Name: 神経癌の生物模倣モデルが、調整可能な生体特性を有する3D環境における腫瘍-ストロマ相互作用を研究する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ 3Dバイオミメティックモデルを用いた肝細胞がんにおける腫瘍-ストロマ相互作用の研究法。調整可能な硬さを持つヒドロゲルと肝星細胞・肝がん細胞株を組み合わせ、肝がん発生メカニズムの解明に貢献します。

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この研究は、スウェーデン癌財団(Cancerfonden、CAN2017/518)、スウェーデン医学研究協会(SSMF、S17-0092)、O.E.ochエドラ・ヨハンソンズ財団、オルガ・ヨンソン財団から得られた助成金を通じて資金提供されました。 これらの資金源は、研究の設計に関与していなかった。データの収集、分析、解釈;レポートの作成。そして、出版のために記事を提出する決定に。このプロトコルで使用されるカスタム設計スペーサーの3Dプリンティングは、U-PRINT:ウプサラ大学の3Dプリンティング施設で、U-PRINT@mcb.uu.se 医学と薬学の懲戒領域で行われました。ポール・オキャラハンのプロジェクトに対する貴重なインプットに感謝します。

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig1.jpg"> 図1:3DバイオミメティックHCCモデルの作成のグラフィカルな描写<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig1large.jpg" target="_blank">は、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
注 : このプロトコルの全体的なワークフローは、図 1の図に示されています
1. フィブリノーゲンストック溶液の調製
<ol><li>1 M塩化カルシウム(CaCl2)ストック溶液を2.21 gのCaCl2の重量を量り、20 mL蒸留水(dH2O)に加えて調製します。ストック溶液は室温(RT)で保存することができます。</li>
	<li>20 mL アプロチニンストック溶液(1218.75 KIU/mL)を調製し、5 mgのアプロチニンを計量し、20 mL dH2O. アリコのストック液を 1 mL アリコートに加え、-20 °Cで保管します。</li>
	<li>80 mg/mL フィブリノーゲンのストック液を 10 mL 準備します。<ol>
<li>50 mLチューブには、7.849 mLリン酸緩衝生理食塩液(PBS)、2.051 mLアプロチニンストック(1218.75 KIU/mL)を加え、最終的なアプロチニン濃度は250 KIU/mL、100 μL CaCl 2(1M)の最終CaCl2濃度は10mmです。 </li>
		<li>フィブリノーゲンの800mgの重量を量る。</li>
		<li>ストック溶液に2%w/v NaClを含む200mgの塩化ナトリウム(NaCl)を秤量する。</li>
		<li>PBS、アプロチニンおよびCaCl2を含む50 mLチューブに、フィブリノーゲンおよびNaClを増分で加える。これはフィブリノーゲンゲル化と溶液中の塊が形成するので、激しくかき混ぜたり振ったりしないでください。</li>
		<li>フィブリノーゲンストック溶液の50 mLチューブをシェーカーの上に水平に置き、300rpmの低い設定で振ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>溶液が溶解したら、0.22 μmのシリンジフィルターまたはボトルトップフィルターを使用して、ボリュームに応じてフィルターします。重要なことに、フィブリノーゲン溶液はフィブリノーゲンを破壊するので、オートクレーブしないでください。 注:プロトコルのこの部分は、ストックソリューションの量に応じて2〜5時間かかる場合があり、この時間は実験的なセットアップ中に考慮する必要があります。</li>
</ol>2. インサートにヒドロゲルを播種する前にコラーゲンを入れ物にコーティングする
<ol><li>薄層流れフードまたは組織培養フードでは、殺菌されたピンセットを使用して、プレートからインサートを取り除き、プレートの蓋に反転させます。</li>
	<li>25 mLの氷酢酸を25 mLのdH2Oに加え、0.22 μmのシリンジフィルターを使用して溶液をフィルター処理して、100 mLの最終体積に調整して、20 mMの氷酢酸ストック液を100 mL調製します。ストックソリューションはRTに保存できます。</li>
	<li>5 mg/mLコラーゲン溶液から2mLの100 μg/mLコラーゲン溶液を、2.2で調製した20mMの氷酢酸ストック溶液の1.960 mLに40 μL添加して調製します。</li>
	<li>100 μL の溶液を各インサートにピペット処理して、2.3 で調製した 100 μg/mL コラーゲン溶液でインサートをコーティングします。ラミナーフローフードまたは組織培養フード内で空気を 2~3時間乾燥させます。</li>
	<li>一度挿入物は、PBSで3倍の各インサートを乾燥洗浄した。12ウェルプレートの各ウェルにPBSの1mLを追加し、ウェルに下向きのコラーゲンコーティングでインサートを置き、井戸からPBSを取り除き、手順を繰り返します。層流フード1〜2時間内に空気を乾燥させておきます。 注意:酢酸は細胞に有毒であり、挿入物はPBSで十分に洗浄する必要があります。</li>
	<li>挿入物の上にカスタム3Dプリントスペーサーを追加し、これはゲルがプレートの底部ウェルに触れないように挿入物からぶら下がったら必要になります(図2)。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig2.jpg"> 図2:カスタム3Dプリントスペーサ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="7"><li>逆のインサートをプレートの下部で覆い、細胞がヒドロゲルに埋め込まれ、シードの準備ができるまでインキュベーターに入れられます。</li>
</ol>3. インサートにヒドロゲルに埋め込まれた細胞を播種する
注: 表1 は、調製されるフィブリノーゲンの様々な濃度を有する3つの製剤の説明を提供する。製剤1は、線維症の発症時に肝臓に対応し、2つの肝硬変および3つのHCC、これらの製剤の各々に対する剛性値をプロトコル最適化中にレージロジーで決定した。
<table border="1" fo:font-size="6px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>定式 化</td>
			<td>最終フィブリノーゲン濃度(mg/mL)</td>
			<td>最終コラーゲン濃度(mg/mL)</td>
			<td>細胞(LX2+ヘプG2共培養1:1)</td>
			<td>肝臓のステージ</td>
			<td>文献肝臓剛性値 (kPa)</td>
			<td>モデルの剛性値(kPa)</td>
			<td>定式 化</td>
			<td>追加するフィブリノゲン (mL)</td>
			<td>追加するコラーゲン (mL)</td>
			<td>10% DMEM (mL)</td>
			<td>トロンビン (μL)</td>
			<td>
参照s</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 細胞/mL</td>
			<td>線 維 症</td>
			<td>≥2</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4</td>
			<td>28;29;30</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 細胞/mL</td>
			<td>肝硬変</td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>2</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.45</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
			<td>2 x 106 細胞/mL</td>
			<td>Hcc</td>
			<td>≥10</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
			<td>0.25</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1</td>
			<td>28;31;32</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:インサートにヒドロゲルに埋め込まれた細胞を播種するための製剤の説明
<ol><li>1 M水酸化ナトリウムのストック液を、3.99 gの NaOH を 100 mL の dH2O に加えて調製します。 このソリューションは、0.22 μmのシリンジフィルターを使用してフィルタリングできます。RTにストックソリューションを保存します。</li>
	<li>5 mg/mL コラーゲンと1M NaOHの10 mLを氷の上に置きます。</li>
	<li>50 mL PBS、15 mL トリプシン、70 mL 10% DMEM、およびフィブリノーゲンストック溶液を、セクション1で調製し、水浴中で20分間37°Cに予熱します。</li>
	<li>細胞懸濁液を準備します。<ol>
<li>T175培養フラスコで肝細胞(LX2)および肝臓癌(HepG2)細胞を10mLのPBSで2回洗浄します。</li>
		<li>トリプシンは、37°Cで4分間、6 mLトリプシンで細胞をトリプシン化する。</li>
		<li>10%DMEMの6 mLでトリプシンを不活性化します。</li>
		<li>300 x gで 3 分間、15 mL チューブと遠心分離機でセル懸濁液を回収します。</li>
		<li>遠心分離後、上清を吸引し、各細胞株を10%DMEMの5mLで再懸濁する。</li>
		<li>自動セルカウンターを使用してセルをカウントする:各セルサスペンションの10 μLを計数チャンバースライドに加え、スライドをセルカウンターに挿入します。セル数はセル/mLとして表示されます。</li>
		<li>ステップ3.4.6の細胞数を使用して、各細胞株の細胞を1mLあたり1 x 106 細胞に希釈し、明らかにマークされた15 mLチューブにします。300xgで3分間の希釈を遠心分離 する。
</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離後、表1に従って上清を吸引し、各15mLチューブに10%DMEM を加え、表に記載された値は各製剤の2mLに対してである。</li>
	<li>コラーゲンの量を10μL/mL NaOH(1M)で中和し、中和したコラーゲンを細胞懸濁液に加え、存在する10%DMEMが黄色に変わり、カットチップでピペット化して十分に混合すると明るいピンク色になります。</li>
	<li>表1に記載のコラーゲン細胞懸濁液にフィブリノーゲンを加え、カットピペットチップを使用し、懸濁液を十分に混合する。</li>
	<li>最後に、コラーゲン-フィブリノーゲン細胞懸濁液にトロンビンを加え、フィブリノーゲンの各10mgごとに0.1 KIUトロンビンを加える。</li>
	<li>セクション2で準備した事前被覆インサーをインキュベーターから取り出し、カット200 μLピペットチップを使用して、準備された懸濁液のピペット200μLを指定されたインサートに取り出します。ラミナーフローフード内でゲルを15分間クロスリンクします。</li>
	<li>15分後、プレートの底部をゲルの上にそっと置き、インキュベーターに移して、ゲルを37°Cで45分間クロスリンクさせます。</li>
	<li>ゲルがクロスリンクされたら、挿入物を再び反転し、プレートの各底部ウェルに2 mLの10%DMEMを加えます。</li>
</ol>4. 内皮細胞の播種
<ol><li>25 mLハンクバランス塩溶液(HBSS)、10 mLトリプシン、10 mLトリプシン阻害剤および50 mL内皮成長培地を、水浴中で20分間37°Cに予熱する。</li>
	<li>内皮(HUVEC)細胞懸濁液を調製する。<ol>
<li>10 mL HBSSで2回T175培養フラスコでHUVEC細胞を洗浄します。</li>
		<li>トリプシンは、37°Cで4分間、6 mLトリプシンで細胞をトリプシン化する。 6 mL トリプシン阻害剤でトリプシンを不活性化します。200 x gで 3 分間チューブと遠心分離機の 15 mL でセル懸濁液を収集します。</li>
		<li>遠心分離後、上清を吸引し、5mL内皮増殖培地で細胞を懸濁させた。</li>
		<li>3.4.6 で説明したとおりに、セルの自動カウンタを使用してセルをカウントします。</li>
		<li>細胞カウンターからの細胞数を使用して、内皮増殖培地で1.0 x 104 細胞/mLの播種密度を調製する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>HUVEC細胞懸濁液の種子500 μLは、挿入部の上部の各ウェルに入れ、挿入ごとに5.0 x 103 セルの最終容積を有します。</li>
</ol>5. メンテナンス
<ol><li>2日ごとに成長培地を交換し、吸引はウェルとインサートの両方から成長培地を使用した。HUVEC細胞を含むインサートに、ゲルを含むウェルに2 mL 10%DMEMを加え、0.5 mL内皮増殖培地を添加します。</li>
	<li>実験前の21日間、モデルを維持します。</li>
</ol>6. レロジー
<ol><li>ゲル製剤の貯蔵弾性率を測定して、リメーターを使用して剛性値を示し、0.267%および37°Cで0.1〜20 Hzの周波数スイープを行い、直径8mmの平行プレートステンレス鋼形状を使用して0.1Nの一定の軸力を有する。</li>
</ol>7. 生存率と薬剤反応
<ol><li>2Dの共同培養および3Dモデルにおける薬剤の反応と生存率を決定する。<ol>
<li>播種 HepG2 (5.0 x 103 細胞/mL) および LX2 (5.0 x 103 細胞/mL) 1:1 の比率で 2D 共培養 1:1 の比率で、1.0 x 104 細胞/mL の播種密度で黒い透明底 96 ウェルプレートにシードします。 セルを一晩で接続できるようにします。</li>
		<li>剛性値が 6 kPa の肝硬変環境に対応するように 3D モデルを設定します。 ドキソルビシン処理前の21日間、モデルを維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ドキソルビシン処理の2時間前に、培養培地を2Dおよび3Dモデルの両方から吸引する。両方のモデルをPBSで2回洗います。2D共培養液(ウェルあたり200μL)と3Dモデル(インサートにヒドロゲルを含むウェルに2 mL、インサートに500 μL)に飢餓培地(DMEMに1/v抗ミコティック抗生物質溶液を添加)を加えます。</li>
	<li>ドキソルビシンを2Dと3Dモデルの両方に投与します。 投与量は以下の通り、IC25、50および75の値にそれぞれ対応する0.5、1および1.5mMである。 72時間の両方のモデルを扱います。 注:トキソメラーゼII阻害剤であるドキソルビシンは、HCCに使用される最初の化学療法薬の1つであり、HCC 33,34の治療において最も活性な化学療法薬の1つでもあります。</li>
	<li>72時間後、2Dおよび3Dモデルの両方から培養培地を吸引した。残りの培養培地は、両方のモデルをPBSで2回洗浄して除去するようにしてください。</li>
	<li>メーカーの推奨事項に従ってAlamarBlueを準備し、2Dと3Dモデルの井戸に追加します。2D培養用のウェルあたり150μL、ウェルあたり2 mL、3D培養用インサートあたり500 μLを加えます。 37°Cで一晩インキュベート。</li>
	<li>3Dセットアップの各ウェルからAlamarBlueの150 μLを黒いクリアボトム96ウェルプレートに移します。AlamarBlueは2Dモデルのプレートから直接読み取ることができます。</li>
	<li>励起波長と発光波長485と550nmのマイクロプレートリーダーで蛍光を読み取ります。</li>
	<li>次の式を使用して、両方のモデルでセルの生存率の割合を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61606/61606eq1.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、HCCのバイオミメティックモデルを作成する方法の開発について説明します。明確なワークフローが確立され、重要な手順が特定されました。これらの重要なステップには、フィブリノーゲンストック溶液の調製、コラーゲンでの挿入物のコーティング、ヒドロゲルに埋め込まれた細胞の播種が含まれる。フィブリノーゲンストック溶液の調製中に、より高い濃度でより小さな増分でフィブリノーゲンを添加することが重要です。これはフィブリノーゲンが溶解するのにかかる時間を減らすだけでなく、 図11に見られるようにフィブリノーゲンが一貫性がなく、早期にゲル化するのを防ぐ。フィブリノーゲンゲルの調製にはかなりの時間がかかり、これは全体的な実験の成功に影響を与える可能性があります。結果は、フィブリノーゲンゲルが一貫してゲル化し始めると、それを廃棄するのが最善であることを示しています。インサートは、コラーゲンでコーティングし、PBSで洗浄し、ヒドロゲルに埋め込まれた細胞を播種する前に層流フード内で乾燥する必要があります。挿入物が乾燥していることを確認しないと、インサートの端にヒドロゲルがこぼれ落ち、ゲルが不均一になります。ゲルの不均一性は、最終的に拡散が要因である結果に影響を与えます。
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig11.jpg"> 図11:フィブリノーゲン/コラーゲンヒドロゲル製剤用フィブリノーゲンゲルの調製(A)塊を形成し、チューブに付着した未溶解のフィブリノーゲンで早期にゲル化し始めたフィブリノーゲンゲル溶液。(B)完全に溶解したフィブリノーゲンゲル溶液は、溶液が透明で、やや粘性である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
フィブリノーゲン成分はトロンビンを添加して架橋し始めるので、ヒドロゲル細胞懸濁液を挿入物に播種しながら、できるだけ速く作業することをお勧めします。 より高い濃度でゲル懸濁液を使用する場合は、一度に小さな作業量を準備して、シード時にゲルが架橋するのを防ぎます。後者は、分布と各ウェルに播種ゲルの量に影響を与えます。コンポーネントを追加する順序は重要であり、このプロトコルではゲルが途中で架橋するのを防ぐための合理化されたワークフローを提供しました。 カットピペットチップで作業するヒドロゲルのサスペンションの粘度に起因し、混合および測定中に助言されます。 懸濁液を混合する際には、均質な懸濁液を作成するために、これを迅速かつ均等に行うことを確認してください。不均一な混合は結果に悪影響を与える不均一なゲルをもたらす結果、 図 12を参照してください。
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig12.jpg"> 図12:12ウェルプレートに播種したコラーゲン/フィブリノーゲンゲル。 2mg/mLコラーゲンを含む200 μLの体積で播種されたすべてのゲルと2.0 x 106 細胞/mLの20 mg/mLフィブリノーゲン。(A)異種の一貫性を有するヒドロゲルゲル、ヒドロゲルの目に見える不均一な分布。(B)ヒドロゲルを均一に混合する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig12large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
プロトコルの最適化に続いて、モデルを評価して、モデルの生物物理特性を決定した。表層データは、生理学的に関連する細胞外マトリックス成分すなわちコラーゲンI型およびフィブリノーゲンから構成される我々のモデルが、線維性、肝硬変およびHCC肝臓28、29、30、31、32の生物物性を模倣できたことを示した。HCCの3Dモデルで肝臓の剛性を再現することは非常に重要であり、モデル開発中に見落とされることがよくあります。増加した肝臓の剛性は、HCC38内の化学療法抵抗性、増殖、移動、および休眠に関連する。HCCにおける肝星状細胞の活性化は細胞外マトリックス剛性の増加に関連しているが、これらの肝星状細胞に関連するいくつかのシグナル伝達経路はメカノ感受性39を示す。
HCCの3Dモデルの開発における肝星状細胞および内皮細胞のような間質関連細胞の包含は、ますます関連性が高まっている。研究は、肝ステル酸およびHCC細胞からなる多細胞スフェロイドが化学療法抵抗性および侵襲的移動を増大させ、生体内でHCC腫瘍の出現を模倣しながら、PXTマウスモデルおよびヒトHCC組織サンプル17と比較することを示している。2017年、Jungららによる同様の研究では、肝細胞癌(Huh-7)および内皮(HUVEC)細胞からなる多細胞スフェロイドが血管化および攻撃性を促進することを発見した。これらのスフェロイドは、フー7単一培養スフェロイド22と比較した場合、ドキソルビシンおよびソラフェニブの有意に高い濃度で生存率を示した。HCCに相当する剛性値と、間質関連細胞(LX2およびHUVEC)の含み合いによるドキソルビシンに対する我々のモデルの生存率と応答の評価は、2D共培養モデルと比較して化学療法薬に対する反応で同様の減少を示した。 したがって、患者および他の3D HCCモデルにおいて典型的に見られる薬剤耐性を効果的に模倣する。
これはモジュラー系であるため、ラミニンおよびヒアルロン酸という他の細胞外マトリックス成分の添加によってモデルを強化することができる。あるいは、このモデル内で使用される現在のヒドロゲルは、アルギン酸ナトリウムまたはキトサンなどの合成ヒドロゲルによって置き換えることができる。現在のモデルにさらなる変更は、細胞株を一次細胞培養物と置換して、さらに生理学的に関連するモデルを作製するか、または他の腫瘍および間質細胞株の組み合わせを用いることができる。
このように、HCCにおける腫瘍間質相互作用を研究するための調整可能な生体物理特性を持つ3Dモデルの開発に成功しました。 我々は、ドキソルビシンに応答して従来の2D培養物と比較すると、インビボの状況をより代表するモデルであることが判明した。しかし、まだやるべきことはたくさんありますが、このモデルを広範囲に特徴付け、研究HCCに残っているより複雑で差し迫った質問に答えるために可能な転移プラットフォームとしてモデルを探求したいと考えています。

肝細胞癌(HCC)は、原発性肝癌1,2の90%を含む。毎年810,000人の死亡と854,000人の新しい症例が報告されており、現在、死亡率1の最も高い発生率の1つで、世界で5番目に一般的な癌としてランクされています。HCCの開発は、主に慢性肝疾患に関連する炎症、すなわち、ウイルス性肝炎、慢性過多アルコール摂取、メタボリックシンドローム、肥満および糖尿病1、3、4に起因する。 これらの病的状態に関連する炎症は、肝細胞損傷および線維化を開始する肝星状細胞および炎症細胞を活性化し、リクルートする様々なサイトカインの分泌をもたらす5。肝星状細胞は、肝線維症の開始、進行、および退行における重要な役割で知られています。活性化すると、収縮、炎症促進および原線維性の特性6、7、8を有する細胞のような筋線維芽細胞に分化する。得られた線維化は、細胞外マトリックスリモデリング酵素活性の調節不全を引き起こし、成長因子の分泌を伴う全体的な剛性の増加を特徴とする環境を作り出し、これがHCC病態9,10にさらに寄与する。これは、肝細胞と間質環境との間のこの連続病原性フィードバックループであり、癌開始、上皮間葉転移(EMT)、血管新生、転移電位、および改変薬物応答11、12、13を燃料とする。 腫瘍と腫瘍のミクロ環境との相互作用の観点から肝発癌に関する洞察は、したがって、機械論的なだけでなく、治療の観点からも非常に重要である。
2次元(2D)インビトロ細胞培養モデルは、主に癌細胞生物学者14の80%によって使用されている。しかし、これらのモデルは真の腫瘍微小環境を代表するものではなく、化学療法応答に影響を及ぼす14、15、16である。現在、化学療法薬の96%が臨床試験中に失敗する14. この高い薬剤消耗率は、in vitro事前スクリーニングモデルが、HCCの複雑さと微小環境16に関する我々の現在の洞察と理解を完全に表していないという事実に起因する可能性がある。逆に生体内で、ヒト16,17と比較した場合、免疫系が損なわれ、腫瘍と微小環境との相互作用の不一致を有する動物モデルが存在する。動物実験から得られた結果の平均8%のみにおいて、臨床前臨床から臨床設定16、17に確実に翻訳することができる。したがって、HCCの評価には、腫瘍だけでなく微小環境の複雑さを効果的に再現するin vitroプラットフォームの開発が必要であることは明らかです。プラットフォームは、現在利用可能なin vitro前臨床スクリーニングモデルを補完し、将来的に動物研究の量を減らすだろう7,14.
そのようなプラットフォームの1つは、高度な3次元(3D)細胞培養モデルです。HCCを研究するためのこれらの高度な3Dモデルの多数が過去10年間に出現し、様々なレビューが発表されました。HCCを研究するために利用可能な3Dモデルには、多細胞回転楕円体、オルガノイド、足場ベースのモデル、ヒドロゲル、マイクロ流体、およびバイオプリンティングが含まれます。このうち、多細胞スフェロイドは、腫瘍の開発の研究で使用される最も有名なモデルの1つです。スフェロイドは、低い技術的難易度を持つ安価なモデルであると同時に、生体内腫瘍アーキテクチャ18、19、20で効果的に模倣する。多細胞スフェロイドは、HCC17、21、22に関する豊富な情報に貢献してきました。しかし、多細胞スフェロイドが7〜48日間培養中に保たれているため、標準化培養時間が不足している。培養時間の増加は非常に重要です。アイレンベルガーは、スフェロイド年齢の差が深く影響を及ぼすことを発見しました(肝臓癌の治療に使用されるキナーゼ阻害剤)拡散性および毒性23。ウルゼシンスキーとフェイは、3D肝細胞スフェロイドがトリプシン化後に主要な生理学的肝機能を再確立するのに18日を要し、この回復24、25後最大24日間安定した機能を発揮し続けることを発見した。
より高度な3D HCCモデルのいくつかは、ヒト脱細胞化肝臓足場およびバイオプリント足場の使用を含む。マッツァたちは、移植に適さない脱細胞化ヒト肝臓を用いたHCCモデリング用の天然3D足場を作成した。これらの天然足場は、コラーゲンI型、III型、IV型、フィブロネクチンなどの主要な細胞外マトリックス成分の発現を維持しながら、肝ステル酸細胞と肝芽細胞細胞の共培養で21日間正常に再移植することができました。疾患モデル以外にも、このモデルは機能性臓器移植や前臨床薬および毒性スクリーニング26の利点を提供する。3Dバイオプリンティングの進歩に伴い、3D細胞外マトリックス足場もバイオプリントできるようになりました。 Maたちは、細胞外マトリックス27からヒドロゲルエンジニアを用いた可変的な機械的特性およびバイオミメティックマイクロアーキテクチャを有するバイオプリント細胞外マトリックス足場を研究している。間違いなくこれらはすべて優れた3D HCCモデルです。しかし、人間の肝臓の利用不能と必要な機器や材料の取得に伴うコストは、これらのモデルを不利に置きます。さらに、これらの方法はすべて技術的に高度であり、すべての研究者が容易に利用できるとは思えない広範なトレーニングを必要とします。
HCCの複雑性と現在利用可能な3Dモデルをベースに、包括的な3D HCCモデルの開発に努めました。調整可能なヒドロゲルの剛性値を組み込むことにより、前悪性と腫瘍微小環境の両方を再現できるモデルを目指しました。 さらに、HCCの病因に重要な役割を果たす肝細胞およびストロマ関連細胞株も含めた。これらには、内皮細胞、肝細胞および悪性肝細胞が含まれ、生理学的に関連するヒドロゲルからなる微小環境で増殖する。選択されたヒドロゲル、コラーゲンタイプIおよびフィブリノーゲンと共に、HCCの開始および進行の間に肝臓の剛性に見られる生体物理的変化に匹敵する比率で組み込まれる。 また、長期間にわたって文化に残すことができるモデルを目指しました。基本的な設備、最小限のトレーニングと経験、容易に入手可能な材料で設定できるモジュラーでコスト効率の高いモデルを構想しました。

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue (レサズリンナトリウム塩)</td><td>Sigma</td><td>211-500</td><td>製造業者の推奨に従って調製</td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌溶液 (100回;)、安定化</td><td>シグマ</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>アプロチニンプロテアーゼ阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>78432</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム (CaCl2)</td><td>シグマ</td><td>C1016-2.5KG</td><td>無水、粒状、&le;7.0ミリメートル、&ge;93.0%</td></tr><tr><td>CO2インキュベータ</td><td>ーKebo Biomedスウェーデン</td><td></td><td></td></tr>コー<tr><td>ニングブラック、クリアフラットボトム96ウェルプレート</td><td>シグマ</td><td>CLS3904-100EA</td><td></td></tr><tr><td>コーニングHTSトランズウェル-24ウェル透過性サポート</td>シ<td>グマ</td><td>CLS3396-2EA</td><td>HTSトランズウェル-24ユニットw / 0.4 &mu;m 細孔ポリカーボネートメンブレンおよび6.5 mmインサート、TC処理済み、滅菌済み、2/cs</td></tr><tr><td>Discovery Hybrid Rheometer 2</td><td>TA装置、ソレンツナ、スウェーデン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAXサプリメント(LX2およびHepG2細胞)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>61965059</td><td>10% v/v FBSおよび1% v/v抗生物質抗真菌溶液</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地(500 ml)(HUVEC)</td><td>Cell Applications, Inc</td><td>211-500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、ワンショット形式、ニュージーランド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A3160902</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血漿からのフィブリノーゲン I-S</td> 型 <td>シグマ</td><td>F8630-10G</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar オメガ プレート リーダー</td><td>BMG ラボテック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンクスの平衡塩溶液</td><td>シグマ</td><td>H9394-500ML</td><td>改質、重炭酸ナトリウム、塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムなし</td></tr><tr><td>ラボジーン scanspeed 416 遠心分離機</td><td>ラボジーン、スウェーデン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>Kebo Biomed スウェーデン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メトラー・トレド AG245 分析天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコン TMS 光学顕微鏡</td><td>ニコン、日本</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝剤生理食塩水錠剤</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>メーカーの推奨に従って調製</td></tr><tr><td>ラットテールコラーゲン I 型 5 mg/mL</td><td>イビディ</td><td>50201</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td> <td>Σ</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td> <td>メルク</td><td>B619298</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC20 セルカウンターウ</td><td></td>シ血漿シグマT9549パウダーからのスライドBioRad<td></td><td></td></tr>トロン<tr><td>ビン</td><td></td><td></td>をカウントし<td>、細胞培養に適しています。1,500 NIH単位/mgタンパク質(E1%/280 = 19.5)</td></tr><tr><td>トリプシン(2.5%)10倍</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td>グリシンmax(大豆)<td></td></tr><tr><td>シグマ</td><td>T6414-100ML</td><td>溶液、滅菌ろ過</td>済みPBS<td>トリプシン阻害剤</td></tr>で1倍に希釈</tbody></table>

神経癌の生物模倣モデルが、調整可能な生体特性を有する3d環境における腫瘍-ストロマ相互作用を研究する

A Biomimetic Model for Liver Cancer to Study Tumor-Stroma Interactions in a 3D Environment with Tunable Bio-Physical Properties

肝細胞癌(HCC)は、慢性肝疾患の後に発症する原発性肝腫瘍である。慢性肝疾患や炎症は、肝発癌を積極的にサポートし、駆動する線維化環境につながります。腫瘍間質マイクロ環境と腫瘍細胞との相互作用の観点から肝発癌に関する洞察は、このように非常に重要である。3次元(3D)細胞培養モデルは、現在のin vitro 2D細胞培養モデルとin vivo動物モデルとの間の欠落リンクとして提案されている。私たちの目的は、繊維間質コンパートメントと血管構造を伴う新しい3DバイオミメティックHCCモデルを設計することでした。コラーゲンおよびフィブリノーゲンなどの生理学的に関連するヒドロゲルを組み込んで、腫瘍ECMの生物物性を模倣した。このモデルでは、ヒドロゲルマトリックスに埋め込まれたLX2およびHepG2細胞を、倒膜貫通インサートに播種した。HUVEC細胞を次いで、膜の反対側に播種した。細胞を埋め込んだECM-ヒドロゲルからなる3つの製剤を調製し、生物物性をレガロジーによって決定した。細胞生存率は、21日間にわたる細胞生存率アッセイによって決定した。化学療法薬ドキソルビシンの効果は、2D共培養と我々の3Dモデルの両方で72時間の間評価した。レロジーの結果は、線維性、肝硬変およびHCC肝臓の生物物理学的特性が正常に模倣できることを示している。全体として、この3Dモデルは従来の2D培養物と比較してin vivoの状況をより代表的に示しています。我々の3D腫瘍モデルは、HCC患者に典型的に見られる薬剤耐性を模倣する化学療法薬に対する応答の低下を示した。

濃度範囲とシード体積 図 3に示した概略図に従って、最終的な機能プロトコルを取得するためのプロトコル最適化が行われた。2つの生理学的に関連するヒドロゲル、コラーゲンタイプIおよびフィブリノーゲンは、文献探索35、36によって同定された。 ラットテールコラーゲンタイプIから、濃度の範囲(4、3、2および1mg/mL)を反転インサートに播種し、再び反転した後に挿入物に正常に付着する能力を決定しました。この範囲内のすべての濃度はゲルを形成することができたが、コラーゲンゲルは平坦化したように見え、取り扱いやピペット処理のために様々な気泡が閉じ込められていた、図4および図5を参照してください。コラーゲンゲルの品質を向上させるための最適な播種体積を決定するために、様々なシードボリューム(100、150および200μL)を、反転インサートに播種した、図5参照。 播種体積は、ゲルの外観またはゲル内の気泡の存在に影響を与えなかった。したがって、200 μLが最適なシード量で、最もフルなゲルを生成することが決定されました。フィブリノーゲンはまた、長期間にわたって挿入物に付着することができるゲルを生成する能力のために評価されました. 濃度範囲(70,50,40,30,20,10,5,1mg/mL)を調製し、12ウェルプレートの蓋に200μLの体積で播種した、図6を参照)。播種後20分以内に、全ての濃度がゲルを形成することができました。しかし、ゲル形成物が一貫性のある流体を有し、37°Cで一晩保たれた後に蓋から剥離し始めていたため、濃度5および1mg/mLは除外された。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig3.jpg"> 図 3: プロトコルの最適化の概略図<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig4.jpg"> 図4:コラーゲンゲル4mg/mLは、ゲル中に存在する気泡を示すインサートに1.0 x 105 細胞/mLを種付けした。 左側のインサートは氷の上で15分間脱気され、右側のインサートは脱気されていません。脱ガスはゲル中に存在する気泡に何の影響も与えなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig5.jpg"> 図5:コラーゲンゲル4 mg/mLは、様々な体積でインサートに1.0 x 105細胞/mLを播種した。(A)左100μL、中央150μL、右200μLに挿入し、シード直後に挿入します。ゲル中の泡はまだ存在していた。(B)60分の架橋後、左200μL、中央150μL、右100μLに挿入します。ボリュームに関係なく、すべてのゲルはまだ平らに見えます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig6.jpg"> 図6:フィブリノーゲン(200μL)の濃度範囲で、12ウェルプレートの蓋に播種した70mg/mLの範囲。(A)シード後に直接ゲル化。(B)ゲルを播種後20分。(C)ゲルは一晩保管した。すべてのゲルは丸みを帯びているように見え、5mg/mLおよび1mg/mLゲルは播種後20分以上の流体一貫性を有するように見え、一晩保たれた後に蓋から剥離し始めていたので除外された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
コラーゲンとフィブリノーゲンの併用 コラーゲンとフィブリノーゲン濃度範囲からの結果に基づいて、コラーゲンとフィブリノーゲンを組み合わせた効果を評価した。3つのインサートを以下に設定し、4 mg/mLコラーゲン、20mg/mLフィブリノーゲン、1:1のコラーゲン(4mg/mL)およびフィブリノーゲン(20mg/mL)を1:1に設定した、 図7を参照してください。ヒドロゲルを播種した直後、コラーゲンを含むインサートは、ゲル内の気泡の発生と組み合わせた平坦な外観を有することを観察した。フィブリノーゲンのインサートは、完全かつ丸みを帯びたゲルを作り出し、コラーゲンとフィブリノーゲンの組み合わせでインサートを作り出しました。37°Cで60分間架橋した後、全てのゲルをインサートに取り付け、37°Cで一晩インキュベーションした後も付着したままであった。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig7.jpg"> 図7:コラーゲンとフィブリノーゲンの併用効果(A)コラーゲン4 mg/mLを左にインサートに種付けし、フィブリノーゲン20mg/mLを真ん中にインサートし、コラーゲン4mg/mLに播種し、フィブリノーゲン20mg/mL(1:1)を右にインサートにシードする。1.0 x 105細胞/mLを含む200 μLの体積で播種されたすべてのゲルは、37°Cで60分間架橋した(B)コラーゲン4mg/mL60分を架橋した後、ゲルは平らに見え、気泡を有していた。(C)左フィブリノーゲンに20mg/mLを挿入し、ゲルは丸く見え、気泡は存在しない、右コラーゲンに挿入4mg/mL、フィブリノーゲン20mg/mLゲル、ゲルは泡なしでよく丸められる。(D)コラーゲン4mg/mLゲルを37°Cで一晩保った後、まだ多量の気泡を含むゲル、ゲルの腫れが生じた。(E)フィブリノーゲン20mg/mLを37°C(F)コラーゲン4mg/mL、フィブリノーゲン20mg/mLゲルを37°Cで一晩保管<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig7large.jpg" target="_blank">してください。</a>
細胞のシード密度の決定 ヒドロゲルを用いた作業の経験に基づいて、最適な細胞播種密度(図示しないデータ)37を決定する実験を行った。細胞は、次の濃度範囲(7.5 x 105、8.5x 10 5、9.5 x 105、1.0x 106、1.0x 10 6細胞/mL)のコラーゲンとフィブリノーゲンの組み合わせに埋め込まれ、2.0 x 106細胞/mLが最適な播種密度であることが判明した。
レオロジー フィブリノーゲンとコラーゲンヒドロゲルの組み合わせの10の製剤は、レロジーによって評価した、表2を参照してください。目的は、これらの製剤のどれがHCCの開発中に見られる肝臓の剛性を模倣することができるかを決定することであった。文献は、ラット、マウスおよびヒトに対して既知の肝臓剛性値を線維化、肝硬変およびHCCおよびHCCの間に提供し、これらの値28、29、30、31、32にできるだけ近づけることを目的とした。表2に記載した10の製剤を三重で調製し、それぞれの貯蔵弾性率を、レオメータを用いて決定した、図8に示す結果。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>定式 化</td>
			<td>フィブリノゲン (mg/ml)</td>
			<td>コラーゲン(mg/ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>60</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>40</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>20</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:関節の値を決定するために、様々な濃度のコラーゲンとフィブリノーゲンの組み合わせ
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig8.jpg"> 図8:関節の硬直度は、様々な濃度のコラーゲンとフィブリノーゲンの組み合わせに対して、関節法で評価した。 貯蔵弾性率と損失係数は、ディスカバリーHR-2ハイブリッドリオメーター(n =3、誤差バー=SD)を用いて37°Cおよび1Hzで測定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig8large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
これらの10の式から3が進むために選ばれました。これらには、線維症の発症時の肝臓の剛性値に対応する2mg/mLコラーゲンタイプIおよび10mg/mLフィブリノーゲン、2mg/mL型I型および肝硬変に対応する30mg/mLフィブリノーゲンおよびHCCに対応する2mg/mLコラーゲンタイプIおよび40mg/mLフィブリノゲン が含まれていた。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig9.jpg"> 図9:続けるために選択された様々なフィブリノーゲン/コラーゲンヒドロゲル製剤のヒドロゲル剛性値。 貯蔵弾性率と損失係数は、37°Cおよび1Hz(n=3、誤差範囲=SD)で決定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig9large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
生存率、薬剤応答および転移性 AlamarBlueアッセイの結果は、2D共培養中の全体的な細胞生存率の低下を示し、既知の報告されたIC 25、50および75の値に基づいて予想よりも低く、未処理の対照と比較した場合、 図10を参照してください。これは、ドキソルビシン治療に対してより敏感である我々の共培養におけるLX2細胞に起因する可能性がある。しかし、私たちの3Dモデルでは、ドキソルビシン耐性の増加に気づき、3Dモデルシステムでよく見られる化学療法の可能性の低下を確認しました。対照と比較して統計的有意性を学生T検定(両側)を用いて評価し、P&lt;0.05は有意であると考えた。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61606/61606fig10.jpg"> 図10:72時間の様々な濃度でドキソルビシンを処理した後の3Dモデルと比較した2D共培養モデルの細胞生存率の割合。 未処理のコントロール (n = 3、エラー バー = SD) に対して正規化された結果 (* = p&lt;0.0001)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61606/61606fig10large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ゲル構築物を、ヒドロゲルの異なる濃度内で細胞増殖に従う光顕微鏡を用いて毎日目視検査を行った。7日目から細胞は、均質でコンパクトな方法でヒドロゲルを満たし、7日目からマトリクス内で組み立て始めた。

このプロトコルは、繊維質間質コンパートメントを伴う3Dバイオミメティックモデルを提示する。細胞間相互作用、腫瘍増殖および転移の活性メディケーターである細胞外基質の生物物性を模倣した比率で生理学的に関連するヒドロゲルを調製した。

神経癌の生物模倣モデルが、調整可能な生体特性を有する3D環境における腫瘍-ストロマ相互作用を研究する

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a primary liver tumor developing in the wake of chronic liver disease. Chronic liver disease and inflammation leads to a ...

このモデルは、調整可能な剛性を持つ生理学的に関連するハイドロゲルと肝細胞および間質関連細胞株を組み込むことにより、前悪性および腫瘍微小環境の両方を再現します。このモデルはモジュール式で費用対効果が高く、基本的な機器とすぐに入手できる材料で準備でき、複雑な腫瘍間質相互作用の研究に使用できます。この腫瘍-間質相互作用モデルは、肝発がんに関する洞察を提供することができます。そして、これはメカニズムの視点と治療の視点の両方にとって非常に重要です。Carlemi Calitzによる手順のデモンストレーションは、Angstrom研究室の博士課程の学生であるJenny Rosenquist氏です。10ミリリットルあたり80ミリグラムのフィブリノーゲン原液を調製するには、まず2.21グラムの塩化カルシウムと5ミリグラムのアプロチニンを個々の20ミリリットルの蒸留水に加えます。次に、2.051ミリリットルのアプロチニン原液と100マイクロリットルの塩化カルシウム原液を7.849ミリリットルのPBSに加えます。次に、攪拌や振とうをせずに、800ミリグラムのフィブリノーゲンと200ミリグラムの塩化ナトリウムを溶液に段階的に加え、フィブリノーゲン原液のチューブをシェーカーに水平に置きます。毎分300回転で2〜5時間振とうした後、得られた溶液をろ過して、調製中に形成された塊を取り除きます。細胞培養インサートコラーゲンコーティングの場合、バイオセーフティキャビネット内で、滅菌したピンセットを使用して、インサートを細胞培養プレートの蓋に反転させます。次に、115マイクロリットルの氷酢酸を25ミリリットルの蒸留水と混合してから、溶液を追加の蒸留水と調整して最終容量100ミリリットルに調整してからろ過します。100マイクログラム/ミリリットルのコラーゲン溶液を2ミリリットル調製するには、1.9ミリリットルの20ミリモル氷酢酸原液に5ミリグラム/ミリリットルのコラーゲン溶液を40マイクロリットル加えます。得られたコラーゲン溶液を各インサートの底に100マイクロリットル加えます。インサートが乾いたら、インサートの上にカスタム3Dプリントスペーサーを置きます。2〜3時間の自然乾燥後、1回の洗浄につきウェルあたり1ミリリットルの新鮮なPBSを含む12ウェルプレートの個々のウェルに、コラーゲンコーティング面を下にしてインサートを短時間置いて洗浄します。最後の洗浄後、インサートをプレートの蓋に戻し、さらに1〜2時間風乾させます。次に、逆さにしたインサートをプレートの底で覆い、インサートを細胞培養インキュベーターに入れます。細胞を播種する前に、100ミリリットルの蒸留水に3.99グラムの水酸化ナトリウムを加え、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターで溶液をろ過します。次に、T175肝臓ステレーションおよび肝癌細胞培養物を1回の洗浄ごとに10ミリリットルのPBSで2回洗浄してから、細胞を6ミリリットルのトリプシンで摂氏37度で4分間処理します。細胞が分離したら、37°Cの10%DMEMの6ミリリットルで酵素を不活性化し、各細胞培養物を個々の15ミリリットルのチューブに移します。遠心分離により細胞を沈降させます。そして、ペレットを5ミリリットルの予熱済み10%DMEMチューブに再懸濁します。カウント後、両方の細胞集団を中濃度の1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞に希釈し、遠心分離により細胞を回収します。上清を取り除いた後、表に示されているように、予め温めた10%DMEMの適切な量を細胞に加え、摂氏4度のコラーゲンの適切な量を摂氏4度の水酸化ナトリウムの1ミリリットルあたり10マイクロリットルで中和します。.冷やした中和コラーゲンを細胞懸濁液に加えます。メディウムは黄色に変わります。カットしたピペットチップで懸濁液を十分に混合すると、ミディアムが鮮やかなピンク色に変わります。表に示されているように、摂氏37度のフィブリノーゲンの適切な量を追加し、カットしたピペットチップを使用して懸 ?? 液を完全に混合します。.混合後、各チューブに10ミリグラムのフィブリノーゲンごとに0.1キロ国際単位のトロンビンを追加し、改造された200マイクロリットルのピペットチップを使用して、各インサートの底に200マイクロリットルの細胞懸濁液を追加します。ゲルを室温で15分間架橋してから、プレートの底部をゲルの上に静かに置き、次にインサートをインキュベーターに入れて、摂氏37度で45分間さらに架橋します。インキュベーションの終了時に、インサートを12ウェルプレートの個々のウェルに配置し、予め加温した10%DMEMを2ミリリットル各ウェルに加えます。インサートに内皮細胞を播種するには、T175ヒト血管内皮細胞培養物を10ミリリットルのPBSで洗浄してから、示されているように摂氏37度のトリプシンで細胞を剥離します。計数のために細胞を5ミリリットルの内皮増殖培地に再懸濁し、細胞を内皮増殖培地濃度の1ミリリットルあたり10〜4番目の細胞に再懸濁します。次に、各インサートの上部に500マイクロリットルの細胞を追加し、プレートを細胞培養インキュベーターに21日間置きます。ゲル形成の貯蔵弾性率を測定するには、播種から60分後にレオメータを使用し、直径8mmのステンレス鋼形状の平行プレートを使用して、0.1〜20ヘルツ、0.26%、摂氏37度、軸力0.1ニュートンで周波数スイープを行います。この代表的な分析では、フィブリノーゲンとコラーゲンヒドロゲルの組み合わせの10種類の製剤を調製し、肝細胞がんの発症時に観察されたのと同様の肝臓の硬さを模倣できる製剤を決定しました。次に、各濃度の貯蔵弾性率をレオメータを使用して決定しました。これらの10式の中から、線維症発症時の肝硬直値に対応するフィブリノーゲン1型コラーゲン11ミリグラム/1ミリグラムから10ミリグラム/1ミリグラム、肝硬変に対応するコラーゲン型1ミリグラム/1ミリグラムからフィブリノーゲン1ミリリットルあたり30ミリグラム、コラーゲン1型1号1ミリグラム/1ミリグラム/30ミリグラム、肝細胞がんに対応するフィブリノーゲン1ミリリットルあたり40ミリグラムを選定しました。 AlamarBlue解析では、未処理のコントロールと比較して、既知の報告された阻害濃度値に基づくと、2D共培養における細胞生存率が全体的に低下したことが示されました。しかし、3Dモデルでは、ドキソルビシン耐性の増加が観察されました。ハイドロゲル細胞懸濁液をインサートに播種する際には、プロトコールの成功には合理化されたワークフローが不可欠であるため、迅速に行動するようにしてください。RNAおよびタンパク質の単離技術を最適化することで、転写および翻訳レベルでの腫瘍間質相互作用をさらに研究することができます。

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