Name: 生きた細菌におけるタンパク質とタンパク質相互作用のFLIM-FRET測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶ FLIM-FRETを用いてPseudomonas aeruginosaの生きた細菌におけるタンパク質間相互作用を測定する方法。不均一なドナー・アクセプター比のデータ解析技術を習得し、細胞内分子機構の理解を深めます。

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我々は、FLIMデータ収集及びFLIMセットアップの技術的なメンテナンスと開発に関する彼の貴重な支援のためにルドヴィック・リヒャレット博士を認める。この作品は、フォンダシオン・プール・ラ・レシェルシュ・アン・チミー(https://icfrc.fr/)からの助成金によって資金提供されました。VNは、フォンダシオン・プール・ラ・レシェルシュ・メディカル(FRM-SPF201809006906)によって資金提供されています。YMは、フランス大学(IUF)の支援と研究に専念する追加の時間を提供してくれたことに感謝しています。IJSとJGは、ストラスブールの薬物送達研究所の財政支援を認めています。

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<li>Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescence+lifetime+estimation+with+modified+phasor+approach+and+Laguerre+deconvolution%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003(2017).</li>
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<li>Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+compressive+macroscopic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+-+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging.</a> Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

FLIM-FRET は、強度ベースの FRET イメージングに対していくつかの重要な利点を提供します。蛍光寿命は、蛍光の本質的なパラメータである。その結果、光励起の強度に依存しない蛍光色素の局所濃度に依存しない。蛍光寿命はまた、光漂白によっても影響を受けにくい。特に、局所タンパク質濃度が細胞内の区画または領域全体で非常に不均質である可能性がある細胞内のPPIを証明することは興味深いものです。FLIM-FRETは、両方のタンパク質またはタンパク質の1つの発現レベルが低いため、複合体の濃度が低いすべての状況でも興味深いものです。
PPIの文脈では、FRETメカニズムは寿命の短縮を担当し、したがって相互作用の性質に関する情報は、平均寿命のみを考慮すると推測するのが難しい。実際、平均的な寿命の短縮は、中程度のFRETと相互作用する種の割合が高いか、アクセクサと短い距離で相互作用するドナーの低い割合と反対に起因する可能性があります。不均衡なストイチオメトリーを持つ複合体が形成されると、この状況はさらに複雑になります。複数の次元を表現できるグラフィカルな視覚化ツール (図のプロット τ1 の場...

タンパク質相互作用(PPI)は、細胞1における様々な主要プロセスを制御する。PPIの役割は、タンパク質組成、親和性機能、細胞2内の位置によって異なります。PPIは、異なる技術3を介して調査することができます。例えば、共免疫沈降法は、PPIを同定または確認するための比較的シンプルで堅牢で安価な技術です。しかし、相互作用するタンパク質の発現レベルが低い場合や、相互作用が一過性または特定の環境でのみ関連する場合は、PPIの研究は困難な場合があります。P.緑膿菌におけるピオーバージン経路の異なる酵素の間で起こるPPIを研究するには、一般的な鉄共因子リプレッサーファーの抑制が緩和され、ピオーバージン経路のすべてのタンパク質の発現が細胞4、5、6に発現することを可能にする必要がある。経路のすべてのタンパク質に対するこの一般的な調節は、それらの相互作用を促進することが期待される細胞内のタイムリーな発現をもたらす。この代謝経路のサイズ、性質、発現量およびタンパク質の数の用語の多様性は、再構成された系6における研究を困難にする。したがって、細胞環境におけるPPIの探索は、タンパク質の本来の文脈における生物学的機能をさらに理解するために重要です。
生細胞7でPPIを探索できる蛍光を含む方法はごくわずかです。測定できる異なる蛍光パラメータの中で、蛍光寿命(すなわち、蛍光色素が光子を放出する前に励起状態にとどまる平均時間)は、生きている細胞で探索する最も興味深いパラメータの1つである可能性が高い。蛍光の寿命は、その環境に非常に敏感であり、FLIMは、蛍光動物の環境に関する化学的または物理的な情報を提供することができます8.これには、蛍光「ドナー」の短い距離に位置する蛍光の「アクセプタ」の存在下で起こり得るフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)の存在が含まれる。エネルギー移動は、ドナー蛍光寿命の有意な短縮(図1A)を生細胞でタンパク質相互作用を直接探索するための強力なアプローチである蛍光生涯イメージング顕微鏡(FLIM)を作る。FLIM は、セル7、8での対話の場所に関する空間情報を提供することもできます。このアプローチは、2 つの相互作用するパートナーの蛍光標識を使用する可能性がある状況で PPI を調査する場合に非常に強力です。
FRET が発生するには - 2 つのフルオロフォア間の距離の重大な条件が必要です8,9.2つの蛍光色素は、10nm以上離れてはなりません。したがって、蛍光のドナーとアクセクサが相互作用複合体内で互いに近接位置することを確実にするために、FLIM-FRET実験を設計する際には注意が必要です。これは制約に見えるかもしれませんが、FRETの距離依存性により、FRETを受けている2つの標識タンパク質が物理的に相互作用しなければならないのは確かに本当の利点です(図1A)。したがって、共局在化実験でPPIに関する明確な回答を得ることの難しい(2つの共局化タンパク質は必ずしも相互作用しない)、FLIM-FRETを使用して問題とはなりません。
<img alt="FRET図;蛍光分光法;ドナー-アクセプター;加起発光曲線;スペクトルのオーバーラップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:FLIM-フレット解析原理FLIM-FRET多次元画像の各ピクセルには、この特定の場所で記録された蛍光減衰に関する情報が含まれています(#counts = チャネルtで検出された光子の数)。(A) FLIM イメージの古典的な表現は、通常、偽色の有効期間エンコードされた 2D イメージ (左) です。色調の変化によって見られるドナーの平均蛍光寿命の減少は、FRETの存在下で観察することができ、この空間領域におけるPPIの存在について有益である。(B)FRETが発生するためにはドナー発光スペクトルとアクソクザの吸収スペクトルとの重複が必要である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
FRETの第2の要件は、ドナーの発光スペクトルとアクセクサの吸収スペクトルが8(図1B)と重なるべきことである。ドナーの蛍光励起は、アクセクサの直接蛍光励起にほとんど寄与しない波長にあるべきである。フルオロフォアのすべての組み合わせが可能であるとは限らず、FLIM-FRET解釈を容易にするために単一指数蛍光崩壊を有するドナーを優先的に使用することを推奨する。蛍光タンパク質のいくつかのカップルは、人気のeGFP-mCherryカップル11を含むこれらの要件を満たしています(利用可能な蛍光タンパク質FRETペアのパレット上のレビューについては、12,13を参照してください)。
FLIM-FRETは、FLIM画像のすべてのピクセルでFRETドナーの蛍光寿命減衰を測定することを可能にする(図1A)。取得と分析において異なる蛍光寿命を決定する2つの主要な技術があります:周波数領域(FD)14と時間領域(TD)。.TD FLIMはより広く普及し、格子方式15、ストリークカメラ16、または時間相関単一光子計数(TCSPC)技術8を含む異なる可能な検出構成と組み合わせたパルス照明を使用して行われる。FDとTDの両方の技術では、蛍光寿命は直接測定されませんが、測定されたデータの分析を必要とし、寿命または相互作用の存在を推定する必要があります。TCSPC 手法では、最も広く使用されている分析は、残差の加重合計を最小化する最小二乗反復反復関数を使用して、単一または多重指数関数で減衰を適合させることに依存します。
最後に、FLIM-FRETは単一の光子または多光子の励起を使用して両方を行うことができる。最新の焦点面から自己蛍光および光損傷を減らすのようないくつかの利点がある。多光子励起は、厚い3Dサンプル8で作業する場合、より長い励起深さを可能にします。逆に、蛍光タンパク質の二光子吸収断面が17に制限されるため、単一光子励起は通常より効率的である。
ここでは、PPIの重要な特徴を明らかにする技術の質と堅牢性を実証するために、非常に異なる数のコピーで発現する2つの相互作用タンパク質(PvdAおよびPvdL)の特定の場合における生きたP.緑素症におけるPPIのFLIM-FRET測定のためのプロトコルを提案する。PvdAおよびPvdLタンパク質は、ピオーバージン生合成に関与しています。PvdAはL-オルニチンN5-オキシゲナーゼであり、ヒドロキシル化(PvdA)およびホルミネーション(PvdF)18によってL-オルニチンからL-N5-ホルミルN5-ヒドロキシオルニチンを合成する。PvdLは、4つのモジュールから構成される非リボソームペプチド合成(NRPS)酵素です。最初のモジュールは、ミリスティック酸のアシル化を触媒します。第2のモジュールは、L-Gluの活性化とミリスティックcoAへの凝縮を触媒します。そして、第3のモジュールは、D-Tyrで異性体化されるL-Tyrアミノ酸を凝縮する。最後に、第4のモジュールは、L-Dab(ジアミノ酪酸)アミノ酸を結合して、アシル化トリペプチドL-Glu/D-Tyr/L-Dab6を形成する。PvdLは、ピオーバージン前駆体の3つの最初のアミノ酸の合成を担う。PvdLとPvdLとのPvdAタンパク質の相互作用は、PvdIおよびPvdJとは逆に、L-N5-ホルミルN5-ヒドロキシオルニチンに特異的なモジュールを持たないとして驚くべきものです。この相互作用は、ピオーバージン前駆体生合成を担う全ての酵素が、大きな一過性および動的多酵素複合体19,20に配置されることを示唆している。
本報告では、eGFPとmCherry標識タンパク質の2つをネイティブに発現する細菌株を構築する方法を詳細に説明する。また、効率的なFLIM-FRET細胞イメージングのためのサンプル調製および条件についても説明する。最後に、複雑なFLIM-FRETデータの簡単な解釈のための高度な視覚化の可能性を提供する最近開発されたツールを含む画像解析のためのステップバイステップチュートリアルを提案する。このレポートでは、冒険的なだけでなく、ほとんどの生物学者に、FRET-FLIMはネイティブセルラー環境でPPIに関する質問に直接対処できるアクセス可能で強力な技術であることを納得させたいと思います。

<table><tbody><tr><td>525/50 nm バンドパスフィルター</td><td>F37-516, AHF, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>680 nm ショートパスフィルター</td><td>F75-680, AHF, ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム (NH4)2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA ポリメラーゼ 5U/&mu;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-coupled avalanche photo-diode</td><td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ (厚さ No. 1.5, 20&times;20mm</td><td>ニットガラス</td><td>MS0011</td><td></td></tr><tr><td>ハイフィデリティDNAポリメラーゼPhusion 2U/&mu;L</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>リソジェニーブロス (LB)</td><td>ミリポア</td><td>1.10285</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物 (MgSO4 . 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド (25回;75mm)</td><td>Knitel®ガラス</td><td>MS0057</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ゲルおよびPCRクリーンアップ</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin プラスミド</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.10</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性カリウム (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムコハク酸(二ナトリウム)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160</td><td></td></tr><tr><td>SPC画像、SPCMソフトウェア</td><td>ベッカー&Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌接種ループ</td><td>Nunc</td><td>7648-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ 1U/&mu;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>TCSPC</td><td>モジュール SPC830、ベッカー&ヒックル、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sapphire レーザー</td><td>Insight DeepSee、Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

生きた細菌におけるタンパク質とタンパク質相互作用のflim-fret測定

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

タンパク質相互作用(PPI)は、細胞内の様々な主要プロセスを制御します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)とフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)を組み合わせることで、生細胞におけるPPIに関する正確な情報を提供します。FLIM-FRETは、FLIM画像の各ピクセルにおけるFRETドナーの蛍光寿命減衰を測定することに依存しており、PPIとその空間細胞組織に関する定量的かつ正確な情報を提供します。ここでは、PPIの重要な特徴を明らかにする技術の質と堅牢性を実証するために、非常に異なるコピー番号で発現する2つの相互作用タンパク質の特定のケースで生きた シュードモナス緑膿症 でPPIを監視するために適用したFLIM-FRET測定のための詳細なプロトコルを提案する。このプロトコルは、PPI特性評価に必要なすべてのステップを詳細に記述しています - 細菌変異体構造から、複雑なFLIM-FRETデータの簡単な解釈のための高度な視覚化の可能性を提供する最近開発されたツールを使用して、最終分析まで。

異なる細菌株について測定された蛍光寿命の経験的累積分布関数(ecdf)を図8に示す。FRET が発生すると、ecdfs は短寿命に向かってシフトされます (図 8A,8B)。なお、2つのタンパク質の相互作用が2つの蛍光動物間の長距離化を生じると、FRETが発生しきれないことに注意してください(図8C)。この状況は、FLIM の 2 つのパートナー間の相互作用の欠如と区別できません。したがって、色素間距離が分子モデルまたは複合体の既知のアーキテクチャから予測できない場合は、相互作用を探査する機会を最大化するために異なる位置でタンパク質にラベルを付けることを検討することが重要です。同様に、PvdA(高発現)と非リボソームペプチド合成酵素PvdL(細胞当たり少数コピー)のタンパク質発現の差が大きいため、同じPvdA/PvdL複合体は類似のFLIM-FRETデータを生み出さない。実際、不均衡な量論はFLIM-FRETデータの解釈を複雑...

ここでは、FLIM-FRET測定を用いて、生きた 緑膿菌 中の2つの高度に異なる発現タンパク質間のタンパク質相互作用を特徴付けるプロトコルについて説明する。このプロトコルには、細菌株構造、細菌固定化、イメージングおよびポストイメージングデータ分析ルーチンが含まれます。

生きた細菌におけるタンパク質とタンパク質相互作用のFLIM-FRET測定

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRETは、疑わしいタンパク質相互作用または予測タンパク質相互作用を確認することを可能にする強力な技術です。このプロトコルでは、特に不均衡なドナーと受入者の量のデータを分析する方法を提示する。FILM-FRETは、生きた細胞内でタンパク質とタンパク質の相互作用に関する情報を直接提供することができます。特に蛍光タンパク質が内因性レベルで発現する場合、ネイティブの細胞環境における個人とタンパク質の相互作用を調べるのが重要です。P.aeruginosa、大腸菌TOP10、大腸菌ヘルパー細菌を、一晩で揺れながら摂氏30度で抗生物質なしで5ミリリットルのLBで成長させることから始めます。翌日、培養物の光学密度を測定し、1.5ミリリットルマイクロチューブにP.aeruginosa、大腸菌TOP10、大腸菌ヘルパーを同量混合します。チューブを9時に5分間、Gを300回遠心して細菌をペレット化し、その上清を捨て、LBの50マイクロリットルでペレットを再懸濁する。予熱したLB寒天に混合物のスポットをプレートし、摂氏37度で5時間インキュベートします。インキュベーションの後、滅菌接種ループでスポットを削り、LBの1ミリリットルで再懸濁します。LB寒天にこの細菌懸濁液のプレート100マイクロリットルは、1ミリリットルクロラムフェニコールあたり10マイクログラムと1ミリリットルゲンタマイシンあたり30マイクログラムを含み、大腸菌TOP10および大腸菌ヘルパー細菌を排除するために摂氏37度で2日間インキュベートする。LBの1ミリリットルに1コロニーを再中断し、4時間軌道揺れで摂氏37度でインキュベートし、9時間、300倍Gで3分間チューブを遠心分離し、950マイクロリットルの上清を捨てます。LBの50マイクロリットルでペレットを再懸濁し、スクロースと塩化ナトリウムを含むLB寒天上の混合物を分離します。プレートを摂氏30度で一晩インキュベートします。スポット LB 寒天と LB 寒天に分離されたコロニーを含む 15 ピリミシン 1 ミリグラムを含むゲンタマイシンの感度をチェックします。.顕微鏡のガラススライドを平らな水平面に置き、2層の粘着テープを貼った2枚のガラススライドを配置します。ピペット1%の70マイクロリットルの液滴をガラススライドに溶かし、4番目のスライドを上に置いてアガロース液滴を平らにする。1分ほど軽く押し下げます。上のスライドを外し、アガロースパッド上の異なる場所で3〜4つの場所に細菌の約3マイクロリットルを落とします。アガロースパッドを顕微鏡ガラスカバースリップで覆い、溶かしたパラフィンで固定し、4つのコーナーから始めてガラススライドに密封します。カバースリップを目的に向けてステージ上に顕微鏡スライドを置きます。フィルターキューブタレットを回してeGFPキューブを選択し、蛍光ランプシャッターを開けてから、蛍光灯を顕微鏡の接眼部に向けて送ります。顕微鏡ノブを使用して細菌に目的を集中させます。電動ステージを制御するジョイスティックを使用して、サンプル内の対象地域を選択します。蛍光発光経路を検出器に戻し、フィルターキューブタレットを引き返して930ナノメートルレーザーの二色キューブを選択し、レーザーパワーを20ミリワットに設定します。ガルボミラーを動作する電圧を調整し、その動きの範囲を定義する30マイクロメートルに関心領域のサイズを設定します。検出器の電源を入れ、サンプルのスキャンを開始します。コンピュータインターフェイスからステージを細かく移動して、イメージングの視野を選択します。これは、画像の新しい中心を定義する顕微鏡制御ソフトウェアで画像上の十字を移動し、移動段階を押すことによって、セットアップ上で行うことができます。取得のための良い視野は、すべての焦点で10〜30の不動細菌を含む必要があります。単一細胞のフィルム-FRETデータを抽出することに興味がある場合は、細菌が十分に個別化されていることを確認してください。イメージングソフトウェアを開き、寿命測定に影響を与える可能性のある積み重ね効果を避けるために、光子数が高すぎないことを確認します。必要に応じて、レーザー強度を下げて光子数を低く抑えます。取得収集時間を含む取得パラメータを調整します。スタートボタンを押して、取得が完了するのを待ちます。データを分析するには、RStudio を開き、新しいプロジェクトを作成します。メインプロジェクトフォルダに新しいフォルダを作成し、dataという名前を付け、すべての分析質問ファイルをこのフォルダに移動します。新しいスクリプト ファイルまたは補助スクリプト flim_analysis.r を開きます。フィルムデータ分析用の専用FlimDiagRamパッケージをインストールし、ワークスペースでパッケージを呼び出します。異なる細菌株について測定された蛍光寿命の経験的累積分布関数がここに示されている。FRET が発生した場合、関数は寿命の短い方にシフトされます。FRETは、2つのタンパク質の相互作用が2つのフルロフォア間の長距離をもたらし、相互作用の欠如と区別できない場合には発生しない点に注意することが重要です。したがって、相互作用を探査する可能性を最大化するために、異なる位置でタンパク質を標識する必要がある場合があります。PvdAとPvdLのタンパク質表現の差が大きいため、同じ複合体は同様のフィルムFRETデータを生み出しません。アンバランスのストイチオメトリーは、記録された蛍光寿命分布における結合ドナー標識タンパク質と比較して、遊離の寄与の違いにつながります。図のプロットは、ストイチオメトリーに関する重要な情報を提供するために使用できます。PvdA-eGFP mCherry-PvdL変異体では、ドナー標識PvdAの量はmCherry-PvdLの量よりもはるかに高い。サンプルに存在するすべてのドナーの中で、それらのほんの一部だけがPvdLと相互作用している。約2.3ナノ秒を中心とする単一のタウ1つの値は、各PvdA-eGFPドナーが1つのmCherry-PvdLアクセクサでしか転送できないということを示唆している。標識が逆になると、eGFP-PvdLタンパク質のほとんどは、より高いα1値によって確認されるPvdA-mCherryと相互作用することが期待される。タウ1の値は、複数のPvdAタンパク質が単一のPvdLタンパク質に結合する可能性があることを示唆するより分散された。FLIMセットアップは、増え続けるイメージング施設で利用可能になりつつあります。フィルムFRETでのイメージングサンプルは、ビデオ顕微鏡でのイメージングと同じ複雑ではありません。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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生きた細菌におけるタンパク質とタンパク質相互作用のFLIM-FRET測定

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