Name: 創傷応答中のゼブラフィッシュ好中球中のケモカイン受容体のライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ好中球のケモカイン受容体ダイナミクスのライブイメージング手法。回転円盤共焦点顕微鏡とMATLAB解析により、創傷応答における受容体動態を可視化し、免疫応答メカニズムの理解に貢献します。

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共焦点顕微鏡の協力をしてくれたクリスティーン・ホルトとビル・ハリスに感謝します。蛍光タイマーバックボーン構築物のDarren GilmourとTol2-LyzバックボーンベクトルのAnna Huttenlocherに感謝します。Steve Renshaw さんの Tg(mpx:GFP)i114 ラインに感謝します。この作業はMRC(MR/L019523/1)、ウェルカム・トラスト[204845/Z/16/Z]によって支援された。アイザック・ニュートン・トラスト[12.21(a)i]とアイザック・ニュートン・トラストは19.23(n)を認可します。C.C.はMRC DTPの学生として、また一部はWellcome Trust [204845/Z/16/Z]によって支援された。アイザック・ニュートン・トラスト [12.21(a)i] 助成金H.W.はMRC DTPスチューデントシップによって支援されました。H.P.はウェルカム・トラストの博士号助成金(105391/Z/14/Z)とウェルカム・トラスト[204845/Z/16/Z]の支援を受けた。アイザック・ニュートン・トラスト [12.21(a)i] 助成金と MRC (MR/L019523/1).

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著者は利益相反がないと宣言しています

記載された方法は、組織損傷に対する炎症反応の間にその場で内因性リガンドに応答した受容体動態のライブ画像化を可能にする。Cxcr1/Cxcr2好中球レポーターの使用は、感染、腫瘍モデルまたは他のタイプの組織損傷などの他の生理学的設定に拡大することができる14,25,26,27。さらに、内因性受容体が外因性変異受容体によって抑制およびレスキューされるトランスジェニックレスキューラインは、免疫応答における特定の好中球遊走パターンの重要性を解剖するための有用なツールを提供する可能性がある。例えば、脱感作障害を有するCxcr1受容体変異体は、炎症部位14においてより顕著な好中球クラスタリングを引き起こす。この機能表現型の獲得は、創傷修復、感染症、腫瘍の進化などのさまざまな生理学的プロセスにおける好中球会衆の役割を理解し、受容体ノックダウン/ノックアウト実験を補完するために使用することができる。この方法論はまた、利用可能なレポーターの範囲を拡大するための基礎を提供する。蛍光レポーターの選択は考慮することが重要であり、生物学的な問題に依存する。我々は、好中球におけるこれらのケモカイン受容体の構成代謝回転が上皮細胞と比較して高く、成熟の速いレポーター(例えば、sfGFP)が定常状態で膜レベルを報告し、好中球刺激時に差異を解決するために必要とされることを見出した8,14。したがって、sfGFP/tagRFPの膜比は、この細胞型におけるリガンド誘導インターナリゼーションの測定には適用できないが、tagRFPのパターンは受容体の細胞内運命の追跡を可能にし、いくつかの研究において有用であり得る。また、tagRFPの細胞内シグナルがより集中していることが、個々の幼虫のスクリーニングに有用であることも見出した。原形質膜における受容体レベルを測定するための代替アプローチは、同じ導入遺伝子9または独立した導入遺伝子14のいずれかにおいて好中球において蛍光膜マーカーを共発現させることであろう。前者のシナリオでは、導入遺伝子は魚をスクリーニングするための追加の手段を提供し、発現レベルはマーカーと受容体の間で同等であろう。後者のアプローチは、受容体レポーターを有するゼブラフィッシュ系統を異なるレポーター系統と組み合わせることができるという点で、よりモジュール化されるであろう。いずれの場合も、受容体レベルの膜定量化がクラスター化好中球において困難であることは注目に値します(下記参照)。最後に、このプロトコルの拡張の可能性は、より詳細な局在化分析のために免疫組織化学によるライブイメージングをフォローアップすることであることに留意する。
Tol2トランスジェネシス系は十分に確立されており7 、リゾチームCプロモーターは好中球発現11、15に広く使用されている。したがって、トランスジェネシスアプローチは比較的単純であり、このプロモーターで達成される発現レベルは、受容体ダイナミクスの分析に十分なコントラストを提供するのに十分高い。可能な制限は、発現レベルが内因性受容体発現レベルを反復しないことである。新しいCRISPR技術を導入して、特に関心のある受容体に対するノックインラインを確立することができる28。これらの技術はまだ煩雑であり、細胞内イメージングに必要な発現レベルを保証するものではないかもしれないが、それらの成功した開発は、内因性シグナル伝達ダイナミクスを理解するための重要なブレークスルーとなるであろう。機能検証は、トランスジェニック受容体構築物を用いてデータを解釈するために重要である。例えば、リガンド認識アッセイを使用して、蛍光融合タンパク質が機能的であることを立証することができ、ノックアウト表現型のレスキューを使用して、トランスジェニック好中球発現レベルが機能性14と適合性であることを立証することができる。最後に、受容体融合を検証するより直接的な方法は、標識受容体を非標識バージョン14とともに有するin vitro機能アッセイを利用することである。
定量化アプローチは、インビボでの好中球における正確な膜セグメンテーションにおける特定の困難に対処する。上皮性の細胞では、膜受容体レベルを制御マーカーに正規化することによって受容体レベルの定量を自動的に実行することができ、これはタンデムまたは別々に発現させることができる9。実際、我々は、このようなアプローチを、胃胚14においてリガンド認識アッセイを使用する場合に適用した。しかし、好中球はインビボで細胞形状の複雑で急速な変化を受け、2Dおよび3D14の両方で膜セグメンテーションを困難にする。これは、好中球がクラスター化するとさらに困難であり、これは多くの生理学的設定で起こる29。コントラスト測定は、膜セグメンテーションを必要とせず、代わりに細胞内の受容体分布の全体的な状態(膜状/滑らか対小胞性/点状)を反映するため、この制限を克服します。コントラストメトリックは画像の全体的なコントラストの影響を受ける可能性があるため、異なる胚/サンプルにおけるシグナルの変動性を考慮するには、個々の細胞値を内部参照に正規化する必要があることに注意することが重要です。例えば、CHT中の非応答性好中球(すなわち、静止したままで腹側フィンに移行しない好中球)の平均細胞コントラスト値を使用した14。追加の可能性は、同じセル内の対照マーカーのコントラスト値で正規化することです。これは、非応答細胞の内部参照が利用できない場合に解決策を提供し、異なる条件間の受容体ダイナミクスのより細かい定量的差異を解決する可能性がある。
イメージングの位置は、考慮すべきもう 1 つの変数です。ここで腹鰭創傷を選択する理由は、より一般的に使用される尾びれ創傷モデル16,30とは対照的に、創傷部位が好中球居住/遊走起源の部位の近くにあるためである。これにより、好中球が到着するのに比較的短い時間がかかるため、アッセイのタイムラインが加速されます。さらに、遊走起点(CHT)と標的の関心位置(創傷)の両方で細胞の挙動をキャプチャする機会を提供します。これは、細胞内イメージングに必要な空間的および時間的分解能が、大きな視野またはマルチポジションスキャンと組み合わせることが困難であるため、ここで関連しています。したがって、腹側ひれ創傷アッセイは、遊走起源からの遊走応答の進化の追跡および応答しない細胞における非特異的受容体変動の同時捕捉を可能にする。前述のように、後者は、不特定のダイナミクスの内部基準を提供するため、定量化の目的に有用である。他の系では、そのような内部基準を有することができない場合があり、その場合、共発現膜マーカーのコントラスト値は、代替制御を提供するであろう。
要約すると、この方法論は他のシステムにも適用可能であり、さまざまな目的に展開できると期待しています。例えば、同じレポーターを、感染設定または他の疾患モデルなどの他の炎症性設定において利用することができる。ゼブラフィッシュ受容体レポーターラインのレパートリーは、他のシグナル伝達受容体に拡張して、シグナル伝達機構を理解したり、インビボでのリガンドダイナミクスを報告したりすることができる。このアプローチをノックダウン/ノックアウト技術と組み合わせて、観測されたダイナミクスの機構的基礎を調査することができます。例えば、リガンド発現の摂動は、観察された受容体ダイナミクスに対するリガンド依存性を示すことができる。将来的には、レポーターのノックイン挿入を取り入れるために、システムをさらに洗練させることができると想定しています。究極的には、この方法論を用いた知見は、哺乳類におけるこれらのシグナル伝達受容体の保存と、より大きな生物でこれらの研究を実施することの相対的な課題を考えると、ゼブラフィッシュコミュニティを超えて価値のある新しい洞察を提供するであろう。

白血球の移動は、免疫応答にとって最も重要である。免疫細胞は原型的な遊走細胞であり、組織や血管を横断し、微生物や他の重要な宿主細胞に向かって方向に移動するためのさまざまな化学的誘導の手がかりを感知する能力が非常に高い。正しいガイダンスは化学誘引物質の認識に依存しており、その中でケモカインは最も顕著なカテゴリー1を表す。ケモカインは、高度に特異的な7回膜貫通Gタンパク質共役型受容体によって認識される。ケモカイン結合すると、ケモカイン受容体は立体構造を変化させ、関連する三量体Gタンパク質の活性化および細胞骨格変化および指向性遊走を促進する機能的シグナル伝達サブユニットへのそれらの解離をもたらす1。第二に、ケモカイン受容体はリン酸化され、この修飾は誘引物質に対する脱感作をもたらし、その後、細胞表面からの急速な再感作/リサイクルまたは細胞内分解およびダウンレギュレーションが続くことができる2。これらの受容体ダイナミクスは、細胞が受けるシグナル伝達の持続時間および用量に影響を及ぼすが、それらが白血球遊走挙動にどのように影響するかを生体内で解明することは困難であった。
従来の哺乳類系における生きた白血球における受容体ダイナミクスの追跡は、いくつかの課題に直面している。ライブ研究では、蛍光タンパク質との受容体融合を細胞内で発現させなければならない。これは初代白血球、特に好中球において困難であり、これまでの研究では、ケモカイン受容体を発現するために代理好中球細胞株を使用してきた3,4。白血球が有益なトラフィッキング欠陥5,6を有する蛍光受容体または変異受容体を発現するトランスジェニックマウスモデルの作製には、かなりの時間と資源の投資が伴う。これらの例においても、生きた動物における受容体動態を画像化するための画像化分解能およびコントラストは制限される可能性があり、研究は固定組織切片5で免疫組織化学を用いている。これらの技術的課題を考えると、化学誘引性受容体のダイナミクスが生きた組織環境における細胞挙動にどのように影響するかについての我々の理解は、現在限られている。
ここでは、ゼブラフィッシュ好中球における受容体トラフィッキングを監視するための方法論を提供する。ゼブラフィッシュはマウスと同様に遺伝的に扱いやすいが、効率的なトランスポゾン系と直接受精卵操作の使用により、トランスジェネシスは比較的簡単である7。透明な幼虫は理想的にはイメージングに適している。ケモカイン受容体ダイナミクスは、蛍光レポーター8、9、10との対応する融合体の発現によって始原生殖細胞および側線原基において視覚化されている。ゼブラフィッシュの幼虫は、哺乳類の好中球に関して高度に保存された遺伝的および細胞的特性を有する成熟した好中球を備えている。細胞骨格ダイナミクスおよび極性調節因子などの細胞内シグナル伝達ダイナミクスは、対応するトランスジェニック株11、12、13の生成によってこれらの細胞において視覚化されている。最近、我々は、組織損傷に対する炎症反応の過程で好中球におけるケモカイン受容体動態を可視化し、機能的に解析した14。ここでは、好中球におけるケモカインシグナル伝達のためのトランスジェニックレポーターラインの生成、ライブイメージングのための胚の調製、好中球シグナル伝達を研究するための創傷アッセイ、および画像の取得および分析のためのプロトコルについて説明する。また、候補リガンドに対するケモカイン受容体応答を試験するためのサイドプロトコルも提供しており、これは特徴付けられていない受容体におけるリガンド認識パターンを確立しようとする際に有用である。これらの技術は、内因性ケモカイン発現の阻害またはリガンド誘導性トラフィッキングの変化を伴う変異型受容体の生成などのさらなる遺伝子操作と組み合わせて使用して、特定のシグナル伝達ダイナミクスがインビボでの白血球挙動にどのように影響するかを調査することができる。蛍光標識されたケモカイン受容体を発現するトランスジェニック株は、直接抗体染色では検出が困難な内因性ケモカイン勾配のレポーターとしても使用することができる。記載された方法論は、レポーターの生成を他の免疫シグナル伝達受容体に拡大するための範囲を提供する。

<table><tbody><tr><td>1-フェニル-2-チオ尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-25G</td><td></td></tr><tr><td>50mL CellStar 遠心分離管</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>クラーク毛細管</td><td>ハーバード大学装置</td><td>30-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cleanline 薄い漂白剤</td><td>科学実験室用品</td><td>CLE0301</td><td></td></tr><tr><td>解剖スコープ</td><td>ニコン</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Dri Block heater</td><td>Techne</td><td>FDB02AD</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps, Jewelers Dumont No. 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底マイクロウェル皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>11795098</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Ambion mMESSAGE mMACHINE SP6 転写キット</td><td>Invitrogen</td><td>10391175</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>成重</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Inc., Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシステム</td><td>Parker</td><td>Picospritzer III</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダー ピペットチップ</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>成重</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット プーラー</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>フレーミング/ブラウン P-97</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Thermo-Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Spinning Disk UltraVIEW ERS, Olympus IX81 spinnng disk confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (120mm)</td><td>Grenier Bio-One Limited</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Phenol red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) tailling Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad ソフトウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型ペイントブラシ</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スペクトル応用研究 LMM5 レーザーモジュール</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>外科用メス ブレード No. 23</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>横河電機CSU10 スピニングディスク共焦点スキャナー</td><td>横河電機</td>用コンフォーカルスキャナー <td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

創傷応答中のゼブラフィッシュ好中球中のケモカイン受容体のライブイメージング

Live Imaging of Chemokine Receptors in Zebrafish Neutrophils During Wound Responses

化学的勾配による白血球誘導は、免疫応答に不可欠である。好中球は、重要な抗菌機能を実行する組織損傷部位にリクルートされる最初の細胞です。これらの遺伝子座への彼らのトラフィッキングは、ケモカインを含むいくつかの炎症性化学誘引物質によって画策されている。分子レベルでは、化学誘引性シグナル伝達は、対応する受容体の細胞内輸送によって調節される。しかし、ケモカイン受容体の細胞内変化が細胞および組織レベルで白血球遊走ダイナミクスにどのように影響するかは不明のままである。ここでは、組織損傷に対する炎症反応中の好中球におけるケモカイン受容体ダイナミクスのライブイメージングおよび定量分析のための方法論を説明する。これらのツールは、ゼブラフィッシュ好中球における示差的ケモカイン受容体トラフィッキングが、組織損傷部位における好中球クラスタリングおよび分散を調整することを明らかにした。これは、炎症反応がどのように自己解決されるかについての我々の理解に意味を持つ。記載されたツールは、様々な生理学的および病理学的設定における好中球移動パターンを理解するために使用でき、方法論は他のシグナル伝達受容体に拡張することができる。

腹側フィン創傷に続いて、CHTから腹側フィンへの迅速な好中球動員と、30〜60分以内に創傷縁でのクラスタリングが続く(図1)。我々は、ゼブラフィッシュ好中球24によって発現され、Cxcl8aおよびCxcl8b14を認識する2つのケモカイン受容体Cxcr1およびCxcr2の分布を、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて可視化した。我々は、好中球が受容体の蛍光タイマー(FT)構築物、すなわちsfGFPとtagRFPのタンデムとの融合を発現するTg(lyz:Cxcr1-FT)およびTg(lyz:Cxcr2-FT)の2つの対応するトランスジェニックラインを生成した(図2および参考文献14)。2つの蛍光色素の使用は、新たに合成された受容体が緑色に蛍光を発し、8,14歳になると徐々に赤色になるため、広範囲の受容体運命のモニタリングを可能にし、原形質膜でのタンパク質代謝回転時間の推定値を提供することを目的としていた。しかし、これらの受容体は好中球原形質膜で構成代謝回転が速く、滞留時間がtagRFPの成熟時間よりも短く、sfGFPは膜局在化を示し、tagRFPは定常状態で小胞局在を示すことが見出された(補足ビデオ1および参考文献14)。そこで、組織損傷部位におけるリガンド誘導インターナリゼーションをモニターするために、sfGFPの分布に着目した。受容体分布のパターンは、隣接するピクセル間の強度の違いを報告するコントラスト測定法を用いて定量化した。その根拠は、受容体分布が膜状で滑らかである場合、コントラスト値が低いことである。受容体分布が小胞状でより穿刺性である場合、コントラスト値は高い(図3)。
別の方法は、対照膜マーカー、例えば膜CFP(mCFP)のレベルに対する受容体レベル(sfGFP強度)の比を定量化することである(図3)。どちらの方法も、細胞内の全球的な小胞受容体分布パターン(コントラスト値が高い)または膜での受容体レベルが低い(sfGFP/mCFP比が低い)ことによって示されるように、受容体の内在化を検出することができた。しかし、コントラスト測定は、膜セグメンテーションの精度が低く、適用できない創傷の好中球クラスターにおける受容体インターナリゼーションを検出することもできます(図3)。この測定基準を使用して、創傷における好中球におけるCxcr1とCxcr2のトラフィックの目に見える違いを定量化することができました(図4および補足ビデオ2)。Cxcr1-FTは創傷に位置する細胞にインターナライズされたが、Cxcr2-FTは創傷の好中球において膜性のままであった(図4A-C、補足ビデオ2および補足ビデオ3)。Cxcl8aおよびCxcl8bの抑制は、モルホリノ処置を介して、創傷におけるCxcr1−FTインターナリゼーションに差次的に影響する(図4C、D)。Cxcr1-FTがCxcl8aに応答することをさらに検証するために、我々は初期胚においてケモカイン応答アッセイを実施した。我々は、Cxcr1-FTが、Cxcl8aが共発現した胚において顕著に内在化することを見出した(図5)。全体として、これらの結果は、記載された方法が好中球におけるケモカイン誘発受容体インターナリゼーションを測定し、これらの効果を媒介するリガンドの同一性を確立するために展開され得ることを示している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig01.jpg"> 図1:腹側ひれ傷への好中球移動。 (A)(左)尾側造血組織(CHT)、金星循環(VC、青)、腹びれ(VF)および創傷部位の位置を示す3dpf幼虫の漫画。(右)好中球がCHTから動員され、創傷に集結する創傷の領域(W)を描いた漫画。CHT組織の尾静脈神経叢(CVP)は青色で描かれている。(B)腹側ひれ創傷とTg(mpx:GFP)幼虫の好中球分布を示す明視野画像(左)と共焦点投影(右)。破線は VF と CHT のアウトラインを示します。スケールバー = 25 μm。漫画と蛍光画像は、ref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig02.jpg"> 図2:好中球におけるケモカイン受容体トラフィッキングのライブイメージング。 (a)Cxcr1-FT(蛍光タイマー)およびCxcr2-FTの好中球特異的トランスジェニック発現に使用される構築物。Tg(lyz:Cxcr2-FT)、下)は、tRFP(マゼンタ)とsfGFP(緑)チャンネルを示しています。(B)図1Aのような3dpf幼虫の解剖学的スキーム。幼虫の下には、好中球がCHTから動員される(上)または腹びれに入るときに走化を行う(下)創傷(W)の領域を描いたスキームがある。破線の四角形は、右側のスナップショットでイメージ化された領域を示します。(C)CHT(上部パネル)または創傷(下部パネル)に向かって走化性に動員されたTg(lyz:Cxcr1-FT)幼虫(sfGFPが示されている)中の好中球。矢印は、時間の経過と共に同じセルを示します。右の画像上の時点は、左側の画像から分が経過した分である。(D)ケモカイン受容体トラフィッキングのライブイメージングのための実験的アプローチの概略図。パネルA-Cは、ref.14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig03.jpg"> 図3:受容体ダイナミクスの定量化例 単一(青)またはクラスター化好中球(緑)の創傷またはCHT中の非動員好中球(赤、オレンジ)をセグメント化し、異なる方法によって分析して結果を比較した。示されているのと同じ例の細胞を2つの方法で分析し、画像に見られるものを抽出された値の範囲に関連付ける。(a)選択された、例えば細胞の表面を、sfGFPチャネルにおける輪郭定義に基づいてセグメント化した。(B)コントラストは、Aに示す例の細胞から計算した。その後、sfGFP/CFPのレシオメトリック分析を行った。(D) sfGFP/CFPの比率は、Cに示す例の細胞で計算された。エラーバーは個々の細胞からのS.E..Mを表し、n&gt;1の場合、ここでの値は統計分析には使用されず、異なる定量方法で得られた測定値を例示するためにのみ使用された。スケールバー = 10 μm。図はref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から変更した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig04v2.jpg"> 図4:創傷に応答したCxcr1およびCxcr2の微分ダイナミクス。 (A)創傷後80分における創傷におけるTg(lyz:Cxcr1-FT)またはTg(lyz:Cxcr2-FT)幼虫における好中球の共焦点投影(sfGFPチャネルを示す)。スケールバー = 10 μm。 (B)創傷におけるCxcr1-FT好中球(左)およびCxcr2-FT(右)の拡大。緑色の受容体は灰色で示されている。(C)正規化されたコントラスト(CHT中の非動員細胞の平均コントラストに正規化された個々の好中球当たりのコントラスト)。cxcl8aは、cxcl8aに対する平行移動ブロッキングモルホリノと共にスプライスブロッキングの注入を指す。cxcl8bは、cxcl8bに対するスプライスブロッキングモルホリノによる注入を指す。Tg(lyz:Cxcr1-FT)の場合:8匹の幼虫由来のn=24細胞(CHT)、n=47細胞(創傷)。モルホリノを有するTg(lyz:Cxcr1-FT)の場合:5匹の幼虫からn = 28細胞(Cxcl8a-MO)、5匹の幼虫からn = 16細胞(Cxcl8b-MO)。Tg(lyz:Cxcr2-FT)の場合:3匹の幼虫からn=10細胞(CHT)およびn=20細胞(創傷)である。データは、1〜5回の画像化セッションで獲得した独立した幼虫からプールした。Tg(lyz:Cxcr1-FT)に対するダンの多重比較検定によるクラスカル-ウォリス検定、Tg(lyz:Cxcr2-FT)に対する両側不対マン-ホイットニー検定。(D)フィン創傷に応答するcxcl8aモルホリノ(MO)(左)およびcxcl8b MO(右)で処置されたTg(lyz:Cxcr1-FT)トランスジェニック幼虫における好中球の共焦点投影(緑色で示すsfGFPチャネル)。同等の好中球蓄積の時点で撮影されたスナップショット(左の画像では創傷後85分、右の画像では創傷後45分)。スケールバー = 10 μm。図は、ref.14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61679/61679fig05.jpg"> 図5:初期胚におけるケモカイン応答アッセイ。 100pgのCxcr1-FT mRNAの発現および分布を示す胃胚のレーザー走査共焦点スライスを、150pgのCxcl8a mRNAの有無にかかわらず1つの細胞期卵子に注入した。緑色および赤色の受容体は、別々のチャネルに示されている。コントロール膜CFPマーカー(mCFP)は、シアンチャネルで示されている。スケールバー = 20 μm。ref.14( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から修正した図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61679/61679fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ムービー1:3dpfのTg(lyz:Cxcr1-FT)(左)およびTg(lyz:Cxcr2-FT)(右)幼虫の頭部におけるトランスジェニック好中球。sfGFP(緑)、タグRFP (マゼンタ)。フレーム間隔は 30 秒、フレームレートは 5 fps です。スケールバー = 20 μm。ビデオはref.14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から発信されています。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie1.avi" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ムービー2:Tg(lyz:Cxcr1-FT)(左)およびTg(lyz:Cxcr2-FT)(右)の好中球は、ひれの傷に応答するトランスジェニック幼虫である。映画は負傷後10分以内に始まり、60分続きます。フレーム間隔は 30 秒、フレームレートは 10 fps です。CHT = 尾側造血組織。VF = 腹びれ。スケールバー = 25 μm。ビデオはref.14(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から発信されています。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie2.avi" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ムービー 3. 傷ついたTg(lyz:Cxcr1-FT)トランスジェニック幼虫(ビデオ2に示されているものとは異なる幼虫)からの好中球のさらなる例は、より高い解像度で取得され、CHTへの動員時または腹鰭における侵入および走化性時に受容体内在化(緑色で示すsfGFPチャネル)を示す。フレーム間隔は 30 秒、フレームレートは 2 fps です。スケールバー = 10 μm。ビデオはref.14 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)から発信されています。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary_Movie3.avi" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%201.m" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%202.m" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%203.m" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル4:<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61679/Supplementary%20file%204.m" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、ゼブラフィッシュ好中球における化学誘引受容体ダイナミクスのライブイメージングおよび定量分析を実行するためのプロトコルについて説明します。

Leukocyte guidance by chemical gradients is essential for immune responses. Neutrophils are the first cells to be recruited to sites of tissue damage ...

好中球は、局所的に産生された化学リガンドに応答して創傷に浸潤する重要な炎症細胞です。このプロトコルにより、in vivoでそのようなリガンドに応答した受容体動態を可視化することができます。ケモカイン受容体レポーターの使用は、感染モデルや腫瘍モデル、他の免疫細胞など、他の生理学的設定に拡大できる可能性があります。この方法により、白血球が組織内のいつ、どこで化学誘引分子を感知したかを追跡することが可能になる。これにより、免疫応答がどのように展開し、解決するかをより深く理解することができます。ゼブラフィッシュの幼生の腹鰭の傷を負わせるには、細かい幼生の操作が必要なため、実験目的ではない幼生にはある程度の練習が必要です。受精後2.5〜3.5日目に、麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼生を蛍光解剖スコープの下に置き、トランスジェニック受容体発現を持つ幼虫を選択します。選択した幼虫をE3培地を補充したトリカインを含む120ミリメートルのペトリ皿に移し、滅菌メスを使用して各幼虫の腹鰭を十分に深く切断し、尾側造血組織血管を切断せずに好中球の動員を十分に深くします。ガラス底皿に500マイクロリットルの2X Tricaineを加え、次に500マイクロリットルのアガロース溶液を加え、ピペットチップで穏やかに攪拌して混合します。ピペットを使用して、麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼生を損傷したゼブラフィッシュの幼生を皿に移し、魚の尾側部分がガラス底にできるだけ近づくように優しく押し下げながら胚を横向きにします。胚が所定の位置にあるとき、アガロースを冷まします。5〜10分後、小さな絵筆でゲルにそっと触れて固化を確認し、0.2ミリグラム/ミリグラムのトリカインを補充した2ミリリットルのE3培地をプレートに加えます。スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して創傷部位を画像化します。できるだけ早く、アガロースがセットされた後、胚を共焦点イメージングスピニングディスクプラットフォームに移し、ステージジョイスティックと顕微鏡対物レンズを使用して魚を見つけます。30〜40倍の対物レンズを使用して、創傷領域に焦点を合わせ、創傷の周囲を画像化するフィールドを選択します。レーザーを選択して露光時間を調整し、目的の時間で30秒ごとにタイムラプスを設定し、視野を記録するための明視野画像を取得します。創傷部位での好中球受容体の内在化を定量化するには、フィジーで画像データセットを開き、タイムスライダーを使用して各データセットの代表的な関心のある時間枠を選択します。MATLAB で新しいスクリプトを作成し、画像の読み取り、開く、および関心のあるポイントの手動選択のための関数を含めます。スクリプトを実行して目的のフレームを開き、分析のために好中球をクリックします。腹鰭の創傷と尾側造血組織の両方で、それらの重心の推定を記録します。アクティブコンター手法を使用して各フレームの好中球をセグメント化し、各好中球のグレーレベル共起行列の計算を追加するスクリプトを作成します。これには、グレーレベルの共起行列に基づく好中球のコントラストの計算が含まれます。腹鰭の個々の好中球の値を個別に保存するコマンドを追加し、すべての尾側造血組織好中球からの平均好中球コントラスト値の計算を含めます。創傷部位の個々の好中球のコントラスト値を尾側造血組織の計算された平均コントラストに正規化して、受容体の出現が個々の応答細胞内で制御された非応答細胞と比較してどの程度点在しているかを反映する正規化されたコントラストを取得します。次に、[実行] をクリックしてスクリプトを実行します。腹鰭の傷に続いて、尾側造血組織から腹鰭への急速な好中球の動員が続き、損傷誘発から30〜60分以内に創傷縁に集まります。この解析では、ゼブラフィッシュ好中球が発現するケモカイン受容体CXCR1およびCXCR2を、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて画像化しました。受容体分布のパターンは、隣接するピクセル間の強度の違いを報告するコントラストメトリックを使用して定量化されました。別の方法は、制御された膜マーカーのレベルに対する受容体レベルの比率を定量化することです。造影剤メトリクスを使用して、創傷の好中球クラスターにおける受容体の内在化を検出すると、創傷部位の好中球におけるCXCR1とCXCR2の輸送の目に見える違いを定量化できます。例えば、この解析では、創傷部位に位置する細胞における蛍光タグ付きCXCR1の内在化は経時的に増加しましたが、蛍光タグ付きCXCR2は創傷の好中球の膜上に留まりました。モルフォリン処理によるCXCR1およびCXCR2リガンドの抑制は、創傷部位での蛍光タグ付きCXCR1の異なる内在化をもたらします。さらに、初期胚では、蛍光タグ付きCXCR1は、受容体リガンドが共発現している胚で顕著に取り込まれます。このプロトコルを試みるときは、創傷への好中球動員中の受容体ダイナミクスを捕捉するために、創傷後にできるだけ早くイメージングを行う必要があることに留意してください。正常な幼虫のケモカイン受容体のイメージングに続いて、研究者は調節不全の炎症を持つ突然変異幼虫の比較イメージングを行うことができます。

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Research

JoVE Journal

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学ぶ ゼブラフィッシュ好中球のケモカイン受容体ダイナミクスのライブイメージング手法。回転円盤共焦点顕微鏡とMATLAB解析により、創傷応答における受容体動態を可視化し、免疫応答メカニズムの理解に貢献します。

創傷応答中のゼブラフィッシュ好中球中のケモカイン受容体のライブイメージング

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