Name: LQ αおよびβパラメータ、放射線投与スキーマ、および生体内線量堆積の評価のための照射試運転と線量測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 学ぶ放射線治療実験の正確な線量測定法。固体水ファントムとイオン化箱、ラジオクロミックフィルムを用いて、臨床治療線量に連動した再現性の高い前臨床実験設計を実現し、がん治療の転帰理解に貢献します。

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著者らは、WVUの顕微鏡および動物モデルイメージングファシリティに対して、グラント番号P20GM103434によってサポートされている機器の使用に感謝したいと考えています。さらに、この研究は、国立がん研究所の助成番号F99CA25376801、およびMylanチェア基金によって、国立一般医学研究所からの助成金番号P20GM121322によって支えられました。

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著者らは開示を行う必要はありません。

上記のプロトコルは、放射線量体測定のためのユーザーフレンドリーなアプローチ、癌細胞株におけるα/β値の決定、および乳癌脳転移の前臨床モデルにおける照射のアプローチの簡単な例を記述する。これらの方法は、癌の任意のモデルを研究するために使用することができ、乳癌の脳転移に限定されません。このセクションでは、前臨床放射線療法実験の根底にある関連する複雑さを議論する。
線量測定は、1)農家室で出力を較正し、X線ユニットの線量速度が確立されるように、2)放射性クロムフィルムを用いた実用的な量体測定システムを調製する。出力キャリブレーションに関して、TG-61は水中で再生可能な方法を提供します。ここでのプロトコルは、XStrahl、放射線照射器のメーカーが推奨するGammex RMI 457固体水を使用しています。固水による相対線量測定(プロファイルまたは深さの線量曲線を最大線量まで正規化)分析は、水のそれと1%より良いと同意するが、水に比べて固体水の質量エネルギー吸収係数が高いため、絶対用量で約3〜4%の差がある。しかし、XStrahlシステムのすべてのインストールでは、出力キャリブレーションに固体水プロトコルが使用されているため、これらの違いを修正できませんでした。出力を知ることで、所望の線量を提供するために必要な露光時間の計算が可能になります。農家室と同じセットアップにフィルムを配置すると、フィルムに既知の用量を提供することができます。フィルムをスキャンすると、光学密度が提供されます。フィルムへの線量は、次いで対応する正味光学密度(露光後と露光前の光密度の差)に対してグラフ化することができる。これにより、フィルムのキャリブレーションカーブが生成されます。実験の設定を変更すると、その状況での線量率は、被写界の大きさ、深さ、照射される材料に依存するため、変化する可能性があります。実験用の設定でフィルムを露出させることは、正味の光学密度を提供し、フィルムキャリブレーション曲線を使用して、対応する用量を決定することができます。この用量をフィルムが照射された時間で割ると、用量率が得られる。この用量レートは、与えられた実験セットアップのために所望の用量を提供するために露出時間を計算するために使用することができる。上述のプロトコルは、フィルム・ドシメトリーに関連するいくつかのニュアンスを処理します。例えば、露光後、フィルムの活性層の化学反応が事実上完了するまでに約24時間を要する。この時間を待たないと、光密度が低くなります。
再現可能な量化を持つ研究のためには、特定の照射器のいくつかの重要な要素を知り、理解することが重要です。特に、使用する照射器の作り方やモデルを他の研究者に知っておき、詳細を知ることは重要です。 ソースタイプ(X線、放射性など)、エネルギー、半値層、フィールドサイズ、表面とソースからアイソ中心距離、照射された材料のサイズ、照射された材料の前後散乱の前後の減衰、実験特異的線量率、分画スキーマ、正確な線量測定装置の利用、および使用される線量測定プロトコル。これらの情報点のすべては、任意の動物または細胞19に用量を送達する前に、与えられた照射器のビーム品質をまとやかに記述するものである。このプロトコルと他の他の情報の別の関連点は、プロトコル1で達成された線量率は、単に使用されている照射器の出力であるということです。任意の実験では、生成された放射性膜の較正曲線(プロトコル2)と比較して、その特定のセットアップ(プロトコル4)の線量速度を定義することが重要です。
インビトロ実験は、がん細胞株の放射性生物学的挙動に関する重要な詳細を提供する。生体外のクロノジェニック細胞生存アッセイは、細胞株20の固有の無線感度を正確に推定および定量し、その後の細胞または小動物実験21における分画スケジュールの設計を支援する。具体的には、これらのアッセイは、線形二次モデルで使用されるαおよびβのパラメータの値を近似し、次の式に従って放射線療法に応答して細胞死を予測します。
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61692/61692equ09.jpg"> (数式 9)
ここでSFは、クロノジェニック生存細胞の生存割合であり、DはGyで放射線量であり、αとβは、パラメータ22を適合させる。α/β比は、細胞の無線感度の固有の尺度を提供し、より高い値は細胞株22の感度の増加と相関する。この機能的関係は用量に対して非線形であるため、放射線療法分画スキームの生物学的効果は、総送達用量だけでなく、画分23の数および大きさにも関連している。生物学的有効用量(BED)は、組織に送達される真の生物学的用量の尺度であり、異なる分別スキーム24,25の直接比較を可能にする。BED 式は、α/βの推定値のみを必要とし、以下に表示されます。
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/61692/61692equ14.jpg"> (数式 14)
ここでnは、d.クロノジェニック細胞生存アッセイはα/βを推定し、BED式を介した放射線療法分画スキームの直接比較を容易にする用量D.クロノジェニック細胞生存アッセイの画分数である。治療群のBEDが実験の中または間で公平でない場合、放射線療法(または他のモダリティとの放射線療法の組み合わせ)に対する組織または臓器の応答に関する誤った結論が導かれる可能性がある。例えば、5 Gyの4画分と比較して10Gyの2画は同じBEDを生み出さないので、これらのドージングスキームは生物学的応答の観点から直接比較することができない。BED式は、線形二次モデルにおける固有の制限のために不完全であるが、幅広い実験的処置条件24,25に対する公平な効果を確実に推定する。
クロノジェニック細胞生存アッセイは明らかに癌モデルにおける放射線療法効果を研究する上で重要な役割を果たしているが、インビトロ実験は癌細胞放射線生物学の機械主義的詳細をさらに探求するための多くの追加の選択肢を提供する。クロノジェニック細胞生存アッセイの単純な修飾は、パクリタキセルまたはエトポシド26、27のようないくつかのラジオ感作化学療法のための作用様式を決定するために使用された。さらにインビトロ実験オプションには、γ-H2AX病巣や53BP1染色などの特定の細胞修復経路を調べる免疫細胞化学研究が含まれる。これらの実験は、特に特定の細胞株の機械的な詳細を探査する場合、単一のモダリティと併用療法とを比較する場合に特に興味深い場合がある。他の実験的選択肢としては、細胞死の様式(すなわち、アポトーシス、壊死、有糸分裂症など)の異なる治療条件の下での細胞の炎症反応の生来の役割を調べるサイトカイン測定が含まれる。このタイプの実験は、動物実験を補完または置き換えることができ、癌細胞株の放射線生物学のより完全な理解を提供する。実施する追加実験の選択にかかわらず、プロトコル3に記載されている標準的なクロノジェニック細胞生存アッセイは、細胞株の重要な初期放射線学的評価である。
クロノジェニックアッセイと放射線線量測定は、臨床シナリオに直接似た実験を正確に計画する手段を研究者に提供します。前臨床癌小さいげっ歯類モデルの付加によって、単独でまたは生体内の処置計画の文脈で放射線に対する応答を研究することができる。動物を使用する前に、用量出力32,33の判定に用いる設定と異なる場合は、特定の設定の相対用量出力を決定することが重要である。それは&lt;10 mmのフィールドサイズの線量率を決定することになると、イオン化チャンバーの使用は、小さなフィールドと部分的な体積平均効果33内の位置合わせのために精度が低くなります。放射性クロムフィルムを使用して生体内免疫組織化学実験と組み合わせて出力を決定することは、過去16、34、35、36、37、38において出力および用量沈着を決定するために使用されてきた。

癌は、米国および世界中の多くの国で2番目に多い死因を総称する。放射線療法は、多くの腫瘍サブタイプの治療の基礎であり、すべての癌患者の約半分に投与される2,3.放射線量を照射するために使用される装置が着実に進行し、いくつかの効果的なマルチモーダル療法アプローチが4、5、6を開発したため、ほぼすべての癌の患者の転帰は、時間の経過とともに改善されたが、特定のタイプの腫瘍の患者の再発および死亡率は依然として高い7、8、9である。したがって、がんの放射線治療は基礎研究と臨床研究の活発な分野であり続けている。多くの前臨床放射線治療研究は、がんのインビトロまたは動物モデルに放射線量を提供するために小規模な照射器を使用しています。機械化された放射線生物学の詳細や新しい治療法を探求する多数の潜在的な実験により、誤った結論、再現性の悪さ、無駄な資源につながる一般的な落とし穴が発生する可能性があります。これらの落とし穴は、照射器の線量測定、モデル細胞株のインビトロ特性、インビボ照射の照射のスケジュールとセットアップの3つの重要な領域に含まれる。より高度な実験による正確で再現性の高い結果は、放射線治療研究のこれらの基本的な側面に注意を払わなければ達成することは困難である。
ここで説明するプロトコルは、これらの問題を回避または軽減するための一般化された戦略を説明し、独立した使用を目的としたいくつかの以前に開発された方法論を引き出す。これらの異なる方法は、前臨床放射線療法実験の開始または改善に興味を持つ研究者がこれを堅牢な実験レイアウトとして使用できるようにマージされました。提案されたフレームワークには、小規模動物照射器の試運転、モデル癌細胞株の基本的な放射線特性の決定、および生体内腫瘍モデルの投与および分画スケジュールを適切に設計および管理するための方法論が含まれる。

<table><tbody><tr><td>酢酸、氷河</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>この製品または同等の氷酢酸製品は許容されます。</td></tr><tr><td>クリスタルバイオレット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td>この製品または同等のクリスタルバイオレット製品は許容されます。</td></tr><tr><td>デジタルバラオメーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-650-118</td><td>圧力および温度測定用。</td></tr><tr><td>電位計</td><td>Standard Imaging</td><td>CDX 2000B</td><td>ADCLによって校正されています。補正係数が必要、Pelec</td></tr><tr><td>Film</td><td>Gafchromic</td><td>EBT3 Film</td><td>25枚のシートで提供され、キャリブレーションフィルムと実験フィルムは同じセットから来なければなりません</td></tr><tr><td>イオン化チャンバー</td><td>ファーマー</td><td>PTW TN30013</td><td>ADCL @ 2つのキャリブレーションポイントによって校正</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>このまたは同等のメタノール製品は許容されます。</td></tr><tr><td>フォトスキャナー</td><td>エプソン</td><td>パーフェクションV700</td>相当の<td>スキャナーは、V800、V10000、V11000、V12000</td></tr><tr><td>XenX</td><td>Xstrahl</td><td>NA</td><td>照射器を使用しています。</td></tr></tbody></table>

lq αおよびβパラメータ、放射線投与スキーマ、および生体内線量堆積の評価のための照射試運転と線量測定

Irradiator Commissioning and Dosimetry for Assessment of LQ &alpha; and &beta; Parameters, Radiation Dosing Schema, and in vivo Dose Deposition

放射線線量測定は、高い翻訳関連性を持つ前臨床モデルにおける放射線スキームの正確な送達と再現性において重要です。インビトロまたはインビボ実験を行う前に、照射器および個々の実験計画に対する特定の用量出力を評価する必要があります。イオン化チャンバー、電気計、固体水の設定を使用して、アイソセンターで広いフィールドの線量出力を決定することができます。イオン化チャンバの代わりに放射性クロムフィルムと同様のセットアップを使用して、異なる深さで小さいフィールドの線量率も決定することができる。放射線治療に応答したがん細胞の生体外クロノジェニック生存アッセイは、これらのデータを従来の線形二次モデルに適合させることによって細胞株の固有の無線感受性の尺度を提供する安価な実験である。これらのアッセイから推定されるモデルパラメータは、生物学的有効用量の原理と組み合わせることで、腫瘍を持つ動物実験で同等の有効用量を提供する放射線治療のための様々な分画スケジュールを開発することを可能にする。これは、生体内放射線療法のスケジュールを比較して、配信された有効用量の分散による結果の潜在的な交和を排除する際に考慮し、修正する重要な要因です。この記事では、前臨床動物およびキャビネット照射器の線量出力検証、放射線感受性のインビトロ評価、および小さな生物における放射線送達の検証のための一般的な方法を提供する。

以下のプロトコル1は、使用されている照射器に固有のGy /minで用量速度を提供する。しかし、照射器の種類に関係なく、公知の線量レートを用いて、同じフィルムを生成するプロトコル2を用いて較正曲線を生成することができ、 図2A-Bのそれと同様の較正曲線を得ることができる。プロトコル3からのアッセイが成功すると、均質に紫色に染色される細胞の明確で、よく分別されたコロニーが生じる。α/βの推定値は、文献値または他の治療群と比較して、所定の細胞株の電波感受性を解釈することができる。プロトコル2に従って開発され、 図2Bに表示される較正曲線を利用して、プロトコル4は、必要な実験照射時間を推定するために使用できる 図2A に似た2つのフィルムサンプルを生成する。使用されている照射器にオンボードポータルイメージングカメラが利用可能な場合、小動物のラジオグラムは、コリメーションの有無にかかわらず得ることができます。これらの画像を重ね合わせると、 図4Aで描かれている小動物に対するコリメートされた放射線ビームの正確な位置を示す。プロトコル5における正常な用量堆積は、プロトコル6に従って確認することができる。インビボ系またはインビトロ系に放射線が堆積していることを示す1つの兆候は、二本鎖DNA切断の検出である。 図4Bに示すように、 図4Aの右半球を通してのみ処理された同じマウスは、処理された半球のみにおいて正のγH2AX染色を示している。この図では、核はDAPIで染色され、2つのことを示しています。1)全体は、抗γH2AX抗体が組織学的分析中に適用された脳のものであり、2)未治療の半球の脳は染色されないままである。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig01.jpg"> 図1:線量出力の決定のために設定されたイオン化チャンバーと水ファントムのラフセットアップ。ピクトグラムは、照射器のキャビネット内のイオン化チャンバーおよび固体水ファントムを使用して、線量測定に必要な種々の成分を利用した基本設定を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig02.jpg"> 図2:放射性クロムフィルムを用いた較正曲線の生成(A) 放射線色素膜の代表的な色変化と用量の増加左上 (0 cGy);右下(2000 cGy)。(B)正味光学密度と線量を比較した潜在的な放射性クロムフィルムの較正曲線。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig03.jpg"> 図3:がん細胞のクロノジェニックアッセイ細胞の放射線処理は、6つのウェルプレート/シャーレ(A)または後(B)でメッキする前に行うことができます。パネル(C)において、プロトコルセクション3に従った後のMDA-MB-231乳癌細胞を用いた正常なクロノゲンアッセイの代表的な画像が表示される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61692/61692fig04.jpg"> 図4:投与量沈着の確認のための位置決め(可能な場合)および正のγH2AX免疫学的染色のための二重重膜放射計の使用。(A) 放射線ビームの配置を描いた代表的なラジオグラムを重ねた。(B)γH2AX強度の増加によって示されるように右半球への用量沈着を示す代表的な結果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61692/61692fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>補正係数</td>
			<td colspan="2">説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nκ</td>
			<td colspan="2">空気角膜キャリブレーション係数</td>
		</tr>
<tr>
<td>[(μen/ρ)Wエア]水
</td>
			<td colspan="2">空気への水の質量エネルギー吸収係数の配給;約1.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pq,チャム
</td>
			<td colspan="2">チャンバーによる光子フルエンスパータベーションに影響を与えるチャンバーステムの補正会計;約1.022</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pシース
</td>
			<td colspan="2">外イオン化チャンバのシースの補正会計;部屋が防水であるように、1の値</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pポール
</td>
			<td colspan="2">極性を考慮した補正係数プロトコル 1 で決定</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pイオン
</td>
			<td colspan="2">イオンの組換えのための補正係数を考慮;プロトコル 1 で決定</td>
		</tr>
<tr>
<td>PTp
</td>
			<td colspan="2">実験の日にテメルパチャーと圧力のための補正因子のアコカント;プロトコル 1 で決定</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:プロトコル1での線量率の決定に必要な補正因子
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>線量</td>
			<td>N</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.5</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>12*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>15*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>20*</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
*個々の実験のために10を超える用量にのみ必要です。</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:放射性クロムフィルムの較正曲線の生成に使用される用量。

放射線線量測定は、前臨床実験の精度を高め、提供される放射線量が臨床パラメータと密接に関連していることを保証する技術を提供します。このプロトコルは、適切な実験計画を確実にするために、前臨床放射線実験中に各段階で取られるステップを記述する。

LQ αおよびβパラメータ、放射線投与スキーマ、および生体内線量堆積の評価のための照射試運転と線量測定

Radiation dosimetry is critical in the accurate delivery and reproducibility of radiation schemes in preclinical models for high translational relevance. ...

このプロトコルは、正確で再現性のある前臨床放射線療法実験を確実にするために、いくつかの無線生物学的および放射線線量体法の新しい組み合わせです。これらの方法は、実験条件を国家線量基準にリンクし、放射線治療量に一致する線量の正確な測定を可能にする。再現可能な放射線治療実験の設計に焦点を当てたこのプロトコルは、研究者に高い翻訳関連性を持つ研究を行うために必要なツールと方法を提供します。線量測定校正プロトコルは、特に医学物理学のバックグラウンドを持たない人にとっては、初心者にとっては困難な場合があります。これらの実験を最初に試みる際には、放射線療法の物理学者に相談することを提案します。このプロトコルの技術は、放射線物理学者と生物医学研究者の両方に共通しています。しかしながら、これらの一部は、典型的には組み合わせて利用されない。適切な線量出力を決定するには、放射器を設定して、放射器を220ピークキロ電圧、17×17センチメートルのオープンフィールドで13ミアンペアで放射線を供給します。広い焦点を当てた0.15ミリメートルの銅フィルターでビームをフィルターし、1センチメートルのスラブ、2センチメートルのスラブ、イオン化チャンバーと1センチメートルのスラブを持つ2センチメートルのスラブを揃えます。ファントムスタックを設定した後、ファントムにイオン化チャンバーを挿入し、適切に平準化したときに表面距離にソースが33センチメートルになるようにスタックを調整します。次に、これらの測定値がアイソ中心から35センチメートルのイオン化チャンバー内に正しく配置されていることを確認します。ラジオクロミックフィルムのキャリブレーションカーブを作成するには、同じサイズと向きのフィルムをいくつか追加して準備し、固体水ファントムスタックの深さ2センチメートルにフィルムを配置します。照射を開始するには、固体水の4センチメートルの上にフィルムの1枚を置き、フィルムの上に固体水の残りの2センチメートルを置きます。露出後のフィルムスキャンを実行した後、画像ファイルを tiff ファイル形式で ImageJ にインポートし、[画像]、[色]を選択して[スプリット チャンネル]を選択します。赤色の画像チャンネルのみで、長方形ツールを使用して対象領域を描画し、Ctrl+M キーを押して結果ウィンドウから平均値を書き写すことができます。露出していないフィルムと露出したフィルムに対してすべてのピクセル値が得られたら、示された式を使用して正味光学密度を計算し、フィルムが露出した線量に対して正味光学密度をプロットし、プロットを二次曲線で適合させます。クロノジェニックアッセイを介して特定の癌細胞株のアルファ/β値を決定するには、各治療群のコロニーの結果数をカウントして各プレートの生存率の計算を可能にし、次いで、送達された対応する用量に対して生存率の自然対数をプロットし、2次関数を持つ曲線に適合させる。可変実験計画の特定の線量出力を決定するには、ソースから所望のフィールドサイズと距離を選択し、固体水ファントムを使用して、必要に応じて蓄積と後方散乱を提供し、実験計画を最もよく描写する向きにフィルムの一部を配置します。その後、用量は、その用量に対するフィルム較正曲線を用いてフィルムの正味光学密度から決定することができる。腫瘍を持つマウス治療に適したビーム位置を決定するには、ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、オンボードポータルカメラとアルミニウムフィルターを使用して、コリメーションなしで実験用マウスのラジオグラムを取得し、その後、所定の位置にコリメーションを持つラジオグラムを取得し、ImageJでラジオグラムをオーバーレイしてビーム位置を決定します。実演した検量線を利用して、2つのフィルムサンプルを生成して、必要な実験照射時間を推定することができる。これらの画像を重ね合わせると、治療対象の小動物に対するコリメートされた放射線ビームの正確な位置が明らかになる。その後、この代表的な分析においてのみ、処理された半球内で観察された正のγ-H2AX染色によって示されるように、成功した用量沈着が確認できる。照射器出力の決定からフィルムキャリブレーションカーブの生成に移行する際、および理想的な実験計画の線量を決定する際に一貫性を保つのが重要です。これらのプロトコルに従うと、研究者は前臨床環境で臨床的に適用可能な放射線生物学的質問の多種多様を研究することができます。これらの質問は、患者の転帰をよりよく理解する可能性があります。このプロトコルは、スタンドアロンの新しい手法ではありません。しかし, これらの方法論を組み合わせることは、直接的な臨床的関連性につながり、クリニックで見られる用量の結果に関する洞察を与えます.

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Research

JoVE Journal

Biology

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