Name: ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学ぶ 3Dヒドロゲルの一軸伸張法とライブ共焦点顕微鏡を用いた細胞の生物力学的応答解析。シリコンゴム埋め込みによる均一な伸張制御が可能で、組織工学やがん治療研究への応用が期待されます。

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ここに含まれるいくつかの数字は、著作権クリアランスセンターの許可によって適応されています: スプリンガーネイチャー, 生物医学工学年報.生きた顕微鏡イメージングを可能にしながら、均一なZ軸株で3Dヒドロゲルを緊張させ、A.ロイトブラット・リバ、S.ナタン、A.コレル、H.ラシュキン、O.チャイチェヤン、A.レスマン、著作権©(2019)。
https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

著者らは開示するものは何もない。

本明細書に提示される方法とプロトコルは、主にRoitblat Ribaらの以前の研究に基づいており、41 ここに SCyUS デバイスの完全なコンピュータ支援設計(CAD)、Pythonおよびマイクロコントローラコードが含まれています。
既存のアプローチよりも提示された方法の主な利点は、非常に柔らかい3Dヒドロゲル(〜100 Paの弾性率)をその円周から、 およびライブ 共焦点イメージングの下で歪める可能性を含む。他の方法は、通常 、Z軸に歪みフィールドを適用する能力が制限され、主にサンプルから対物レンズまでの作業距離制限のために、ストレッチ中に高倍率顕微鏡画像を現場で提供することができません。ほとんどの利用可能なシステムは、生理学的組織環境を模倣するに制限されている2D基材ストレッチに基づいています。
システムの制限には、特に大きなゲル体積または複雑な幾何学的形状が使用される場合には、ゲル後重合の繊維密度の潜在的な不均一な均...

機械的な力に対する組織応答は、遺伝子発現1、細胞分化2、および組織改修3を含む幅広い生物学的機能の不可欠な部分である。また、繊維アライメントや高密度化などの細胞外マトリックス(ECM)における力誘発変化は、細胞の挙動および組織形成4、5、6に影響を及ぼす可能性がある。ECMの繊維状メッシュ構造は、非線形弾性、非アフィン変形、塑性変形7、8、9、10、11、12などの興味深い機械的特性を有する。これらの特性は、細胞とその周囲の微小環境が外部の機械的力13,14に応答する方法に影響を与える。ECMと組織が機械的な力にどのように反応するかを理解することで、組織工学の分野や、より正確な計算モデルと理論モデルの開発が進むのが可能になります。
サンプルを機械的に伸ばす最も一般的な方法は、細胞の挙動への影響を探るために細胞を含む2D基質に焦点を当てています。これらは、例えば、ポリジメチルシロキサン(PDMS)基質に株を適用し、ストレッチ方向15、16、17、18、19に関連して細胞の再配向角度を分析することを含む。しかし、外部ストレッチに対する3D細胞埋め込みヒドロゲルの反応を調べる方法は、組織微小環境をより密接に模倣する状況であり、より限定的である。3D行列20と比較して細胞が2D基質上で異なる動作をするため、3Dストレッチ法への進歩は特に重要である。これらの行動には、細胞の再調整、タンパク質発現レベル、および移行パターン21、22、23が含まれる。
3Dサンプルストレッチを可能にする方法とデバイスは、市販の24、25、26、27、28と実験室研究29のために開発されたものの両方を含む。これらの方法は、分解性シリコーンチューブ30、マルチウェルチャンバー31、クランプ26、32、バイオリアクター11、33、カンチレバー34、35、36、および磁石37、38を使用する。いくつかの技術は、ゲル5の2つの単一点から針を引っ張るなどして、3Dヒドロゲルを局所的に変形させるストレッチを生成し、他の技術はゲル16の大部分の全体の変形を可能にする。さらに、これらのシステムのほとんどは、Z方向の歪みフィールドに関する限られた情報で、X-Y平面のひずみ場の分析に焦点を当てています。さらに、これらのデバイスのほんの一握りは、その画像化において顕微鏡的に可能である。この場所での主な課題は、高倍率イメージング(例えば、共焦点顕微鏡)は、対物レンズから試料までの数百ミクロンの限られた作業距離です。ストレッチ中にライブイメージングを可能にするデバイスは、Z軸の歪みの均一性を犠牲にするか、または他の実験室39、40で再現することは比較的複雑で困難である。
3Dヒドロゲルを伸ばすためにこのアプローチは、ライブ共焦点顕微鏡の間に静的または周期的な単軸歪みを可能にする。伸張装置(「スマートサイクリック単軸ストレッチャー -SCyUS」と呼ばれる)は、3Dプリント部品と低コストのハードウェアを使用して構築され、他のラボで簡単に再現できます。装置に取り付けられているのは、その中心に幾何学的な切り抜きを有する市販のシリコーンゴムである。ヒドロゲル成分は、切り出しを充填するために重合される。重合の間、フィブリンまたはコラーゲンなどの生物学的ヒドロゲルは、切り抜きの内壁に自然に付着する。SCyUSを用いて、シリコーンストリップは単軸に伸ばされ、制御された株を埋め込まれた3Dヒドロゲル41に移す。
このシステムは他の既存の方法と比較して特徴および利点の独特な組合せを可能にする。まず、このシステムは、厚い3Dソフトヒドロゲル(厚さ>100 μm、<1 kPa剛性)の単軸ストレッチを周囲から可能にし、ハイドロゲル全体で Z-均質変形を行います。これらのヒドロゲルは柔らかすぎて、従来の引張技術でつかんで引き伸ばされる。第二に、3Dプリンティングは研究者が容易に利用でき、設計に使用されるエレクトロニクスは低コストであるため、ストレッチングデバイスは他のラボで容易に複製することができます。第三に、そしておそらく最も魅力的な特徴は、シリコーンストリップの切り抜きの幾何学およびサイズは容易に操作でき、調整可能なひずみの勾配および境界条件、そして、サンプルの様々な量の使用を可能にする、数マイクロリットルまで。
提示された議定書は、生共焦点顕微鏡下で単軸ストレッチによって進行された0.5mm厚いシリコーンゴムストリップの直径~2mmのディスクにフィブリンゲルを成形して構成する。以下では、幾何学的切り抜きに作用する株を測定および分析するための実験手順、ヒドロゲルで開発された内部株、ならびに種々のストレッチ操作後の繊維アライメントを得る実験手順について詳しく説明する。最後に、ヒドロゲルに細胞を埋め込み、制御された外部ストレッチに曝す可能性について議論する。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 546 カルボン酸、スクシンイミジルエステル</td><td>Invitrogen</td><td>A20002</td><td></td></tr><tr><td>Cell Medium (DMEM High Glucose)</td><td>Biological Industries</td><td>01-052-1A</td><td>10% FBS、1% PNS、1% L-Glutamine、1% Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>Cover Slip #1.5</td><td>Bar-Naor Ltd.</td><td>BN72204-30</td><td>22回;40 mm</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド99.5% GC DMSO</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D-5879-500 ML</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>バイオロジカル</td><td>インダストリーズ 02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>エビセル フィブリン シーラント (ヒト)</td><td>Omrix Biopharmaceuticals</td><td>3902</td><td>フィブリノーゲン: 70 mg/mL, トロンビン: 800-1200 IU/mL</td></tr><tr><td>フィブリノーゲン バッファー</td><td>N/A</td><td></td><td>1Lのレシピ:NaCl 7g、クエン酸三ナトリウム二水和物2.94g、グリシン9g、塩酸アルギニン20g&0.15gの塩化カルシウム二水和物。PuW(pH 7.0-7.2)</td></tr><tr><td>蛍光マイクロビーズFluoSpheres(1 &micro;m)</td><td>Invitrogen</td><td>F8820</td><td>Orange (540/560) 水と 2 mM アジ化ナトリウムの懸濁液 (2% 固形分) として提供</td></tr><tr><td>高温シリコーンゴム</td><td>McMaster-Carr</td><td>3788T41</td><td>580 &micro;m-thick E = 1.5 Mpa ポアソン比= 0.48 引張強度= 4.8 MPa 伸張上限 = +300% 工学株</td></tr><tr><td>HiTrap 脱塩カラム 5 mL (Sephadex G-25 packed)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1408-01</td><td></td></tr><tr><td>HIVAC-G 高真空封止剤</td><td>信越化学工業 株式 会社。</td><td>HIVAC-G 100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ FIJI software39</td><td>National Institute of Health, Bethesda, MD</td><td>Version 1.8.0_112</td><td></td></tr><tr><td>マイクロコントローラ (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)</td><td>Arduino/Adafruit</td><td>Arduino-DK001/Adafruit-1438</td><td></td></tr><tr><td>MicroVL 21R 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Priprimot光学顕微鏡</td><td>Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.</td><td>491206-0011-000</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS CAD (Solidworks)</td><td>ダッソーシステム&egrave;mes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SCyUS Code37</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>サーボモーター - TowerPro SG-5010</td><td>Adafruit</td><td>155</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td>50 mL チューブ用</td></tr><tr><td>滅菌済み 10 cm 非培養プレート</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>トロンビン緩衝液</td><td>1LのN / A</td><td></td><td>レシピ:20gマンニトール、8.77gナトリウムNaCl、2.72g酢酸ナトリウム三水和物、24mL 25%ヒト血清アルブミン、5.88g塩化カルシウム。PuW(pH 7.0)</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA溶液B(0.25%)、EDTA(0.05%)</td><td>生物産業</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>USBケーブル(タイプBオスからタイプAオス)</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880共焦点顕微鏡</td>カール<td>ツァイスAG</td><td>2811000417</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 FP3(黒)</td><td>カールツァイスAG</td><td>リリースバージョン14.0.0.0</td><td></td></tr></tbody></table>

ライブ顕微鏡イメージング下での3dヒドロゲルの制御株

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

外力は組織形成、発達、維持において重要な要素です。これらの力の効果は、多くの場合、特殊なin vitroストレッチ法を使用して研究されます。様々な利用可能なシステムは、ソフトハイドロゲルを歪める3D技術のアクセシビリティながら、2D基板ベースのストレッチャーを使用し、より制限されています。ここでは、サンプルキャリアとして弾性シリコーンストリップを用いて、その周囲から軟質ヒドロゲルの外部ストレッチを可能にする方法について説明する。このプロトコルで利用される伸張システムは3Dプリント部品と低コストのエレクトロニクスから構成され、他のラボで簡単かつ容易に複製できます。実験プロセスは、シリコーンストリップの中心での切り抜きに厚い(>100 μm)ソフトフィブリンヒドロゲル(約100 Paの弾性率)を重合することで始まります。シリコーンゲルの構造は、印刷された伸張装置に取り付けられ、共焦点顕微鏡の段階に置かれる。ライブ顕微鏡では、ストレッチデバイスが活性化され、ゲルは様々なストレッチマグニチュードで画像化されます。その後、画像処理を使用して得られたゲル変形を定量化し、ゲルの3D厚さ(Z軸)全体で比較的均質な歪みと繊維のアライメントを実証します。この方法の利点は、その場合の顕微鏡で実行しながら、3Dで非常に柔らかいヒドロゲルを歪める能力、およびユーザーのニーズに応じてサンプルの形状とサイズを操作する自由が含まれます。さらに、適切な適応により、この方法は、他のタイプのヒドロゲル(例えば、コラーゲン、ポリアクリルアミドまたはポリエチレングリコール)を伸ばすために使用することができ、よりバイオミメティックな3D条件下での外力に対する細胞および組織応答の分析を可能にすることができる。

3Dフィブリンヒドロゲルを運ぶシリコーンストリップに適用される大きさの増加の静的ストレッチからの代表的なデータは、1μmの蛍光ビーズで埋め込まれた、図9に示されている。この分析は、シリコンストレッチが切り抜きの幾何学的変化およびゲル内で発達した株に及ぼす影響を示しています。ゲル全体のZ-スタック画像を使用して、元の円形状の切り抜きの変形を楕円形状に評価します(図9A)。これらの画像は、xx(穴)ε計算するために使用されます(数式2)。ゲルストレッチ中に複数のビーズ凝集体(図9B)をズームインおよび手動で追跡すると、中心にある局所ゲル株の計算、軸方向ε xx(ゲル)および垂直ε yy(ゲル)方向(図9...

提示された方法は、ライブ共焦点顕微鏡を可能にしながら、シリコーンゴムに埋め込まれた3Dソフトヒドロゲルの単軸ストレッチを含む。繊維のアライメントと同様に、外部および内部ヒドロゲル株の特性評価が実証されている。開発された装置およびプロトコルはさまざまなひずみのレジームに対する細胞の応答を査定できる。

ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

生体組織は、細胞がさまざまな機械的な手がかりにさらされる3次元の柔らかい環境で成長します。私たちの方法は、生体力学的応答の調査のために、ハイドロゲルを3次元的に引き伸ばすことができます。この技術により、ライブイメージングを行いながら、ハイドロゲルをその厚さに沿って均一に延ばすことができます。さらに、ハイドロゲルの形状は、任意のサイズや形状に操作できます。細胞や細胞外マトリックスが力にどのように応答するかについての知識は、組織がどのように発生し、病気がどのように進行するかを明らかにするために重要です。これは、がん治療や組織工学モデルの開発につながる可能性があります。まず、レーザーカッターまたは手動カッターを使用して、中央に穴が開いたゴムストリップを作成します。疎水性フィルムの長方形をシリコンストリップよりも幅が広くなるようにカットし、プラスチック皿を70%エタノールで洗います。糸くずの出ないワイプで乾かした後、シーリングフィルムを皿に入れ、片面からラップを剥がしたシリコンストリップを1枚ずつシーリングフィルムの中央に置きます。フィブリンゲル形成のためには、2.5マイクロリットルの冷標識フィブリノーゲンを各ストリップのシリコーンカットアウトに均一に供給し、各カットアウトの全周がフィブリノーゲンと接触するようにし、溶液中のどこにもエアポケットや気泡が形成されないように注意します。すぐに2.5マイクロリットルの冷却したトロンビンを各フィブリノーゲン溶液に直接加え、慎重にピペッティングして溶液をすばやく混合し、チップを混合物全体に動かしてできるだけ均質な溶液を作成します。混合後、蓋をした皿をインキュベーターに30分間入れてゲル重合します。インキュベーションの最後に、ゲルシリコーンコンストラクトを沈めるのに十分なPBSをディッシュに加え、各サンプルをディッシュから慎重に持ち上げて、シーリングフィルム層がストリップに接着したままであることを確認します。シリコーンの一方の端からもう一方の端までゆっくりと剥がし、シリコーンの各部分からシーリングフィルムを慎重に剥がし、ストリップを皿に戻し、皿を光学顕微鏡のステージに置いてサンプルの状態を評価します。サンプルをストレッチ装置にロードするには、バスにPBSを充填し、サンプルゲルを含むシリコンストリップをバスの上部に置き、ストリップの端がバスの両側にくるようにします。クランプとファブリックストリップを配置し、すべてのピースが接続されて、切り欠きが中央にある1つの直線ストリップを形成するように締めます。材料をウェルに置き、ウェルの底にカバースリップを固定し、次にアルミニウム液体を延伸装置にウェルに入れます。ウェルに1〜2ミリリットルのPBS細胞培地を充填し、ストリップファブリックゲルコンストラクトをデバイスに配置します。布地をブラケットに固定し、ゲルの切り欠きが中央に来るようにしてから、ピンダウンインサートをデバイスの所定の位置に慎重に配置してロックします。もう一方の生地面をスピンドルに配置してロックし、ストレッチデバイスと付属のサンプルを共焦点顕微鏡のステージに置きます。USBケーブルを使用してマイクロコントローラーをコンピューターに接続し、サーボモーターをマイクロコントローラーに接続します。次に、コンピューターでストレッチデバイス制御モジュールを開いて、サンプルを画像化します。サンプルが実験に適しているかどうかを判断するには、低解像度のライブイメージングを使用してゲル全体をスキャンし、切り欠きの内壁への完全な接着が明らかな最も低いZ位置を決定し、裂け目や気泡はありません。顕微鏡のZ位置を確認した後、ゲルとシリコーンストリップの蛍光標識の界面をスキャンして、ゲルがその周囲全体でシリコーンに完全に付着しているかどうかを決定します。スキャン後、ゲル内の連続性がなくなるまでステージをZ方向に動かし、Z位置の上限に注意してください。次に、下限からZ方向の上限を引いて、サンプルの厚さを計算します。サンプルのプレストレッチ位置を決定するには、モジュールソフトウェアの「Go to Zero Servo POS」をクリックして、サーボモーターがゼロ位置にあることを確認し、サンプルに負担がかからないように注意しながら、サーボモーターをストレッチ装置に取り付けます。イメージング中にプラス1のボタンをクリックして、モーターを時計回りに一度に1度ずつ動かします。カットアウトの右側が移動したら、マイナス1ボタンをクリックしてサンプルを最後から2番目の位置に戻し、サンプルを最小限の張力で維持します。「Set Min Servo Position」をクリックして参照位置を設定し、ゲル領域全体の 40 倍率、高解像度、単一 Z スライスタイル画像を後処理解析のベースライン参照としてキャプチャします。すべての画像を取得したら、目的のストレッチの大きさに達するまで、サーボモーターを毎秒1度進めます。分析が必要な各ストレッチマグニチュードで、ゲルとシリコーンとの間の界面をスキャンして、ゲルがその円周全体のどの点でもシリコーンから剥離していないことを確認し、その後、後処理分析のためにゲル領域全体の高解像度タイルZスタック画像セットをキャプチャします。ゲル延伸中にビーズ凝集体を拡大し、手動で追跡することで、軸方向と垂直方向の局所ゲルひずみを計算できます。通常、軸方向のストランドは、シリコンの切り欠きエッジからゲルの中心まで比較的直線的に伝播し、圧縮垂直ひずみよりも大きくなります。ここでは、典型的な非延伸で比較的等方的なハイドロゲルの高倍率画像と、伸張方向に高度に整列した繊維を描いた高80%カットアウトひずみ下の水素を示しています。繊維の配向再の解析により、繊維の配向とカットアウトの外部ひずみとの間には、40%のひずみまではほぼ線形に依存し、40%を超えるひずみでは中程度の飽和が見られましたこの繊維の配向解析に示すように、カットアウトの外部ひずみが増加すると、繊維の配向は全体的に非線形の曲線に沿って増加します。伸張に対するゲルの応答は、そのZ厚さに沿って比較的均一であることに注意してください。この予備的な有限要素シミュレーションで2D連続材料に対して行われたように、カラーマットの範囲は38〜42%であり、ゲルひずみが円形ゲル領域全体で比較的均一であることを示しています。サンプルの信頼性の高い延伸には接着性と連続性が重要であるため、ヒドロゲルが幾何学的な切り欠きの内壁に完全に付着していることを確認することが重要です。シリコーンカットアウトの形状を変更することで、ひずみと繊維の整列の勾配をプログラムできるため、細胞を埋め込むときにこれらの勾配に対する応答を解析できます。

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