ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

生体組織は、細胞がさまざまな機械的な手がかりにさらされる3次元の柔らかい環境で成長します。私たちの方法は、生体力学的応答の調査のために、ハイドロゲルを3次元的に引き伸ばすことができます。この技術により、ライブイメージングを行いながら、ハイドロゲルをその厚さに沿って均一に延ばすことができます。

さらに、ハイドロゲルの形状は、任意のサイズや形状に操作できます。細胞や細胞外マトリックスが力にどのように応答するかについての知識は、組織がどのように発生し、病気がどのように進行するかを明らかにするために重要です。これは、がん治療や組織工学モデルの開発につながる可能性があります。

まず、レーザーカッターまたは手動カッターを使用して、中央に穴が開いたゴムストリップを作成します。疎水性フィルムの長方形をシリコンストリップよりも幅が広くなるようにカットし、プラスチック皿を70%エタノールで洗います。糸くずの出ないワイプで乾かした後、シーリングフィルムを皿に入れ、片面からラップを剥がしたシリコンストリップを1枚ずつシーリングフィルムの中央に置きます。

フィブリンゲル形成のためには、2.5マイクロリットルの冷標識フィブリノーゲンを各ストリップのシリコーンカットアウトに均一に供給し、各カットアウトの全周がフィブリノーゲンと接触するようにし、溶液中のどこにもエアポケットや気泡が形成されないように注意します。すぐに2.5マイクロリットルの冷却したトロンビンを各フィブリノーゲン溶液に直接加え、慎重にピペッティングして溶液をすばやく混合し、チップを混合物全体に動かしてできるだけ均質な溶液を作成します。混合後、蓋をした皿をインキュベーターに30分間入れてゲル重合します。

インキュベーションの最後に、ゲルシリコーンコンストラクトを沈めるのに十分なPBSをディッシュに加え、各サンプルをディッシュから慎重に持ち上げて、シーリングフィルム層がストリップに接着したままであることを確認します。シリコーンの一方の端からもう一方の端までゆっくりと剥がし、シリコーンの各部分からシーリングフィルムを慎重に剥がし、ストリップを皿に戻し、皿を光学顕微鏡のステージに置いてサンプルの状態を評価します。サンプルをストレッチ装置にロードするには、バスにPBSを充填し、サンプルゲルを含むシリコンストリップをバスの上部に置き、ストリップの端がバスの両側にくるようにします。

クランプとファブリックストリップを配置し、すべてのピースが接続されて、切り欠きが中央にある1つの直線ストリップを形成するように締めます。材料をウェルに置き、ウェルの底にカバースリップを固定し、次にアルミニウム液体を延伸装置にウェルに入れます。ウェルに1〜2ミリリットルのPBS細胞培地を充填し、ストリップファブリックゲルコンストラクトをデバイスに配置します。

布地をブラケットに固定し、ゲルの切り欠きが中央に来るようにしてから、ピンダウンインサートをデバイスの所定の位置に慎重に配置してロックします。もう一方の生地面をスピンドルに配置してロックし、ストレッチデバイスと付属のサンプルを共焦点顕微鏡のステージに置きます。USBケーブルを使用してマイクロコントローラーをコンピューターに接続し、サーボモーターをマイクロコントローラーに接続します。

次に、コンピューターでストレッチデバイス制御モジュールを開いて、サンプルを画像化します。サンプルが実験に適しているかどうかを判断するには、低解像度のライブイメージングを使用してゲル全体をスキャンし、切り欠きの内壁への完全な接着が明らかな最も低いZ位置を決定し、裂け目や気泡はありません。顕微鏡のZ位置を確認した後、ゲルとシリコーンストリップの蛍光標識の界面をスキャンして、ゲルがその周囲全体でシリコーンに完全に付着しているかどうかを決定します。

スキャン後、ゲル内の連続性がなくなるまでステージをZ方向に動かし、Z位置の上限に注意してください。次に、下限からZ方向の上限を引いて、サンプルの厚さを計算します。サンプルのプレストレッチ位置を決定するには、モジュールソフトウェアの「Go to Zero Servo POS」をクリックして、サーボモーターがゼロ位置にあることを確認し、サンプルに負担がかからないように注意しながら、サーボモーターをストレッチ装置に取り付けます。

イメージング中にプラス1のボタンをクリックして、モーターを時計回りに一度に1度ずつ動かします。カットアウトの右側が移動したら、マイナス1ボタンをクリックしてサンプルを最後から2番目の位置に戻し、サンプルを最小限の張力で維持します。「Set Min Servo Position」をクリックして参照位置を設定し、ゲル領域全体の 40 倍率、高解像度、単一 Z スライスタイル画像を後処理解析のベースライン参照としてキャプチャします。

すべての画像を取得したら、目的のストレッチの大きさに達するまで、サーボモーターを毎秒1度進めます。分析が必要な各ストレッチマグニチュードで、ゲルとシリコーンとの間の界面をスキャンして、ゲルがその円周全体のどの点でもシリコーンから剥離していないことを確認し、その後、後処理分析のためにゲル領域全体の高解像度タイルZスタック画像セットをキャプチャします。ゲル延伸中にビーズ凝集体を拡大し、手動で追跡することで、軸方向と垂直方向の局所ゲルひずみを計算できます。

通常、軸方向のストランドは、シリコンの切り欠きエッジからゲルの中心まで比較的直線的に伝播し、圧縮垂直ひずみよりも大きくなります。ここでは、典型的な非延伸で比較的等方的なハイドロゲルの高倍率画像と、伸張方向に高度に整列した繊維を描いた高80%カットアウトひずみ下の水素を示しています。繊維の配向再の解析により、繊維の配向とカットアウトの外部ひずみとの間には、40%のひずみまではほぼ線形に依存し、40%を超えるひずみでは中程度の飽和が見られましたこの繊維の配向解析に示すように、カットアウトの外部ひずみが増加すると、繊維の配向は全体的に非線形の曲線に沿って増加します。

伸張に対するゲルの応答は、そのZ厚さに沿って比較的均一であることに注意してください。この予備的な有限要素シミュレーションで2D連続材料に対して行われたように、カラーマットの範囲は38〜42%であり、ゲルひずみが円形ゲル領域全体で比較的均一であることを示しています。サンプルの信頼性の高い延伸には接着性と連続性が重要であるため、ヒドロゲルが幾何学的な切り欠きの内壁に完全に付着していることを確認することが重要です。

シリコーンカットアウトの形状を変更することで、ひずみと繊維の整列の勾配をプログラムできるため、細胞を埋め込むときにこれらの勾配に対する応答を解析できます。