Name: RNA-seqを用いた分子進化と遺伝子発現を探るバイオインフォマティクスのパイプライン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学ぼう、RNA-seqを用いたバイオインフォマティクスパイプラインでHydra vulgarisのオプシン遺伝子の分子進化と発現を解析する方法。BLAST、MEGA、edgeRを活用し、系統特異的複製と組織特異的発現を明らかにする。

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アドリアナ・ブリスコ、ギル・スミス、ラビ・ムラド、アリーン・G・レンゲルに、これらのステップのいくつかをワークフローに組み込む際のアドバイスとガイダンスに感謝します。また、キャサリン・ウィリアムズ、エリザベート・レボア、ナターシャ・ピッチャーニの原稿に対するコメントに感謝しています。この研究の一部は、ジョージ・E・ヒューイット医学研究フェローシップによって支援されました.M.M。

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルの目的は、RNA-seqデータを用いて遺伝子ファミリーを特徴付けるためのステップの概要を提供することにある。これらの方法は、さまざまな種やデータセット4、34、35に対して機能することが証明されています。ここで確立されたパイプラインは簡素化されており、バイオインフォマティクスの初心者が続くのに十分簡単でなければなりません。プロトコルの重要な点は、公開可能な分析を完了するために、すべての手順と必要なプログラムの概要を示すということです。プロトコルの重要なステップは、適切に完全な長さのトランスクリプトを組み立てることです, これは高品質のゲノムまたはトランスクリプトームから来ています.適切なトランスクリプトを得るためには、高品質のRNAおよび/またはDNAおよび以下で議論する良好な注釈が必要です。
RNA-seqライブラリの準備のために、我々は、ヒドラ<sup clas...

シーケンシング技術の進歩は、非モデル生物のゲノムおよびトランスクリプトムのシーケンシングを促進してきた。多くの生物からのDNAとRNAのシーケンシングの実現可能性の増加に加えて、関心のある遺伝子を研究するために豊富なデータが一般に公開されています。このプロトコルの目的は、目的の生物に重要な役割を果たす可能性のある遺伝子の分子進化と発現を調査するためのバイオインフォマティクスのステップを提供することです。
遺伝子や遺伝子ファミリーの進化を調査することで、生物学的システムの進化に関する洞察を得ることができます。遺伝子ファミリーのメンバーは、通常、保存されたモチーフまたは相同遺伝子配列を同定することによって決定される。遺伝子ファミリーの進化は、以前は遠縁モデル生物1のゲノムを用いて調べられた。このアプローチの制限は、これらの遺伝子ファミリーが密接に関連する種でどのように進化し、異なる環境選択的圧力の役割が明確でないということです。このプロトコルでは、密接に関連する種のホモログの探索を含む。系統レベルで系統を生成することで、保存された遺伝子や系統特異的な重複などの遺伝子ファミリーの進化の傾向に注意することができます。このレベルでは、遺伝子がオルソログかパラログかを調べることもできます。多くのホモログは互いに同様に機能する可能性が高いが、必ずしも2の場合ではない。これらの研究に系統樹を組み込むことは、これらの相同遺伝子がオルソログであるかどうかを解決するために重要である。真核生物において、多くのオルソログは、哺乳類タンパク質が酵母オルソログ3の機能を回復する能力によって証明されるように、細胞内で同様の機能を保持している。しかし、非オーソリンス遺伝子が特徴付き機能4を行う場合があります。
系統樹は遺伝子と種の関係を引き起じ始めますが、遺伝的関係だけに基づいて機能を割り当てることはできません。遺伝子発現解析と機能性アノテーションと濃縮分析を組み合わせることで、遺伝子機能を強力にサポートします。遺伝子発現を定量化し、個人や組織の種類を比較できるケースは、潜在的な機能をより伝えることができます。以下のプロトコルは、Hydra下流7のオプシン遺伝子の調査に用いられる方法に従うが、それらはあらゆる種およびあらゆる遺伝子ファミリーに適用することができる。このような研究の結果は、非モデル生物における遺伝子機能および遺伝子ネットワークのさらなる調査のための基礎を提供する。一例として、光伝達カスケードを開始するタンパク質であるオプシンの系統の調査は、眼および光検出8、9、10、11の進化にコンテキストを与える。この場合、非モデル生物、特にクニダリアンやクテノフォアなどの基底動物種は、クレード12、13、14にわたる光変調カスケードおよび視力の保全または変化を解明することができる。同様に、他の遺伝子ファミリーの系統、発現、ネットワークを決定することは、適応の根底にある分子メカニズムについて私たちに知らせるでしょう。

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer-DNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>Bioanalyzer-RNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>wet lab materials</td></tr><tr><td>BLAST+ v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>コンピュータクラスタ上*<br/</td></tr><tr><td>> https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ Blast2GO (PC 上)</td><td></td><td></td><td>ローカルコンピュータ上 https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td></tr><tr><td>boost v. 1.57.0</td><td></td><td></td><td>コンピュータクラスタ</td></tr><tr><td>Bowtie v. 1.0.0</td><td></td><td></td><td>コンピュータクラスタ https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td></tr> <tr><td>Computing クラスタ (強く推奨)</td><td></td><td></td><td>注: ゲノムデータの分析は、ファイルが非常に大きいため、ハイパフォーマンスコンピューティングクラスタで行うのが最適です。</td></tr><tr><td>Cufflinks v. 2.2.1</td><td></td><td></td><td>コンピュータクラスタ</td></tr><tr><td>edgeR v. 3.26.8 (R)</td><td></td><td></td> <td>Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td></tr><tr><td>gcc v. 6.4.0</td><td></td><td></td><td>コンピュータクラスタ</td></tr><tr><td>Java v. 11.0.2</td><td></td><td></td><td>コンピュータクラスタ</td></tr><tr><td>MEGA7 (PC 上)</td><td></td><td></td><td>ローカルコンピュータ https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MEGAX v. 0.1</td><td></td><td></td><td>ローカル コンピューター https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II キット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td>ウェット ラボ材料</td></tr><tr><td>perl 5.30.3</td><td></td><td></td><td>コンピューター</td></tr><tr><td>クラスター python</td><td></td><td></td><td>コンピューター</td></tr><tr><td>クラスター Qubit 2.0 蛍光光度計</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td>ウェットラボ材料</td></tr><tr><td>R v.4.0.0</td><td></td><td></td><td>コンピュータクラスタ https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td></tr> <tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7021</td><td>ウェットラボ材料</td></tr><tr><td>RNeasyキット</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>ウェットラボ材料</td></tr><tr><td>RSEM v. 1.3.0</td><td></td><td></td><td>コンピュータソフトウェア https://deweylab.github.io/RSEM/</td></tr><tr><td>RStudio v. 1.2.1335</td><td></td><td></td><td>ローカル コンピュータ https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td></tr><tr><td>Samtools v. 1.3</td><td></td><td></td><td>コンピュータ ソフトウェア</td></tr><tr><td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>コンピュータ cluster https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td></tr><tr><td>STAR v. 2.6.0c</td><td></td><td></td><td>コンピュータ cluster https://github.com/alexdobin/STAR</td></tr><tr><td>StringTie v. 1.3.4d</td><td></td><td></td><td>コンピュータ クラスタ https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td></tr> <tr><td>Transdecoder v. 5.5.0</td><td></td><td></td><td>コンピュータ クラスタ https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td></tr><tr><td>Trimmomatic v. 0.35</td><td></td><td></td><td>コンピュータ クラスタ http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Trinity v.2.8.5</td><td></td><td></td><td>コンピュータ cluster https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>ウェット ラボ材料</td></tr><tr><td>TruSeq RNA ライブラリ準備キット v2</td><td>イルミナ</td><td>RS-122-2001</td><td>ウェット ラボ材料</td></tr><tr><td>TURBO DNA フリー キット</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>ウェット ラボ材料</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*コンピュータークラスターでのダウンロードとインストールには、ルートアクセスが必要になる場合があります。ネットワーク管理者に問い合わせてください。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seqを用いた分子進化と遺伝子発現を探るバイオインフォマティクスのパイプライン

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

全ゲノムやトランスクリプトームデータなどの大規模なデータセットを蒸留して報告することは、しばしば困難な作業です。結果を分解する1つの方法は、生物にとって重要な1つ以上の遺伝子ファミリーに焦点を当て、研究することです。このプロトコルでは、系統を生成し、目的の遺伝子の発現を定量化するためのバイオインフォマティクスステップの概要を説明する。系統樹は、遺伝子が種の内外でどのように進化しているかについての洞察を与えるだけでなく、鳥類学を明らかにすることができます。これらの結果は、RNA-seqデータを用いて、異なる個体または組織におけるこれらの遺伝子の発現を比較するために増強することができる。分子進化と発現の研究は、種間の遺伝子機能の進化と保存のモードを明らかにすることができます。遺伝子ファミリーの特徴付けは、将来の研究のスプリングボードとして機能し、新しいゲノムまたはトランスクリプトーム論文で重要な遺伝子ファミリーを強調することができます。

上記の方法は 図1 に要約され、 ヒドラ下品 組織のデータセットに適用された。 H. 下垂体 は、サンゴ、クラゲ、イソギンチャクを含むフィラム クニダリア に属する淡水無脊椎動物です。 H.下品は 出芽によって無性を再現することができ、二分すると頭と足を再生することができます。本研究では、 ヒドラ7におけるオプチン遺伝子の進化と発現を調べる。 ヒドラ は目を欠いているが、光依存の行動32を示す。オプシン遺伝子は、光の異なる波長を検出し、光伝達カスケードを開始するために視力において重要なタンパク質をコードします。基底種におけるこの遺伝子ファミリーの分子進化と発現を調べれば、動物の目の進化と光検出の洞察を得ることができます。
Hydra 2.033参照ゲノムと一般に入手可能なRN...

このプロトコルの目的は、RNAシーケンシングデータを用いて候補遺伝子の進化と発現を調べるものです。

RNA-seqを用いた分子進化と遺伝子発現を探るバイオインフォマティクスのパイプライン

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

このプロトコルは、候補遺伝子の分子進化と発現を調査するためのバイオインフォマティクスのステップを概説する。ここでは、バイオインフォマティクスの経験が最小限の人なら誰でもこのプロトコルを実行できるように、徹底的な指示を提供します。このパイプラインは、任意の生物および任意の遺伝子ファミリーに適用することができる。バイオインフォマティクスを行う際の一般的な問題の 1 つは、シェル スクリプトの失敗です。このプロトコルを試す際には、最新のソフトウェアを使用していることを確認し、エラー ファイルを読み、マニュアルを慎重に確認してください。開始するには、ターミナルまたは PuTTY アプリケーション ウィンドウでコンピュータ クラスタ アカウントにログインします。端末で、Wget を使用して SRA Toolkit バージョン 2.8.1 をダウンロードし、プログラムのインストールを完了します。NCBIで目的のサンプルのSRA受位数を検索し、次に端末ウィンドウでRNA配列データを取得します。ペアエンド ファイル タイプ用の FASTQ ファイルを 2 つ取得します。参照ゲノムが存在する場合は、オンラインで参照ゲノムを検索します。参照アセンブリを取得するには、ターミナル ウィンドウに wget と入力し、リンク アドレスを貼り付けます。可能であれば、参照ゲノムのGTFファイルとプロテインFASTAファイルもコピーします。ゲノムをインデックス化し、読み取りをマップし、各サンプルの式を計算します。結果ファイルの名前をわかりやすい名前にし、すべてのカウントの行列を生成します。インターネットブラウザウィンドウを開き、NCBI GenBankに移動します。検索バーに、対象遺伝子の名前と、配列された密接に関連する種の名前を入力します。検索バーの左側にある [タンパク質] を選択し、[検索] をクリックします。[送信] をクリックしてシーケンスを抽出し、[ファイル] を選択します。[フォーマット] で [FASTA] を選択し、[ファイルの作成] をクリックします。ローカル端末ウィンドウまたは FileZilla を使用して、同族語の FASTA ファイルをコンピュータクラスタに移動します。次に、BLAST+コンピュータクラスタを使用して候補遺伝子を検索し、ゲノムまたはトランスクリプトーム翻訳タンパク質FASTAからBLASTデータベースを作成します。NCBIから目的の種のデータベースに相同遺伝子配列をBLASTし、その後、コマンドを使用して出力ファイルを表示する。対象の種から新しいテキスト ファイルに、一意の遺伝子 ID をコピーします。候補遺伝子の配列を抽出する。相互BLASTを使用して遺伝子注釈を確認するには、BLASTローカルアライメント検索ツールに移動し、BLASTPを選択して候補配列を貼り付け、非冗長タンパク質配列データベースを選択し、BLASTをクリックします。MEGA を開き、[配置]をクリックし、[ビルドの配置を編集]をクリックして、[新しい線形を作成]を選択して、[OK]をクリックします。[タンパク質] を選択します。[配置]ウィンドウが開いたら、[編集]をクリックします。[ファイルからシーケンスを挿入] をクリックし、候補遺伝子と可能性のある同族体のタンパク質配列を含む FASTA を選択します。[すべてのシーケンス] を選択します。アームシンボルを見つけて、その上にカーソルを合わせます。それは筋肉アルゴリズムを使用して配列を整列させると言うべきです。アーム記号をクリックし、「タンパク質の位置合わせ」をクリックしてシーケンスを調整するパラメーターを編集するか、「OK」をクリックしてデフォルトのパラメーターを使用します。このプロトコルは、フィラムクニダリアに属する淡水無脊椎動物であるヒドラ下垂体の組織に適用されました。オプシン遺伝子は、動物の目の進化と光検出に関する洞察を得るために研究された。H.vulgarisおよび他の種のオプシン関連遺伝子の配列をNCBI GenBankからFASTAファイルに抽出した。オプシン遺伝子をMEGAで整列させ、光感受性分子と結合するために必要な保存リジンアミノ酸が欠けていたヒドラオプシンを同定することを可能にした。ヒドラ下垂器および他の種からのオプシン配列を使用して最も可能性の高い木が生成された。この系統は、オプチン遺伝子がクニダリアンにおける系統特異的複製によって進化しており、H.vulgarisにおけるタンデム複製によって進化している可能性を示唆している。次に、オプシン遺伝子の絶対発現を調べるべくedgeRでの微分発現解析を行った。1つ以上のオプシンがハイポトーム、または頭部においてアップレギュレートされているかどうかを判断するために、ハイポトームとボディカラム、出芽ゾーン、足、触手の対比比較を行った。1,774の転写物が、ハイポトームとボディカラムの間で差で発現していることが分かった。複数の比較でアップレギュレートされた遺伝子を決定し、Blast2GOで機能的な濃縮を行った。最後に、オプシン遺伝子の絶対発現を、異なる組織において、出芽の異なる段階、および異なる時間の再生中に調べた。アライメントとツリーを目視で調べると、候補遺伝子が対象家族に属しているかどうかを確認できます。配列が異なりすぎている遺伝子や他の全く外側のグループは、おそらく別の遺伝子ファミリーの一部です。このプロトコルの結果は仮説生成と考えることができる。このパイプラインは、将来の研究で機能的に研究する候補遺伝子を強調することができます。ヒドラオプシン発現を探索した後、我々は現在、類似点と機能の違いを同定するために、種間の関連遺伝子を調査するために同様の技術を使用しています。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

インデックス化されたcDNAライブラリの調製、カスタムプローブによるハイブリダイゼーションとキャプチャ、および遺伝子発現、突然変異、および遺伝子融合のための選択された転写物を調べるためのデータ解析を含む、標的RNAシーケンシングベースの方法について説明します。Targeted...

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

ここでは、おいのアプローチと分析を提示して、遺伝子座の特定のレベルでライン1式を特定します。...

RNA 次世代シーケンシングと、遺伝子座固有のレベルで表現されたライン-1s を識別するバイオインフォマティクスパイプライン

ここで提示されるヒト一次角化細胞のインビトロ分化法は、RNA-seq分析による分子レベルでの特徴付けによる接触阻害による。...

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

本手法はホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)RNAサンプルから得ることができる配列データの質と量を改善するステップを説明する。我々は、FFPE-RNAサンプルの品質をより正確に評価し、シーケンシングライブラリを準備し、FFPE-RNAサンプルからのデータを分析するための方法論を説明する。...

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

RNAシーケンシングの微分発現解析方法の詳細なプロトコルが提供されました: リンマ, エッジ, DESeq2.

RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

このプロトコルにより、バイオインフォマティクスの経験が限られているウェットラボ生物学者のためのRNA-seq実験の初期品質管理が可能になります。...

Rup(RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - 真核生物におけるバルクRNA-seq実験の品質管理

ここでは、指示、分子進化によるトレリコンビナーゼの生成を報告する。トレリコンビナーゼは、感染したヒトの細胞からプロウイルスの切除及び根絶の結果、HIV - 1プロウイルスのLTR配列内の事前定義された標的配列を認識する。まだ揺籃期にある間、定方向分子進化、分子手術と分子医学のツールと​​して機能するカスタム酵素の作成ができるようになります。...

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電気生理学的研究のための新生児マウス脊髄の分離のデモンストレーション。...

脊髄電気生理学

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