CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

このプロトコルは、CRISPR-Cas9ゲノム編集のための蚊の胚の準備と注入の方法について詳細な指示を提供するという点で重要です。このマイクロインジェクション技術の主な利点は、蚊の生存率が高く、研究者が遺伝子の機能を決定できることです。このプロトコルは、Culex属に属する蚊を注射するように特別に調整されています。

これらの蚊は、西ナイル熱やセントルイス脳炎を引き起こすウイルス、犬のフィラリアや象皮病を引き起こすフィラリア性線虫など、いくつかの病原体を媒介します。したがって、CRISPR-Cas9ゲノム編集のようなツールがあれば、これらの重要な疾患因子をよりよく理解し、制御することができます。産卵したばかりの昆虫の胚を注入し、生存率を高めるには、多くの時間と練習、忍耐が必要です。

したがって、突然変異を生成するために高価な材料を注入する前に、いくつかの胚に着色生理食塩水を注入することをお勧めします。注射針を注射ミックスで埋め戻すことから始めます。選択した注射針の後端に簡単に収まるニードルフィラーまたはゲルローディングチップを選択します。

ニードルフィラーの端と注射針の間に少しスペースがあることを確認してください。慎重に吸引し、注射混合物の1つの小さな滴を、それが先細りになり始める場所近くの注射針に。次に、注射針をマイクロインジェクターに取り付けます。

胚を含むスライドを顕微鏡のステージに置きます。ニードルを開くには、約30 Psiの開始注入圧力を使用し、必要に応じて調整して適切な量の注入混合物を供給します。解剖顕微鏡下で、針を蚊の胚の上に置き、マイクロマニピュレーターを慎重に使用して針を胚に下げます。

針が胚にほとんど触れなくなったら、胚を針の長軸に対して垂直にすばやく動かします。針が正常に開いたかどうかを確認するには、注射トリガーを押して、気泡または注射混合物が針から逃げるかどうかを確認します。そうでない場合は、蚊の胚を針に対して動かし、トリガーを押すと注射液が開くまで繰り返します。

最初の蚊の胚を視界の中心に置き、焦点が合っていることを確認し、針を最初の卵の上に置きます。顕微鏡で倍率を徐々に上げ、針を慎重に下げて最初の胚のすぐ上に保ちます。顕微鏡が最高倍率に達し、胚と針の両方に焦点が合うまで進行します。

胚を少し左に動かし、針を下げて、胚と同じ視野にくるようにします。顕微鏡ステージを使用して、胚を針の先端にそっと触れます。蚊の胚の狭い後端はわずかに偏向するはずです。

顕微鏡のステージを使用して、胚の後端を針上に移動し、蚊の卵の絨毛膜を貫通する針を観察します。針は、胚内の極細胞のおおよその位置と膜を貫通するはずです。この領域に注射ミックスを配置すると、突然変異が発生し、生殖細胞系に遺伝する可能性が高くなります。

注入トリガーを1〜3回引いて、胚に注入ミックスを撃ち込みます。胚形質の小さなクリアリングを検出できる程度に、少量の注入ミックスを送達します。ステージを使用して、胚を右に、遠ざけて、針の先端から離します。

注射がうまくいけば、胚から液体が漏れることはほとんどありません。ステージを下に移動して、次の胚が針の前に配置されるようにします。そして注入を繰り返します。

注射液が出ていないように見える場合や、針を抜いた後に胚から大量の液体が逃げてしまう場合は、注射針を交換してやり直してください。注入されていない卵子や損傷した卵子は破壊します。スライド上のすべての胚を注入した後、噴出ボトルで逆浸透水を適用してハロカーボンオイルを洗い流します。

注入された胚の上にあるガラスカバースリップの上部に水の流れを向け、水がカバースリップを流れ落ちるのを待って、流れが胚に向けられないようにします。スライドを150マイクロリットルの水で覆い、正方形のペトリ皿の内側の濡れた濾紙の上に置きます。摂氏25〜27度、相対湿度70〜80%に設定された環境チャンバーで、ペトリ皿を長時間の日長でインキュベー

このプロトコルは、ノーザンハウス蚊の蚊、Culex pipiensの胚を成功裏に注入するために使用され、蚊の胚の前端が医療用包帯のストリップを超えて伸びることを確保し、幼虫の生存率が大幅に向上し、成虫期まで発達し、繁殖することができる高品質の子孫をもたらします。シーケンシングにより、スクリーニングされた蚊の約10%が、最初のガイドRNAのCas9切断部位の近くに小さな挿入または欠失を示したことが明らかになり、極細胞がマイクロインジェクション中にうまく標的化されたことが示唆されました。F1個体は首尾よく交配し、生存可能な子孫を産み、その一部には突然変異も含まれていました。

昆虫の胚にマイクロインジェクションを行うとき、ほとんどの人は最初に針を開いて胚を針の上に移動させるのに苦労します。これらのスキルを身に付けるには、時間と練習が必要であることを忘れないでください。このプロトコルは、他の蚊や他の昆虫種の胚を注入するように変更または適合させることができます。

このプロトコルを使用して標的CRISPR-Cas9ゲノム編集で遺伝子をノックアウトするだけでなく、同じ技術を使用してプラスミドまたはトランスポゾンを注入し、遺伝子をノックインしたり、ランダムな突然変異を生成したりすることができます。私の研究室では現在、この手法を使用して、蚊が毎日どのように測定し、季節的な反応を調節しているかをよりよく理解しています。しかし、私たち研究者は、いくつかの生物の生物学をよりよく理解するために、CRISPR-Cas9ゲノム編集をどのように使用しているかを考えています。