創傷応答中のゼブラフィッシュ好中球中のケモカイン受容体のライブイメージング

ここでは、ゼブラフィッシュ好中球における化学誘引受容体ダイナミクスのライブイメージングおよび定量分析を実行するためのプロトコルについて説明します。

好中球は、局所的に産生された化学リガンドに応答して創傷に浸潤する重要な炎症細胞です。このプロトコルにより、in vivoでそのようなリガンドに応答した受容体動態を可視化することができます。ケモカイン受容体レポーターの使用は、感染モデルや腫瘍モデル、他の免疫細胞など、他の生理学的設定に拡大できる可能性があります。

この方法により、白血球が組織内のいつ、どこで化学誘引分子を感知したかを追跡することが可能になる。これにより、免疫応答がどのように展開し、解決するかをより深く理解することができます。ゼブラフィッシュの幼生の腹鰭の傷を負わせるには、細かい幼生の操作が必要なため、実験目的ではない幼生にはある程度の練習が必要です。

受精後2.5〜3.5日目に、麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼生を蛍光解剖スコープの下に置き、トランスジェニック受容体発現を持つ幼虫を選択します。選択した幼虫をE3培地を補充したトリカインを含む120ミリメートルのペトリ皿に移し、滅菌メスを使用して各幼虫の腹鰭を十分に深く切断し、尾側造血組織血管を切断せずに好中球の動員を十分に深くします。ガラス底皿に500マイクロリットルの2X Tricaineを加え、次に500マイクロリットルのアガロース溶液を加え、ピペットチップで穏やかに攪拌して混合します。

ピペットを使用して、麻酔をかけたゼブラフィッシュの幼生を損傷したゼブラフィッシュの幼生を皿に移し、魚の尾側部分がガラス底にできるだけ近づくように優しく押し下げながら胚を横向きにします。胚が所定の位置にあるとき、アガロースを冷まします。5〜10分後、小さな絵筆でゲルにそっと触れて固化を確認し、0.2ミリグラム/ミリグラムのトリカインを補充した2ミリリットルのE3培地をプレートに加えます。

スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して創傷部位を画像化します。できるだけ早く、アガロースがセットされた後、胚を共焦点イメージングスピニングディスクプラットフォームに移し、ステージジョイスティックと顕微鏡対物レンズを使用して魚を見つけます。30〜40倍の対物レンズを使用して、創傷領域に焦点を合わせ、創傷の周囲を画像化するフィールドを選択します。

レーザーを選択して露光時間を調整し、目的の時間で30秒ごとにタイムラプスを設定し、視野を記録するための明視野画像を取得します。創傷部位での好中球受容体の内在化を定量化するには、フィジーで画像データセットを開き、タイムスライダーを使用して各データセットの代表的な関心のある時間枠を選択します。MATLAB で新しいスクリプトを作成し、画像の読み取り、開く、および関心のあるポイントの手動選択のための関数を含めます。

スクリプトを実行して目的のフレームを開き、分析のために好中球をクリックします。腹鰭の創傷と尾側造血組織の両方で、それらの重心の推定を記録します。アクティブコンター手法を使用して各フレームの好中球をセグメント化し、各好中球のグレーレベル共起行列の計算を追加するスクリプトを作成します。これには、グレーレベルの共起行列に基づく好中球のコントラストの計算が含まれます。

腹鰭の個々の好中球の値を個別に保存するコマンドを追加し、すべての尾側造血組織好中球からの平均好中球コントラスト値の計算を含めます。創傷部位の個々の好中球のコントラスト値を尾側造血組織の計算された平均コントラストに正規化して、受容体の出現が個々の応答細胞内で制御された非応答細胞と比較してどの程度点在しているかを反映する正規化されたコントラストを取得します。次に、[実行] をクリックしてスクリプトを実行します。

腹鰭の傷に続いて、尾側造血組織から腹鰭への急速な好中球の動員が続き、損傷誘発から30〜60分以内に創傷縁に集まります。この解析では、ゼブラフィッシュ好中球が発現するケモカイン受容体CXCR1およびCXCR2を、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて画像化しました。受容体分布のパターンは、隣接するピクセル間の強度の違いを報告するコントラストメトリックを使用して定量化されました。

別の方法は、制御された膜マーカーのレベルに対する受容体レベルの比率を定量化することです。造影剤メトリクスを使用して、創傷の好中球クラスターにおける受容体の内在化を検出すると、創傷部位の好中球におけるCXCR1とCXCR2の輸送の目に見える違いを定量化できます。例えば、この解析では、創傷部位に位置する細胞における蛍光タグ付きCXCR1の内在化は経時的に増加しましたが、蛍光タグ付きCXCR2は創傷の好中球の膜上に留まりました。

モルフォリン処理によるCXCR1およびCXCR2リガンドの抑制は、創傷部位での蛍光タグ付きCXCR1の異なる内在化をもたらします。さらに、初期胚では、蛍光タグ付きCXCR1は、受容体リガンドが共発現している胚で顕著に取り込まれます。このプロトコルを試みるときは、創傷への好中球動員中の受容体ダイナミクスを捕捉するために、創傷後にできるだけ早くイメージングを行う必要があることに留意してください。

正常な幼虫のケモカイン受容体のイメージングに続いて、研究者は調節不全の炎症を持つ突然変異幼虫の比較イメージングを行うことができます。