+in+Planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">SoxB1 Activity Regulates Sensory Neuron Regeneration, Maintenance, and Function in Planarians.</a> Developmental Cell. 47, 331-347 (2018).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+Dopaminergic+Neural+Network+and+Locomotion+Function+in+Planarian+Regenerates%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of Dopaminergic Neural Network and Locomotion Function in Planarian Regenerates.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1059-1078 (2007).</li>
<li>Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+planarian+TRPA1+homolog+mediates+extraocular+behavioral+responses+to+near-ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The planarian TRPA1 homolog mediates extraocular behavioral responses to near-ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 2616-2625 (2017).</li>
<li>Currie, K. W., Molinaro, A. M., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+sources+of+hedgehog+modulate+neurogenesis+in+the+adult+planarian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neuronal sources of hedgehog modulate neurogenesis in the adult planarian brain.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Talbot, J. A., Currie, K. W., Pearson, B. J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smed-dynA-1+is+a+planarian+nervous+system+specific+dynamin+1+homolog+required+for+normal+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Smed-dynA-1 is a planarian nervous system specific dynamin 1 homolog required for normal locomotion.</a> Biology Open. , 1-8 (2014).</li>
<li>Currie, K. W., Pearson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+lhx1%2F5-1+and+pitx+are+required+for+the+maintenance+and+regeneration+of+serotonergic+neurons+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcription factors lhx1/5-1 and pitx are required for the maintenance and regeneration of serotonergic neurons in planarians.</a> Development. 140, 3577-3588 (2013).</li>
<li>Hagstrom, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+cholinesterase%3A+molecular+and+functional+characterization+of+an+evolutionarily+ancient+enzyme+to+study+organophosphorus+pesticide+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Planarian cholinesterase: molecular and functional characterization of an evolutionarily ancient enzyme to study organophosphorus pesticide toxicity.</a> Archives of Toxicology. 92, 1161-1176 (2018).</li>
<li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+brain+regeneration+as+a+model+system+for+developmental+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Planarian brain regeneration as a model system for developmental neurotoxicology.</a> Regeneration. 3, 65-77 (2016).</li>
<li>Hagstrom, D., Cochet-Escartin, O., Zhang, S., Khuu, C., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshwater+planarians+as+an+alternative+animal+model+for+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Freshwater planarians as an alternative animal model for neurotoxicology.</a> Toxicological Sciences. 147, 270-285 (2015).</li>
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<li>Wu, J. P., Li, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+freshwater+planarians+in+environmental+toxicology+studies%3A+Advantages+and+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">The use of freshwater planarians in environmental toxicology studies: Advantages and potential.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 161, 45-56 (2018).</li>
<li>Rompolas, P., Azimzadeh, J., Marshall, W. F., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ciliary+assembly+and+function+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of ciliary assembly and function in planaria.</a> Methods in Enzymology. 525, 245-264 (2013).</li>
<li>Sabry, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+or+genetic+targeting+of+Transient+Receptor+Potential+%28TRP%29+channels+can+disrupt+the+planarian+escape+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pharmacological or genetic targeting of Transient Receptor Potential (TRP) channels can disrupt the planarian escape response.</a> PLoS One. , 753244(2019).</li>
<li>Cochet-Escartin, O., Carter, J. A., Chakraverti-Wuerthwein, M., Sinha, J., Collins, E. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slo1+regulates+ethanol-induced+scrunching+in+freshwater+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Slo1 regulates ethanol-induced scrunching in freshwater planarians.</a> Physical Biology. 13, 1-12 (2016).</li>
<li>Hagstrom, D., Truong, L., Zhang, S., Tanguay, R. L., Collins, E. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+zebrafish+and+planarian+model+systems+for+developmental+neurotoxicity+screens+using+an+87-compound+library%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of zebrafish and planarian model systems for developmental neurotoxicity screens using an 87-compound library.</a> Toxicological Sciences. , (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Akiyama, Y., Agata, K., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Behaviors+and+Wall-Curvature+Lead+to+Apparent+Wall+Preference+in+Planarian%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Behaviors and Wall-Curvature Lead to Apparent Wall Preference in Planarian.</a> PLoS One. 10, 0142214(2015).</li>
<li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9, 114708(2014).</li>
<li>Petrus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+TRPA1+in+mechanical+hyperalgesia+is+revealed+by+pharmacological+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">A role of TRPA1 in mechanical hyperalgesia is revealed by pharmacological inhibition.</a> Molecular Pain. 3, 40(2007).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration-dependent+conditional+gene+knockdown+%28Readyknock%29+in+planarian%3A+Demonstration+of+requirement+for+Djsnap-25+expression+in+the+brain+for+negative+phototactic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration-dependent conditional gene knockdown (Readyknock) in planarian: Demonstration of requirement for Djsnap-25 expression in the brain for negative phototactic behavior.</a> Development, Growth & Differentiation. 49, 383-394 (2007).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+glutamic+acid+decarboxylase+gene+and+distribution+of+GABAergic+nervous+system+in+the+planarian+Dugesia+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of glutamic acid decarboxylase gene and distribution of GABAergic nervous system in the planarian Dugesia japonica.</a> Neuroscience. 153, 1103-1114 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Yamashita, T., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermosensory+signaling+by+TRPM+is+processed+by+brain+serotonergic+neurons+to+produce+planarian+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thermosensory signaling by TRPM is processed by brain serotonergic neurons to produce planarian thermotaxis.</a> Journal of Neuroscience. 34, 15701-15714 (2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルを使用すると、物理および化学的刺激,7、28、29または遺伝子操作(RNAi)28、29のプラ28,29ナリアン移動の影響を定量的に研究することができます。72829空間解像度を最大限に高めるには、アリーナ全体が視野に入っていることを確認しながら、カメラをできるだけアリーナの近くに移動することをお勧めします。スループットを向上させるために、複数のプラナリアンを同時に記録することで、複数のプラナリアンの動作を一度にスクリーニングできます。1つのアリーナで複数のプラナリアンをスクリーニングする場合、フィジーで関心のある地域を描き、ここで説明するように個々のプラナリアンを隔離するか、より高度なマルチオブジェクト追跡を採用することができます。同じアリーナに複数のプラナリアンを持つことの1つの問題は、彼らがパスを横断できることです。...

,幹細胞や再生,研究1、2、32に人気の他1に、淡水プラナリアンは、比較的大きなサイズ(長さが数ミリメートル)、簡単で低コストの実験室のメンテナンス、および観察可能な行動の広いスペクトルを利用して、行動研究34、5で長い間使用されてきました。5コンピュータビジョンと自動追跡をプラナリアン行動研究676、7、8、9、10、11に導入すると、行動型の定量的分化が8,9,10,11可能になりました。,,動物の行動は、神経機能の直接の読み出しです。プラナリアン神経系は中規模で複雑であるが、脊椎動物の脳12、13、1413,14と共に保存された重要な要素を共有するため、プラナリアンの行動を研究することは、より複雑な生物で直接探査するのが難しいニューロン作用の保存されたメカニズムに関する洞察を提供することができる。12したがって、プラナリアンは、比較神経生物学研究,,,88、12、15、16、17、18、19、20、21,12,15,16の貴重なモデルです。,2119,201718さらに、水生環境は、再生および成人プラナリアンにおける脳機能への影響を研究するために化学物質への迅速かつ容易な暴露を可能にし、神経毒性学22、23、24、25、26のための人気のシステムにする。,23,24,25,26
プラナリアンは、滑空、蠕動、スクランチと呼ばれる3つの異なる足取りを持っています。各歩行は、特定の状況下で展示されています:滑空はデフォルトの歩行であり、毛様体機能が損なわれると蠕動が起こり、27シリア機能から独立したエスケープ歩行である - 特定の有害な刺激に応答して7。我々は、スクランチングは、極端な温度またはpH、機械的損傷、または特定の化学的誘導物質を含む特定の化学的または物理的手がかりの感覚によって引き起こされ、したがって一般的なストレス応答77、28、2928,29ではないことを示している。
このプロトコルを使用して容易に定量化することができるその特異性およびステレオタイプのパラメータのために、スクランチングは、研究者が行動25、28,28の感覚経路および神経制御を解剖する機械学的研究を行うことを可能にする強力な行動表現型である。さらに、スクランチングは,、神経毒性学研究22、24、25、30における神経系の発達および機能に対する22,24,有害な化学的影響をアッセイする敏感なエンドポイントであることが示されている。2530いくつかの異なる感覚経路が様々なメカニズム28を通してしゃがみを誘発するために収束するように見えるので、様々だが特定の刺激を使用して異なる神経回路を解剖し、異なる信号がどのように統合され、異なるシグナルタイプを産生するかを研究することができるので、スクランチは他のプラナリアン行動とは異なる。
重要なことに、種の違いは存在し、ある化学物質はあるプラナリアン種でスクランチを引き起こすかもしれないが、別のプラナリアン種では異なる行動反応を引き起こす可能性がある。例えば、アナンダミドは、平面種ドゥゲシア・ジャポニカでスクランチを誘発するが、シュミネア地中海28で蠕動を誘発することを発見した。この例では、異なる分子機構の明白な現れであるため、異なる歩行を確実に区別できることの重要性を強調しています。しかし、両足歩行は筋力主導であり、質的類似性,を共有するため、蠕動性と蠕動の区別は、質的観察データを使用して困難である。したがって、歩行を区別するには、繊毛イメージングまたは定量的行動研究を行う必要があり、これは特性パラメータ77,2828に基づく区別を可能にする。繊毛イメージングは実験的に困難であり、高倍率の化合物顕微鏡や高速カメラ77、2828などの特殊な装置を必要とするため、定量的行動分析ほど研究者が普及することは不可能です。
ここでは、(1)様々な物理的(有害温度、切断、近紫外線)および化学(アリルイソチオシアネート(AITC)、シナアルデヒド)刺激を用いたスクランチの誘導と(2)自由に入手可能なソフトウェアを用いたプラナリアン行動の定量分析のためのプロトコルを提示する。4つのパラメータ(身体長振動の周波数、相対速度、最大振幅、および体伸びと収縮の非対称性)を定量化することにより、スクランチングは、ヘビ様移動運動15やてんかん15などの文献で報告される滑空、蠕動、その他の行動状態と区別することができる。15さらに、スクランチングは、異なるプラナリアン種7の間で保存されているが、各種は、独自の特徴的な周波数と速度を有する。したがって、種の滑空速度とスクランチ速度が決定されると、速度だけでは滑空および蠕動29とスクランチを区別する手段として使用することができる。このプロトコルは、計算画像解析や行動研究における事前の訓練を前提としないため、学部レベルの教育研究室の文脈におけるプラナリアン行動実験にも適用することができます。プロトコルの適合を容易にするデータの例は補足資料に記載されている。

<table><tbody><tr><td>アリルイソチオシアネート、95%(AITC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>377430-5G</td><td>注意:&nbsp;可燃性で急性毒性;適切なPPEを備えたヒュームフードでハンドルします。</td></tr><tr><td>カメラレンズ 2/3 25mm F/1.4&nbsp;</td><td>タムロン</td><td>23FM25SP</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート 6ウェル 組織培養処理済み</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ、50 mL ポリプロピレン、滅菌</td><td>MedSupply パートナー</td><td>62-1019-2</td><td></td></tr><tr><td>シンナムアルデヒド、>95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W228613-100G-K</td><td></td></tr><tr><td>調光可能 A4 LED トレーサー ライトボックス</td><td>Amazon</td><td>B07HD631RP</td><td></td></tr><tr><td>Flea3 USB3 カメラ</td><td>FLIR</td><td>FL3-U3-13E4M</td><td></td></tr><tr><td>耐熱手袋</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-394-298</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>HP88854200</td><td></td></tr><tr><td>インスタント オーシャン シー ソルト、脱イオン水で調製</td><td>インスタント オーシャン</td><td>SS15-10</td><td>0.5 g/L の脱イオン水で調製します。</td></tr><tr><td>モンジ&uuml;ミリQ水で調製されたic塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>種々</td><td>ミリQ水で1.6 mM NaCl、1.0 mM CaCl<サブ>2</サブ>、1.0 mM MgSO<サブ>4</サブ>、0.1 mM MgCl<サブ>2</サブ>、0.1 mM KCl、1.2 mM NaHCO<サブ>3</サブ>で調製し、HClでpHを7.0に調整します。</td></tr><tr><td>シャーレ、100 mm x 20 mm、滅菌ポリスチレン</td><td>Simport</td><td>D210-7</td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペット、20-200 &mu;L レンジ</td><td>レイニン</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>PYREX 150 mL ビーカー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS1000150</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃、0.22 mm</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Roscolux カラーフィルター:&nbsp;Golden Amber</td><td>Rosco</td><td>R21</td><td>または、3つのカラーフィルターがすべて含まれているRoscolux Designer Color Selector(Musson Theatrical製品 #SBLUX0306)を購入してください。</td></tr><tr><td>Roscoluxカラーフィルター:&nbsp;ミディアムレッド</td><td>Rosco</td><td>R27</td><td></td></tr><tr><td>Roscolux カラーフィルター:&nbsp;Storaro Red</td><td>Rosco</td><td>R2001</td><td></td></tr><tr><td>Samco トランスファーピペット、62 & マイクロ;L 大口径</td><td>サーモフィッシャー</td><td>691TS</td><td></td></tr><tr><td>サポートスタンド&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-947-976</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>VWR</td><td>89095-600</td><td></td></tr><tr><td>UVレーザーポインター</td><td>アマゾン</td><td>B082DGS86R</td><td>これはクラスIIレーザー(405nm&plusmn;10nm)出力電力<5mWです。</td></tr></tbody></table>

有害刺激センシングのための定量的行動読み出しとしてのプラナリアンスクランチング

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

淡水のプラナリアンは、通常、腹側の毛様体の推進力を通って滑らかに滑空します。しかし、特定の環境条件は、運動性主導の移動形態である蠕動またはスクランチを誘発する可能性がある。蠕動は毛様体欠損から生じるが、スクランチは繊毛機能から独立しており、切断、有害温度、極端なpH、エタノールを含む特定の刺激に対する特異的な反応である。したがって、これら2つの筋肉駆動の足取りは、機械学的に異なっている。しかし、質的に区別することは困難です。ここでは、様々な物理的および化学的刺激を用いてスクランチを誘導するためのプロトコルを提供します。自由に利用できるソフトウェアを用いて、蠕動や滑空と区別するために使用できるスクランチングの定量的特徴について詳しく説明します。スクランチは、特徴的な種固有の違いはあるものの普遍的なプラナリアン歩行であるため、このプロトコルは、適切な考慮事項を使用する場合、すべての種のプラナリアンに広く適用することができます。これを実証するために、行動研究で使用される2つの最も人気のあるプラナリアン種、 ドゥゲシア・ジャポニカ と シュミテア・メディテラニアの反応を、物理的および化学的刺激の同じセットと比較する。さらに、スクランチングの特異性により、このプロトコルをRNA干渉および/または薬理学的暴露と組み合わせて使用して、関係する分子標的および神経回路を解剖し、ノシセプションおよび神経筋コミュニケーションの重要な側面に対する機械的な洞察を提供する可能性がある。

S.地中海プラナリアンにおける外眼近紫外知覚はTRPA1依存性であり、H2O2リリース17にリンクすることが提案2されている。H2O2露光はS.地中海およびD.ジャポニカプラナリアン28でTRPA1依存的なスクランチを誘発するので、セクション2.1.4のステップは、近紫外光暴露が両方の種でスクランチを誘発するかどうかをテストするために使用することができる。D.ジャポニカプラナリアンは、ほぼUV光にさらされると(10/10)しゃがむが、S.地中海のプラナリアンは、前述の17のように尾間引き(7/10)を示すか、応答なし(3/10)を示す(図4A,4B)。セクション1.4で概説されているように、少なくとも3つの連続した直線スクランチ...

淡水プラナリアンは、定量的行動分析によって区別できる3つの歩行(滑空、蠕動、およびスクランチ)を示す。我々は、様々な有害刺激、その定量、および蠕動および滑空との区別を用いてスクランチを誘導する方法を記述する。遺伝子ノックダウンを用いて、定量的表現読み出しとしてスクランチングの特異性を実証する。

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

このプロトコルは、研究者が分子および化学的摂動と定量的行動分析を組み合わせることによって、この行動の根底にあるプラナリアン行動およびsecメカニズムを明らかにすることを可能にする。この技術は、自由な移動プラナリアンの定量的な行動読み出しを得るために高度な機器や特殊なソフトウェアを必要としないため、すべてのスキルレベルに簡単にアクセスできます。スクランチングは、プラナリアンの例外を研究するために使用することができ、ゼノバイオティクスや病気によって引き起こされる神経系機能を破壊し、アッセイに敏感なエンドポイントとして機能します。まず、均一な白い背景を提供し、適切なコントラストを得るために調整可能な光源として使用できる平らな面に調光可能なLEDパネルを配置します。LEDパネルに100ミリメートルペトリ皿アリーナを配置します。アリーナの上のリングスタンドにカメラを取り付け、アリーナ全体が視野内を中心にして焦点を合わせるように、必要に応じて位置、高さ、フォーカスを調整します。最大音量を持っている適切な露出メディアの約25ミリリットルでアリーナを埋める、LEDパネルをオンにし、記録品質に悪影響を与える可能性がある他の光源をオフにします。転送ピペットを使用してアリーナの中央にプラナリアンをドロップします。化学溶液を試験する際には、化学薬品の濃度が大きく変化しないように、できるだけ少ないプラナリアン水でプラナリアンを移送します。ネイティブフィジー形式で画像シーケンスとしてデータの記録を開始します。滑空実験の場合、滑空動作の1〜2分を記録し、スクランチングまたは蠕動性実験のために、直線で起こる少なくとも3つの連続した振動を捕捉するのに十分な長さを記録する。実験が完了したら、記録を終了します。プラナリアンが終了基準を満たさずにアリーナの境界に達した場合は、プラナリアンをアリーナの中心に戻します。フィジーで実験の生の画像シーケンスを開き、8 ビットに変換し、イメージ スタックの下部にある矢印ツールまたはスライダーを使用して、イメージ シーケンスをパンします。対象の期間と領域を抽出するには、四角形ツールを使用して、平面の完全なパスを含む対象領域を描画します。イメージスタックを右クリックして複製を選択し、重複するスタックのチェックボックスをオンにします。対象となるシーケンスの最初と最後のフレームを入力し、[はい] をクリックします。滑空実験の場合は、平坦な動きが少なくとも2倍の体長をスクランチまたは蠕動実験のために滑空する期間を抽出します。プラナリアンが最低3回連続し、完全なボディ振動を直線で行った場合に、インスタンスを抽出します。複製されたイメージ スタックにしきい値を適用して画像を二元化し、背景からプラナリアンを抽出し、平坦全体が赤で強調表示されるようにスライド バーを調整します。正確な値は、イメージング品質に依存します。暗い背景のボックスを残し、ヒストグラムをスタックし、範囲をリセットしないイメージ スタックをスクロールして、適切なしきい値範囲を確認し、[適用] をクリックします。「スタックをバイナリに変換」ウィンドウで、メソッドをデフォルトに、背景を明るく設定します。このウィンドウのすべてのボックスのチェックを外し、[大丈夫]をクリックします。白い背景に黒い平面を示すバイナリ化された画像が表示されます。イメージ シーケンスのすべてのフレームで、プラナリアン全体が表示されていることを確認します。[分析]をクリックして測定を設定し、測定値を設定します。領域、重心、スタック位置、フィット楕円のチェックボックスをオンにして、[大丈夫]をクリックします。開いたイメージ スタックを選択し、解析を選択してパーティクルを解析します。[パーティクルの解析]ウィンドウで、[show]と[masks]を選択して、選択したパラメータで検出されたすべてのオブジェクトを表示する新しいスタックを開きます。平坦な領域に入って不要なノイズを除去するサイズフィルタを設定します。次に、結果を表示するチェックボックスをオンにして、結果をクリアし、[大丈夫]をクリックします。パネルの下部にあるスライダーを使用してマスクイメージスタックをパンし、平面のないノイズやフレームがないことを確認します。結果ウィンドウで、ファイルを使用してデータを保存し、ファイル名に CSV 拡張子を追加して、データをコンマ区切り値で保存します。イメージ スタックのデータを保存したら、それぞれのイメージ スタック結果とマスク ウィンドウを閉じます。有害な温度でスクランチを誘発するには、ガラスビーカーのプラナリアン水をホットプレートで摂氏65度に加熱します。アリーナの中央にプラナリアンを配置し、それが自分自身を直立して滑空を開始するまで待ってから、録音を開始します。P 200ピペットを使用して、予熱されたプラナリアン水の100マイクロリットルをゆっくりと一貫してピペットにし、プラナリアンの尾端に咽頭を置いてスクランチを誘発する。一度しゃがみ込んでしまったら、録音を停止します。回収容器にプラナリアンを置き、より多くの実験を実行する場合は、新鮮な室温プラナリアン水とペトリ皿のメディアを交換します。切断を介してスクランチを誘発するには、プラナリアンをアリーナの中心に移し、プラナリアンが直立して滑空を開始するまで待ちます。その後、記録を開始し、きれいなカミソリの刃でプラナリアンを切断します。カット位置が実験全体で一貫していることを確認する。前部の部分がしゃがみなくなったら録音を停止します。両方の部分を取り除き、別の容器に入れ、7日間再生できるようにします。切断されたプラナリアンは、再生後にホームコンテナに再組み込むことができます。このプロトコルは、UV光暴露の近くにあるかどうかをテストするために使用され、S.mediterraneaとD.japonicaプラナリアンでスクランチを誘発し、D.japonicaプラナリアンは、UV光の近くに曝露されると、S.地中海のプラナリアンは尾の間引きを示すか、応答しないかのどちらかを示す。少なくとも3つの連続した直線スクランチを示したD.japonicaプラナリアンのためのスクランチングパラメータの定量化は、マウスの250ミクロモルシンナムアルデヒド未知のTRPA1アゴニストへの対照的暴露において、この種の特性をスクランチングパラメータを明らかにし、スクランチングおよびS.地中海を引き起こす。一方、D.japonicaのプラナリアンは、滑空や激しい頭の回転によって中断されたヘビのような動きと振動運動の混合物を表示します。少なくとも3つの連続振動を有するサンプルの定量化は、4つのパラメータのうち3つのパラメータについて有意に低い値をもたらし、その後D.japonicaでスクランチが予想され、観察された振動運動が収縮していないことを示す。RNAiは、S.地中海におけるシナアルデヒド暴露に対するスクランチングおよび応答の特異性を確認する。プラナリアン水の暴露から180秒以内に、すべての制御RNAiプラナリアンがスクランチ。SMTRPAの1 RNAiプラリアンのどれもに比べて、S.地中海がシナアルデヒドでスクランチすることを実証するSMTRPA 1つがSMTRPA 1を必要とすることを示しています。騒音を低減し、行動測定で再現性を確保するために、動物の操作方法を一貫性を保つ必要があります。このプロジェクトは、ここではキャプチャされていない他の平面的な動作を識別し、定量化することを可能にするボディ形状解析を含むように拡張することができます。

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Research

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