等熱マイクロカロリメトリーを用いた新天然物の殺菌効果または静電効果を測定する代謝プロファイリング

新しい抗菌化合物の作用様式を理解することは、重要だが困難な作業である。この方法は、このようなメカニズムに関する洞察を提供し、実装が容易です。この技術により、非侵襲的な方法で抗菌効果をリアルタイムに観察し、さらなるサンプル分析を可能にする。

微生物学の技術で練習することが前提であるが、実験は容易に行える。マイクロカロリメトリーを初めて行う際には、データ分析に時間を取ることは非常に重要です。まず、600ナノメートルの波長の分光光度計を使用して、一晩培養の光学密度を測定します。

培養液を、新鮮なMHB培地濃度のミリリットル当たり5倍の10〜5コロニー形成単位に希釈し、目的の濃度で各1.5ミリリットルの抗生物質チューブに150マイクロリットルの細胞を加える。次に、ボルテックスにより化合物を細胞と混合します。インサートを準備するには、各細菌抗生物質混合物の120マイクロリットルを48ウェルプレートの適切なウェル内の個々のプラスチックインサートに追加し、ピンセットを使用してすべてのチタンバイアルをホルダーに配置します。

ホルダープレートのチタンバイアルに挿入物をそっと移し、チタン製の蓋をすべてのバイアルにゆるやかに置きます。すべてのインサートが移動されたら、ホルダーをサンプルステーションの指定された領域に置き、40センチメートルメートルに設定されたトルクレンチを使用してすべての蓋を締めます。システムソフトウェアで、新しい実験を開始し、サンプル挿入アームを機器から取り込みます。

カップホルダーをブリッジの上に置き、8列目をサンプル挿入開口部に向け、カップホルダーを位置1のインストゥルメントにそっと押し込みます。実験井戸にラベルを付ける前に、システムが安定するまで10分待ちます。次に、カップホルダーが2位になるまでサンプル挿入アームを押します。

システムが20分間安定した状態にした後、サンプル挿入アームを3つ位置に押し込み、サンプル挿入アームが走行位置になるまで引き込みます。ソフトウェア内のすべての井戸をハイライトし、反応開始を選択し、熱放出の読み取りが安定してゼロに戻るまで実験を実行します。解析の最後で、[停止]を選択します。

ソフトウェアは、あなたが確信しているかどうかを尋ねます。[はい]を選択し、データ分析のために実験を保存します。その後、サンプル挿入アームを器具に完全に挿入し、マグネットを巻き込んでカップホルダーを取り出します。

データを分析するには、ソフトウェアを開いて[実験を開く]を選択します。ポップアップウィンドウで、目的の実験を選択し、[開く]をクリックします。[すべて選択]をクリックし、ベースラインを定義して、各位置のデータを正規化します。

ポップアップ ウィンドウで、ラグ フェーズ内で 30 分を超える期間を選択します。選択後、ベースラインはサーモグラムに緑色で表示されます。[ベースラインの定義]セクションウィンドウを閉じて、[保存]をクリックしてソフトウェアを閉じます。

次に、ウェブベースのSymCel熱量測定解析アプリケーションを開きます。[参照] をクリックして目的のファイルをアップロードし、実験を選択します。代謝パラメータは、32個のサンプルについて自動的に計算されます。

熱流量データをゴンペルツやリチャーズ成長モデルに合わせるには、成長関数をクリックします。成長モデルは、フロー セクションの生データと比較するために、累積セクションに表示されます。計算されたパラメータをダウンロードするには、[メジャーのダウンロード] をクリックし、ファイルの場所を選択して [保存] をクリックします。

ファイルは、さらに分析するためにスプレッドシートにエクスポートされます。ここで、A.baumannii DSM-30008を連続希釈でシプロフロキサシンにさらした温度計が表示される。0.005~0.1マイクロモルの濃度は、A.バウマンニイの成長と代謝に対する影響が最小限に抑えられます。

しかし、0.5マイクロモルシプロフロキサシンで細胞を治療すると、ラグフェーズ持続時間が有意に変化し、最大熱流量が低下します。これら2つの変化はピークまでの時間に影響を及ぼし、その結果、約6時間増加する。この図では、累積放出熱は、傾斜傾斜によって反射された各濃度の効果を伴って時間に対してプロットされる。

熱グラム傾斜の定量化により、0.5ミクロモラーシプロフロキサシンで処理された細胞で観察される代謝速度の付随的な減少を伴うシプロフロキサシンの存在下でA.baumanniiの最大代謝率を計算することができます。リサンピシン治療はA.バウマンニDSM-30008の熱電グラムに劇的な影響を与えます。代謝活性の低下と相関する熱放出の有意な減少も観察される。

なお、試験濃度の全てにピークまでの時間の増加と、通常は殺菌効果に起因する全濃度の傾斜の低下によって生じる代謝率の低下に注意してください。最適な結果を得るためには、逆ピペットを使用し、サンプルを転送する際に挿入部の側面に追加の流体を防止し、また、蓋が適切に閉じられていることを確認してください。