Name: ライブ細胞におけるコンソジショナルフレットバイオセンサーを用いたオーロラキナーゼ活性化のリアルタイムモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学ぶFRET-FLIMを用いたオーロラキナーゼA活性化のリアルタイム検出法。ヒト細胞の有糸分裂におけるキナーゼ動態を定量的に解析し、細胞周期制御とがん研究への応用可能性を示す。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

顕微鏡レンヌイメージングセンター(MRic、BIOSIT、レンヌ、フランス)のエンジニアに、アドバイスと助け、特にX.ピンソンの原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。MRicは、フランス国家研究庁(ANR-10-INBS-04)が支援する国家インフラフランスバイオイメージングのメンバーです。この作品は、 センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック (CNRS)、 リーグ・コントル・ル・ガン・コミテ・ディレ・エ・ヴィレーヌ、デ・コート・ダルモール・エ・デュ・フィニステール、協会が ラ・レシェルシュ・コントル・ル・ガン(ARC)を G.Bに注ぎます。

G.B実験を行い、原稿を書いてレビューし、資金を提供し、M.T.は原稿を見直し、支援を提供しました。M.T.は、この原稿に示されている迅速なFLIM測定のためのソリューションを生産するインスコープ会社(フランス)の科学顧問および株主です。インスコープは、原稿のオープンアクセス出版物を部分的にサポートしました。インスコープは、実験設計、データ処理、原稿の執筆に関与していなかった。

遺伝子組み換えFRETバイオセンサーは、単一タンパク質またはシグナル伝達経路全体の活性化を測定するための信頼性の高いツールである41。特に、AURKA FRETバイオセンサーは、時間と空間におけるキナーゼの活性化を探索する優先的な方法を構成する。しかし、FRETバイオセンサーを設計または最適化する際には、一般的な用語だけでなく、AURKAに対して特に注意を払う必要がある要素もあります。
第一に、ドナー/アクセプターFRETペアの性質と相対位置を、このキナーゼの特定の機能に適合させることができる。AURKAは有糸分裂の間に有糸球体で非常に富化されるが、それは細胞周期全体および異なった細胞の位置(例えば、セントロソーム、核およびミトコンドリア)1,2に存在する。バイオセンサーが、酸性pHに到達できるミトコンドリアのような特定のコンパートメントで使用される場合、mTurquoise2/shadowGとしてpH感受性ドナーアクセプターFRETペアを選択する必要があります。さらに、FRETドナーをC末に置くことで、この細胞下コンパートメントでバイオセンサーをよりよく視覚化することができ、AURKA N末語がミトコンドリア16,42で部分的に切断することが示されたことを考えると、FRET検出を最適化する可能性さえある。
第二に、AURKA FRETバイオセンサーを最適化する未踏の方法は、フルレングスAURKAとドナー/アクセクサペアの間のリンカーのより慎重な設計を必要とするであろう。蛍光対間の距離だけでなく、リンカー自体の特性もFRET効率を向上させる重要な要因であることが示された43,44,45,46。この光の中で、リンカーの剛性または柔軟性を高めることは、FRET効率に有害であるか、またはさらに改善することができる。
第3に、AURKAの過剰発現が有数の細胞2の割合で有糸分裂性紡錘異常を誘導することが知られている。哺乳動物発現ベクターに見られる最も一般的なプロモーターの1つであるサイトメガロウイルス(CMV)のような強力なプロモーターの下で、またはAURKA最小プロモーター配列(CTTCCGG)14,47の下で同じFRET構築物を発現することによって得られたΔLifetimeを比較することは興味深いだろう。このプロモーターは、キナーゼのノックダウン後に生じる単極性または多極スピンドルを救出することが以前に示され、その使用はse14,47当たりの細胞周期摂動を誘発しなかった。FLIMはcell11のタンパク質発現レベルおよび相対濃度に対して無神経であるが、同じバイオセンサーのセットアップで2つのプロモーターを完全に比較することによって利益を得ることは、任意の場所で活性化されたAURKAのプールの理解を広げるだろう。さらに、上皮癌および血液学的癌のパラダイムに関連する過剰発現時にAURKA活性化がどのように変化するかについての新しい洞察を提供するであろう。
最後に、ダウンストリームの FRET アプリケーションも考慮する必要があります。AURKAの分野における将来の展望は、基質ベースのバイオセンサーを用いてキナーゼ立体構造バイオセンサーを累積することである。2つのバイオセンサーのFRET挙動を同時に分析する(マルチプレックスFRETと呼ばれるプロセス)は、第2のドナーチャネルでスペクトルブリードを避けるために、第1のバイオセンサーに暗いアクセクターを必要とします。AURKAの文脈では、これは第1のバイオセンサーでキナーゼの活性化を検出するエキサイティングな新しい視点を開き、第2のバイオセンサーと与えられた基板に向かってその酵素活性を開くだろう。マルチプレキシングの最近の開発により、同時に最大3つのバイオセンサーを一度に累積できるようになりました48.AURKAの文脈で同様の方法を適用することは、キナーゼの活性化活動相互作用をテストするだけでなく、前例のない時空間的解像度でAURKAシグナル伝達カスケードを探索する非常に有望な戦略を表す可能性があります。
結論として、FRET/FLIMはタンパク質活性に関する知識を深める便利な方法です。一方で、少なくとも1つの蛍光部分のおかげで、生細胞内の特定のタンパク質の局在を可視化することができます。一方、タンパク質の立体構造の変化を解明することができ、タンパク質の活性化や活性に有益である可能性があります。したがって、FRET/FLIMおよび立体構造FRETバイオセンサーは、生細胞のシグナル伝達経路に従う広範な方法になり、絶妙な時空間分解能を有する可能性を秘めている。

オーロラキナーゼA/AURKAは多機能なセリン/スレオニンキナーゼであり、細胞周期を通して、そして異なる細胞内の区画1で活性である。AURKAはしばしば上皮性および造影性悪性腫瘍で過剰発現し、患者は現在利用可能な治療法に対する反応性が低いため、その広範な時空間的活性化を理解することは癌において特に重要である2。
構造研究は、AURKAが非アクティブからアクティブキナーゼに変換するために2つのステップを受けることを明らかにしました。まず、Thr288の自己リン酸化はキナーゼの運動用ポケットの立体構造を変化させ、それを活性化させる3,4,5,6。このステップは、ヒト細胞およびゼノプスlaevis3,6,7におけるAURKAの触媒活性を増加させ、キナーゼを完全な活性のためにプライミングする。一度活性化されると、AURKAとXklp2(TPX2)の標的タンパク質との相互作用は、第2の立体構造変化を誘導する5。このさらなる変更により、AURKAはセル5,8,9,10の基質に向かって完全な酵素活性に達することができます。
約20年間、AURKAの活性化と活性に関する洞察は、主に生化学的アプローチの組み合わせを通じて得られました。これらには、AURKA活性化の特徴として細胞または生体内でリン酸化Thr288の検出、結晶学的分析、およびAURKA1の活性をプローブするインビトロまたはセルロキナーゼアッセイが含まれる。しかし、これらのアプローチの時空間的な解決は貧弱または存在せず、これら2つの事象のダイナミクスの知識を広げるためには新しい解決策が必要であった。
ここ数年の蛍光プローブの開発は、生細胞におけるAURKAのモニタリングを促進し、より大きな時空間分解能で以下の活性化を可能にした。これまでに開発されたAURKAの最も特異的なセンサは、FRET原理(Försterの共振エネルギー伝達)11に依存して、非アクティブなAURKAとアクティブなAURKAを区別しています。最初に開発されたセンサは、AURKAキナーゼ活性の基質ベースのバイオセンサーであった。基質ベースのバイオセンサーは、リン酸化のために与えられたキナーゼによって標的となる短いアミノ酸配列によって構成され、ドナー/アクセプタFRETペアおよびリン酸化残基を認識する結合ドメイン内に挿入され、効率的なFRETプロセス12のためのバイオセンサーの折り畳みを助ける。AURKAの場合、リン酸化によって標的となるKIF2Cの14アミノ酸フラグメントをCFP-YFPドナー/アクセプタpair13の間に挿入した。しかし、このセンサには大きな欠点があります。まず、このプローブに使用されるKIF2C配列をAURKAと密接に関連するキナーゼAURKBの両方で標的化することができ、これによりこのバイオセンサの特異性を低下させることができる。第二に、センサーは、リン酸化のために内因性キナーゼに依存しています。したがって、FRETの効率は、キナーゼの量が制限されている場合(例えば、細胞内区画または細胞周期段階で)検出できないか、または有意ではない。これらの制限を克服するために、新しいクラスのAURKAセンサーが「立体構造センサー」と呼ばれる新しいクラスを作られました。これらのプローブでは、AURKAの全長配列をN末流のドナー蛍光素内に挿入し、C末語でアクセプターフルオロフォアを挿入した。非アクティブなAURKAは、キナーゼのN-およびC末語を互いに遠ざける「オープン」な立体構造を提示する。2つの末語間(>10 nm)間の距離を持つドナー/アクソクサのペアは、FRETの非許容構成になります。それどころか、自己リン酸化AURKAは、2つのタンパク質末語と2つのフルオロフォアが近接して「閉じた」立体構造を採用しています。これは、ドナーとアクセクサとの間のFRETを可能にすることが示された、ドナー寿命14,15の変動を用いて測定することができる。このようなプローブはいくつかの利点を提示する。まず、それらは遺伝的にコードされ、細胞内の内因性キナーゼを置き換えるために使用することができる。第二に、AURKAのノックダウンによって誘発された表型を救出し、細胞内で機能していることを示す。第三に、それらは異なる細胞内区画および細胞周期を通してキナーゼの活性化に従うことを可能にする。このプローブは、キナーゼが活性化することが知られている場所(すなわちセントロソームおよび有糸性紡錘)でAURKAの活性化を検出し、またミトコンドリア16でAURKAの活性化を発見することに関与した。最後に、これらのセンサはFRET/FLIMに基づく高含有スクリーニングを可能にし、そこでAURKAの立体構造変化を使用して新しい薬理学的阻害剤を同定した17。
本研究では、培養細胞におけるAURKA活性化を可視化する手順について説明する。まず、FRETの蛍光ポアペアの可能性について洞察を行います。最も適したドナー/アクソクサペアの選択は、利用可能な顕微鏡のセットアップ、または多重FRET18,19として特定の下流アプリケーションに従って行われます。次に、迅速なFRET/FLIM顕微鏡セットアップで選択したバイオセンサの挙動を探るパイプラインを提案する。このパイプラインは、細胞培養および同期手順から FLIM 取得およびデータ分析まで拡張されます。最後に、バイオセンサ設計の類似戦略を他のキナーゼに適用し、他のFRETベースのイメージングシステムでも使用することができるので、このプロトコルの潜在的な利点について議論します。

<table><tbody><tr><td>アリセルチブ (MLN8237)</td><td>SelleckChem</td><td>S1133</td><td>最終希釈 250 nM で使用</td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル培地 (DMEM)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィック <ストロング>ブランド:</ストロング> ギブコ</td><td>41966052</td><td>高グルコース + L-グルタミン + ピルビン酸</td></tr><tr><td>ナトリウム ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィック <ストロング>ブランド:</ストロング> ギブコ</td><td></td><td></td>10270106</tr><tr><td>L15</td><td>ThermoFischer Scientific ブランド: Gibco</td><td>21083027</td><td>Leibovitz's L15 medium + L-glutamine, no Phenol red</td></tr><tr><td>LabTek</td><td>Nunc</td><td>2515380</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Merck Brand: Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>100 ng/mL 最終希釈</td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシンで使用</td><td>ThermoFischer Scientific ブランド: Gibco</td><td>15140122</td><td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x)</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>ThermoFischer Scientific Brand: Gibco</td><td>14190169</td><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムトリ</td></tr><tr><td>プシンなし/EDTA</td><td>ThermoFischer Scientific ブランド: Gibco</td><td>25300096</td><td>トリプシン-EDTA 0.05%、フェノールレッド(1x)</td></tr></tbody></table>

ライブ細胞におけるコンソジショナルフレットバイオセンサーを用いたオーロラキナーゼ活性化のリアルタイムモニタリング

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

上皮癌は、しばしばSer/ThrキナーゼオーロラA /AURKAの過剰発現によって特徴付けられます。AURKAはThr288での自己リン酸化時に活性化する多機能タンパク質であり、有糸分裂におけるAURKAの豊富なピークは、有糸性紡錘の安定性と忠実度、および有糸分裂の全体的な効率を制御する。構造レベルで十分に特徴付けられるが、細胞周期を通してAURKAの活性化の一貫したモニタリングが欠けている。可能な解決策は、遺伝的にコード化されたフェルスターの共鳴エネルギー伝達(FRET)バイオセンサーを使用して、十分な時間的解像度でAURKAの自己リン酸化に関する洞察を得ることから成り立っています。ここでは、Thr288自動リン酸化を検出するFRETバイオセンサーを設計するプロトコルと、この変化を有糸分裂中にどう従うかについて説明する。まず、ドナー/アクセプターFRETペアの概要を説明し、哺乳動物細胞におけるAURKA FRETバイオセンサーのクローニングおよび挿入方法について説明します。次に、カスタム構築されたセットアップで蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)による迅速なFRET測定のステップバイステップ分析を行います。ただし、このプロトコルは、代替の商用ソリューションにも適用できます。我々は、AURKAベースのバイオセンサーに最も適切なFRET制御を検討し、このツールの感度をさらに高めるための潜在的な将来の改善を強調することによって結論付ける。

我々は、異なるスペクトル特性を有する2つのバイオセンサーを用いて、Thr288上のAURKAの自己リン酸化を記録するために上記の手順に従った。我々は、初期のGFP-AURKa-mCherryプローブ14を、異なるスペクトル特性を有する2つのバイオセンサーと比較した。これらの2つのプローブは、蛍光ドナーmTurquoise2と1つのケースでは非蛍光アクセプター(ShadowG)、または2番目のケースでは黄色のアクセプタ(superYFP)に依存しています。その後、各ドナー/アクサクサペア内にAURKAの全長シーケンスを挿入しました。AURKAの活性化に対して負の制御を持つために、2つの戦略を追求することができます。まず、小さなATP-アナログ(MLN8237)を使用すると、キナーゼの運動ポケット内のATPの結合を妨害し、その活性化を防止する38。第二に、Lys162のMet(K162M)への変異により、14,15,39を活性化することができない各バイオセンサーのキナーゼデッドバージョンを作成する。この突然変異は、Lys162とGlu181の間に通常確立された塩橋の破壊を誘発し、キナーゼの運動用ポケットの安定した開口部をもたらし、その全体的な不活性化を引き起こす40。FRETのネガティブコントロールとして、アクセプターを欠いた構造(GFP-AURKAまたはAURKA-mTurquoise2)を使用しました。
G2/Mの細胞を同期させ、有糸分裂に放出した後、有糸性紡錘で全てのトランスフェクトされたコンストラクトの寿命を測定した(図4)。なお、この構造は全体として考慮され、スピンドル内のROIは分析されなかった。その後、すべての条件に対してΔLifetimeを計算しました。予想通り、GFP-AURKAまたはAURKA-mTurquoise2("ドナーのみ"条件)の寿命は0近くであり、これらの構成体に対して測定された値が平均値の周りに変動したことを示す(図4A、4B)。逆に、GFP-AURKA-mCherryのΔLifetime値はドナーのみの状態と統計的に異なり、ΔLifetimeは〜130 ps増加した(図4A)。同様の観測値は、shadowG-AURKA-mTurquoise2とスーパーYFP-AURKA-mTurquoise2で行われ、ΔLifetimeはドナーのみの状態からそれぞれ〜150と〜220ps増加しました(図4B、4C)。これらのデータは、疑似色参照テーブル (LUT) を使用して単一セルで簡単に視覚化できます。この場合、ΔLifetime の 0 前後の値は疑似色の黄色、より大きな違いは赤/紫の擬似色です。実際、ピクセルバイピクセルLUTはドナーのみの構成体を発現する細胞では黄色に近く、バイオセンサーを発現する細胞では赤色/紫色スペクトルが多かった(図4A、4B)。これは、GFP-AURKA-mCherryバイオセンサーを薬理阻害剤MLN8237で治療した場合にも観察された。
次に、キナーゼ死死んだバイオセンサーのΔLifetimeを分析した。これらの構成体は中間ΔLifetime値を示した:ΔLifetimeはドナーのみの状態(図4B,4C)と比較すると有意に高かったが、また、通常の比較よりも有意に低かった(図4B、4D)。MLN8237で処理された細胞またはキナーゼ死んだバイオセンサーを発現する細胞との比較は、各ドナー/アクセプターペアのΔLifetime変動がAURKAの活性化のみに関連しているかどうかを推定する必要がある。GFP-AURKA-mCherryの場合、AURKA特異的阻害剤を使用するとΔLifetimeバリエーションが廃止されます。逆に、ΔLifetimeのバリエーションは主に、シャドウG-AURKA-mTurquoise2およびスーパーYFP-AURKA-mTurquoise2の場合にはAURKA活性化に排他的にリンクされていません。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig01.jpg"> 図1:GFP(ドナー)とmCherry(アクセクサ)の励起および発光スペクトル。 スペクトルはFPベースウェブサイト(https://www.fpbase.org/)から取得および適合し、480 nmレーザー励起に調整した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig02.jpg"> 図2:実験ワークスペースの画像。 (1) 制御ソリューション(2) 白レーザー光源(3) CCDカメラ(4)顕微鏡のセットアップ;(5)試料の眼スクリーニング用の外部光源/ランプ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig03.jpg"> 図3:FLIM取得用ソフトウェアの代表的な画像。 (A、B)(1) ドナーの励起および放出パラメータ( AのCFP、または BのGFP)(2) 露光時間;(3)目的の選択。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig04v3.jpg"> 図4:AURKAフレットバイオセンサーとその陰性制御の代表的な画像。 (A) (顕微鏡写真) 蛍光 (グリーンチャネル) および GFP-AURKA または GFP-AURKA-mCherry を発現する U2OS 細胞のピクセル単位 ΔLifetime (ドナーのみ – バイオセンサー) G2/M で同期し、バイポーラスピンドルが見えるまで放出し、DMSO または MLN 8237 で処理します。ΔLifetime は、擬似色のスケール ("Fire" ルックアップ テーブル) で示されています。(グラフ)示された条件に対応する定量化と双方向の分散分析。(B)(顕微鏡写真)蛍光(シアンチャネル)と対応するピクセル単位ΔLifetime(ドナーのみ – バイオセンサー)シャドウG-AURKA-mTurquoise2(上パネル)またはスーパーYFP-AURKA-mTurquoise2(下部パネル)を発現するU2OS細胞の蛍光(シアンチャネル)と対応するピクセル単位ΔLifetime(上部パネル)、G2/Mで同期し、双極性スピンルが見えるまで放出される。ΔLifetime は、擬似色のスケール ("Fire" ルックアップ テーブル) で示されています。(グラフ)上記の顕微鏡写真に示された条件の対応する定量化および一方向のANOVA分析。(C)(顕微鏡写真)AURKA-mTurquoise2(上パネル)、シャドウG-AURKA K162M-mTurquoise2(中央パネル)、スーパーYFP-AURKA K162M-mTurquoise2の画像を取得し、顕微鏡写真のように表現。(グラフ)示されたトランスフェクション条件に対する双方向の分散分析。箱ひげ図のバーは中央値を表します。ウィスカーは、1つの代表的な実験(3つの)の条件ごとに最大 n =10細胞に分から伸びる。個々の値はドットで表されます。スケールバー:10 μm. *P &lt; 0.05、**P &lt; 0.01、***P &lt; 0.001(A)の各示された条件に対して(A)「AURKA-mTurquoise2」条件(B)、および(C)の各示された条件に対して。NS:重要ではありません。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

多機能Ser/ThrキナーゼAURKAの活性化は、Thr288の自己リン酸化によって特徴付けられます。ここでは、プローブエンジニアリングの戦略と、有糸分裂全体のキナーゼ活性化に従う迅速なFRETプロトコルを示す。

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...

この方法は、FRETの原理に依拠して、蛍光バイオセンサーを用いて、オーロラキナーゼAの活性化を迅速かつ堅牢に検出するために使用できます。FRETの効率を迅速かつオンラインで測定することで、オーロラキナーゼAが活性化しているかどうかを瞬時に判断することができます。FRET-FLIMデバイスは比較的取り付けが簡単で、フリーサイドポートを備えた任意の白色フィルム顕微鏡に使用できます。蛍光タンパク質データベースでドナーアクセプトFRETペアを選択した後、ツールメニューでスペクトルビューアを選択し、クローズをクリックしてウェルカムウィンドウをバイパスし、視覚化するフローラルフォースペアの名前を検索ボックスに入力します。ドナー、アクセプターペア、特定の光源のペアのプロパティをシミュレートするには、特定のレーザーを選択し、[放射をこれに正規化]をクリックします。フローラフォーススペクトルを目的の波長に調整します。同期の翌日、コルチゾールを補給していないSupernatを滅菌済みの温めたPBSに交換し、室温で2回穏やかに揺さぶって細胞を洗浄します。2回目の洗浄後、滅菌済みの予熱イメージング培地を培養物に供給し、細胞を顕微鏡のサーモスタットチャンバーに素早く入れます。FLET-FLIMで撮影するには、レーザー、カメラ、顕微鏡のセットアップ、イメージングソフトウェアの電源を入れます。ドナーフローラルフォーに適切な励起波長と発光波長を選択し、イメージングソフトウェアで露光時間を設定します。FLET-FLIMの取り込みを開始する前に、外部光源を使用して顕微鏡下の細胞にバイポーラ紡錘体が形成されることを確認してください。スピンドルが現れたら、少なくとも63倍の対物レンズを選択し、中期の細胞を見つけます。X、Y、Z座標を調整して、セルを視野の中心に配置し、有糸分裂紡錘体がより見える、または強くなる単一のZ平面を選択します。その後、録音を開始します。利用可能な商用セットアップの大部分は、蛍光顕微鏡写真とピクセルごとの寿命マップの両方を生成します。両方の画像を保存します。ドナー アクセプター ペアの Delta ライフタイム値を計算するには、ライフタイム値を抽出する前に、ピクセルごとのライフタイム マップ全体から、特定のサブ領域に対応する関心領域を選択します。次に、ドナーのみをベクターとして発現する細胞の平均寿命を計算し、平均ドナー寿命を求める。FLIM値の比較では、解析した各実験条件の各セルの平均ドナー寿命から、計算された各独立した寿命値を差し引いて、各条件のデルタ寿命値を取得します。次いで、ドナーのみのデルタ寿命値、例えばバイオセンサーキナーゼ死体および薬理学的阻害剤処理コンストラクトを比較することができる。G2Mで細胞を同期させ、それらを有糸分裂に放出した後、有糸分裂紡錘体でトランスフェクションされたすべてのコンストラクトの寿命を測定することができます。予想通り、この解析では、GFP-AURAKAとAURAKA-mTurquoise2のライフタイム値はゼロに近かった。これらのコンストラクトで測定された値が平均値の周りで変動したことを示します。逆に、GFP AURAKA-mCherryのデルタ寿命値は、ドナーのみの条件とは統計的に異なっていました。デルタのライフタイム値は約 130 ピコ秒増加します。shadowG-AURAKA-mTurquoise2、スーパーYFP-AURAKA-mTurquoise2についても同様の観測が行われました。デルタのライフタイム値は、ドナーのみの条件からそれぞれ約 150 ピコ秒と 220 ピコ秒増加します。この解析では、ドナーがゼロ付近のコンストラクトのみを発現する細胞内のDelta Lifetimeの値は、擬似的な黄色に見えます。一方、より有意な違いは、いずれかのバイオセンサーを発現する細胞における疑似色の赤紫色のシグナルとして観察されます。この効果は、GFP-AURAKA-mCherryバイオセンサーを薬理学的阻害剤で処理した場合にも観察されました。キナーゼ死バイオセンサーを用いたコンストラクトでは、デルタの寿命値は、ドナーのみの条件と比較して有意に高かった。しかし、通常の対応物よりも大幅に低くなっています。ドナーのみの状態の変動性がその主要な値の周りで変動し、値がバイオセンサーコンストラクトの寿命と大きく異なることを確認してください。AURORA-キナーゼAバイオセンサーはダークアクセプターとうまく機能するため、それを2番目のバイオセンサーに結合して、基質への酵素活性を追跡することを検討できます。

real-time-monitoring-aurora-kinase-activation-using-conformational

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

FRETに基づく記者はますます、生細胞におけるキナーゼとホスファターゼの活動を監視するために使用されています。ここでは、ターゲットのリン酸化の細胞周期依存性の変化を評価するためのFRETに基づくレポーターを使用する方法の方法を説明します。...

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）顕微鏡は、レポーターとして、様々なバイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための強力な手法です。ここで我々はどのようにカスタマイズされたエピ蛍光を構築するには市販のコンポーネントと方法実験をFRETのためにそれを使用するからイメージングシステムをFRETについて説明します。...

単分子バイオセンサーを用いた生細胞中のシグナル伝達事象をリアルタイムで監視するための顕微鏡のFRET

出典:Jongbloets, B. C., et al.In vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopyを用いた頭部固定行動マウスにおけるプロテインキナーゼA活性の可視化。J. Vis. Exp. (2019)...

2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いたマウスのプロテインキナーゼA活性の可視化

Gタンパク質共役受容体によるGタンパク質の選択的活性化を検出する簡単な方法は、細胞シグナル伝達における未解決の課題です。ここでは、GPCRとGタンパク質ペプチドをペアワイズテザリングして、生細胞の制御された濃度でのコンフォメーション変化を調べることにより、Fӧrster共鳴エネルギー移動(FRET)バイオセンサーを開発しました。...

ライブ細胞懸濁液の蛍光光度アッセイでFRETセンサーを用いて測定したGタンパク質選択的なGPCRの立体配座

タンパク質キナーゼAの活動を可視化する手順を提示し、マウスの頭部固定、振る舞いをする。改良されたA-キナーゼ活性レポーターtAKARαは皮質ニューロンで発現され、頭蓋の窓を通してイメージングのためにアクセス可能にされる。2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡は、強制移動中の生体内でのPKA活性を可視化するために使用されます。...

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

このプロトコルは、生細胞中のCRAFキナーゼと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するためのBRETベースのアッセイを説明しています。このプロトコルでは、細胞の調製、BRET排出量の読み取り、およびデータ解析の手順を概説しています。また、アッセイ最適化のための適切なコントロールとトラブルシューティングの特定を含む結果の例も示します。...

生細胞におけるCRAFと14-3-3タンパク質との相互作用を測定するための生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)ベースのアッセイ

この研究で提示されたプロトコルは、2つの方法によるcAMPの測定におけるcAMP差分検出器 In Situ...

蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス

電気生理学は、イオンチャネル活性を調査するためのゴールドスタンダードです。ただし、光学的方法など、多くの代替アプローチがあります。ここでは、8チャネル(LRRC8)形成陰イオンチャネルを含むロイシンリッチリピートの活性を、サブユニット間フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)ベースの方法を用いてモニターする方法について述べる。...

感作蛍光フェルスター共鳴エネルギー移動(SE-FRET)を使用したロイシンリッチリピート含有8チャネル(LRRC8/VRAC)活性のモニタリング

ここでは、生きたHepG2細胞におけるAkt活性化とリン酸化の時空間ダイナミクスを定量化するためのプロトコルを紹介します。フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)イメージングは、がん細胞におけるインスリンシグナル伝達経路と代謝調節に関する貴重な洞察を提供する強力なツールです。...

HepG2細胞における代謝制御Akt活性化ダイナミクスの生細胞フェルスター共鳴エネルギー移動イメージング

我々は将来の核酸ベースの治療のために均一とカスタマイズ可能なpolyplexesのよりよい制御および合成を提供することが期待される高分子電解質polyplexes、の形成を調査するナノフォトニクス（QD -...

組み合わせるQD - FRETとマイクロ流体はリアルタイムでDNAのNanocomplex自己組織化を監視する

学ぶFRET-FLIMを用いたオーロラキナーゼA活性化のリアルタイム検出法。ヒト細胞の有糸分裂におけるキナーゼ動態を定量的に解析し、細胞周期制御とがん研究への応用可能性を示す。

ライブ細胞におけるコンソジショナルフレットバイオセンサーを用いたオーロラキナーゼ活性化のリアルタイムモニタリング

さらに動画を探す