Name: ナノ粒子追跡分析と実験間比較による水性メディアにおける金ナノ粒子の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶナノ粒子追跡分析による金ナノ粒子の水力学的直径測定法。布朗運動とストークス・アインシュタインの式を活用し、水性メディア中のナノ粒子サイズを正確に決定する実験室間比較可能なプロトコルを確立します。

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著者らは、H2020資金提供プロジェクト(ACEnano(補助金契約720952)からの財政的支援を認めている。また、韓国貿易省(助成番号N053100009「Horizon2020 Kor-EUコラボリーコ」の共同開発・BD)が資金を提供する国際協力研究開発プログラムによって部分的に支援され、Horizon 2020 ACEnanoプロジェクトのコンソーシアムへの韓国パートナーの参加を可能にしました。

ここで説明する方法論は、実験室間比較の第3ラウンドに使用された。
1. サンプルの準備
<ol><li>0.02 μmのシリンジフィルターを通して水をろ過します。水のろ過は、サンプル希釈のためにそれを使用する前に、任意の汚染粒子を除去するために必要です。</li>
	<li>作製したサンプルを分析するには、60 nmの金コロイド分散液のサンプルを、ろ過された超純水で50倍ずつ大きく希釈します。NTA分析の推奨濃度は、1 mL当たり1 x10 9粒子 です。</li>
</ol>2. 測定を行う
<ol><li>システムのスイッチを入れます。<ol>
<li>NTA機器、シリンジポンプ、コンピュータを接続します。ハードウェアとソフトウェアの電源を入れ替えます。関連付けられているソフトウェア ( 材料表を参照) により、すべてのハードウェア通信が実行され、ライブ温度読み出しが表示されます。</li>
		<li>NTAからレーザーモジュールを取り外し、組織と圧縮空気を使用して、ガラス表面と低体積フローセル(LVFC)内部チャネル、チューブ、および流体ポートを完全に乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>チューブのプライミング<ol>
<li>入口の流体チューブを超純水でリンスして粒子を除去し、測定を妨げる気泡の可能性を低減します。すすいのために、器械の包装の内部の入口の管の端は無駄な容器に置かれる。</li>
		<li>1 mL (針なし) の水を Luer ポートに挿入し、バック圧力が許す限り速く入口チューブを通して液体の約 900 μL を押します。残りの液体を含む注射器を取り付けて、任意のサイフォンを防止します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリンジポンプチューブ接続<ol>
<li>図 1に示すように、LVFC をレーザー モジュールに組み立ててサンプルチャンバを作成します。出口管をLVFCの右側のポートに取り付けます。 注: 入口と出口チューブは直径が異なり、入口は出口よりも直径が小さくなります。流入口と出口のチューブ接続を交換すると、フローセルを加圧して漏れる原因となる場合があります。</li>
		<li>注射器を入口チューブから取り外し、1 mLのろ過水を含む新しいシリンジと交換し、液体と液体の接触を確保します。入口チューブをLVFCの左側のポートに接続します。サンプルチャンバーに約500μLの液体をゆっくりと導入します。負荷時に気泡が発生しないように注意してください。最終的なチューブ構成を 図 2に示します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig1v2.jpg"> 図1:レーザーモジュールに取り付けられた低体積フローセルアセンブリ。 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig02.jpg"> 図 2: 低ボリューム フロー セルチューブ構成<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="4"><li>レーザーモジュールのロードとシステムチェック<ol>
<li>水を満たしたLVFCを入れ、レーザーモジュールをインストゥルメントに挿入し、ロックします。</li>
		<li>注射器をシリンジポンプクレードルに入れ、固定します。ソフトウェアインターフェイスで[カメラを 開始 ]をクリックしてカメラを初期化します。インターフェイスの [ ハードウェア ] タブで、[ スキャッタ ] をクリックして参照位置を移動します。</li>
		<li>カメラレベルを 16 に設定し、手動でフォーカスを調整して、パーティクルの希釈剤を確認します。メインの表示ウィンドウを左クリックし、マウスを使用して上下にドラッグしてパーティクルを確認することで、視野の位置を調整します。視野に3つ以上の粒子がある場合、これは水の純度または洗浄プロセスに問題があることを意味し、したがって、洗浄プロセスを繰り返すか、水を交換または濾過する必要があります。</li>
		<li>レーザーモジュールを機器から取り外します。</li>
		<li>注射器を入口チューブから取り外し、空気のみで満たされた注射器に交換します。サンプルチャンバーに空気をゆっくりと入れて、内部の液体を取り除きます。レーザーモジュールからLVFCを取り外し、チューブを取り外します。LVFCとレーザーモジュールの光学ガラス表面を水で洗浄し、ティッシュと圧縮空気で乾燥させます。チューブを圧縮空気で乾燥させます。LVFCをレーザーモジュールに組み立て直し、チューブを接続してサンプルローディングの準備をします。 注: この手順は必ずしも必要とは限りませんが、この場合は、可能性のある変動をさらに減らすための特別な予防措置として追加されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルを読み込む<ol>
<li>ステップ 2.2.2 を繰り返します。ステップ1.1で作られた60nm金ナノ粒子分散液の1mLを含むシリンジをLuerポートに接続します。750 μLのサンプルを、機器の外に見えるレーザーモジュールを使用して、インレットチューブを介してLVFCにゆっくりと注入し、泡が入らないようにします。</li>
		<li>レーザーモジュールをNTA計測器にロードし、ソフトウェアインターフェイスの スタートカメラ をクリックしてカメラを初期化します。インターフェイスの [ ハードウェア ] タブで、[ スキャッタ ] をクリックして参照フォーカス位置に移動し、パーティクルの鮮明なイメージを表示するために正しく設定されていることを確認します。</li>
		<li>レーザー光の位置に対して視野が中央に設定されていることを確認します。ソフトウェアのメイン表示ウィンドウを左クリックし、上下にマウスをドラッグして、それに応じて調整します。</li>
		<li>自動セットアップ機能を実行して、最適な画質を実現するために、フォーカスとカメラレベルを自動的に最適化します。 注:自動カメラとフォーカスパラメータは、ユーザーに依存しないため、異なるラボ間でより一貫性を保つことができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプル分析<ol>
<li>標準測定、SOPタブで測定スクリプトを作成し、60sの60の繰り返しビデオを遅く(粒子は画面の一方の側から約10sで他方に渡すべきである)と一定の流れ(補助ファイル1)を得る。 注: 測定のためにサンプル全体をより良く表現するためにフローを推奨します。サンプルに遅い流れが与えられると、濃度測定の精度と再現性が大幅に向上し、より多くの新しい粒子が測定ゾーンを流れ、実験中に分析されます。ビデオの長さは、プロファイルの分布と、それが分析時間にわたってどのように変化するかによって異なります。60 sの5つの動画は、典型的な測定時間と考えられています。</li>
		<li>データの実験ファイル名と場所を設定し、実行を開始します。概説された手順に続く分析は、Horizon 2020 ACEnanoプロジェクト17の7つの研究所によって行われた。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. データ分析
注: すべてのデータ分析は v 3.4 ソフトウェア内で行われました ( 材料表を参照) 追加の手動変換や計算は使用されません。粒子サイズデータはヒストグラム分布として生形で提示され、ストークス・アインシュタイン方程式を用いて粒子の位置の測定された変化から計算されます。ソフトウェアは、x および y 平面内の各パーティクルによって移動される平均距離を決定します。この値により、粒子拡散係数(D)を求めることができ、そこから、サンプル温度Tと溶媒粘度ηが既知であれば、等価の球体流体力学的半径、RH、粒子のを算出することができる。サンプルの温度はNTAによって自動的に記録されます。ソフトウェアで使用されるデフォルトのサンプル粘度は水用であり、上記の測定スクリプトに含まれていますが、測定の前後に異なるサンプル希釈剤を使用すると粘度を修正できます。
<ol><li>検出しきい値 (DT) を設定するには、2 ~ 20 の間で、視覚化されたパーティクルの最適な追跡の解析パラメータである[検出しきい値] の下にあるソフトウェアの[+]ボタンと[-]ボタンをクリックします。選択した DT 値が、できるだけ多くの可視パーティクルを識別して追跡していることを確認します(ソフトウェア イメージ画面上で赤い十字として自動的にマークされます)。<ol>
<li>検出閾値を設定するためのガイダンスとして、画像内の識別された粒子の数は、観察者によって粒子と見なされない部位に10個以下の赤十字が対応する必要がある約30〜80の範囲にあるべきである。5つ以下の青い十字架(ノイズを示す)が観察されるべきではありません。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig03.jpg"> 図3:しきい値設定観測値不良(左)と良好な検出(右)検出しきい値設定の観測。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="2"><li>ソフトウェアの[プロセス]ボタンを押して、パーティクルトラッキング解析ビデオを自動的に処理します。すべての処理パラメータを自動に設定したまま、データを.csv形式の結果ファイルとしてエクスポートし、完全なパーティクルサイズ分布と、測定設定を記述する追加のメタデータを使用します。測定品質を確認するには、ソフトウェアの[分析]タブを見るか、警告メッセージまたは警告の出力ファイル.csvを確認します。PDF 結果レポートの例は、補足ファイル 2に示されています。
</li>
	<li>PDF レポートからモードサイズの結果と関連する標準偏差を読み取ります。 注: モードサイズの結果は、7つの研究所の中で得られたサイズを比較するために使用され、セクション5で示され、議論されています。</li>
</ol>4. 洗浄と乾燥
<ol><li>使用後、清潔な水でシステムを十分に洗い流し、チューブや光学表面からサンプルの痕跡をすべて取り除きます。洗浄効果は、視野内の粒子の量を観察することによって監視することができる。</li>
	<li>NTA機器からレーザーモジュールを取り外します。</li>
	<li>システムを通して空気の注射器をロードし、チューブとLVFCを空にします。</li>
</ol>

<ol><li>Thwala, M., Musee, N., Sikhwivhilu, L., Wepener, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxidative+toxicity+of+Ag+and+ZnO+nanoparticles+towards+the+aquatic+plant+Spirodela+punctuta+and+the+role+of+testing+media+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science-Processes+and+Impacts%22%5BJournal%5D)">The oxidative toxicity of Ag and ZnO nanoparticles towards the aquatic plant Spirodela punctuta and the role of testing media parameters.</a> Environmental Science-Processes and Impacts. 15 (10), 1830-1843 (2013).</li>
<li>Lowry, G. V., Gregory, K. B., Apte, S. C., Lead, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformations+of+nanomaterials+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Transformations of nanomaterials in the environment.</a> Environmental Science & Technology. 46 (13), 6893-6899 (2012).</li>
<li>Auffan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+definition+of+inorganic+nanoparticles+from+an+environmental%2C+health+and+safety+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective.</a> Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).</li>
<li>Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+safe+are+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How safe are nanomaterials.</a> Science. 350 (6259), 388-389 (2015).</li>
<li>Briffa, S. M., Nasser, F., Valsami-Jones, E., Lynch, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+impacts+of+polyvinylpyrrolidone+%28PVP%29+capped+metal+oxide+nanoparticles+on+Daphnia+magna%3A+role+of+core+composition+and+acquired+corona%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Uptake and impacts of polyvinylpyrrolidone (PVP) capped metal oxide nanoparticles on Daphnia magna: role of core composition and acquired corona.</a> Environmental Science: Nano. 5, 1745-1756 (2018).</li>
<li>Hassellöv, M. aR. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHassell%C3%B6v%2C+MaRK+%22Analysis+and+Characterization+of+Manufactured+Nanoparticles+in+Aquatic+Environments.+Environmental+and+Human+Health+Impacts+of+Nanotechnology%22">Analysis and Characterization of Manufactured Nanoparticles in Aquatic Environments. Environmental and Human Health Impacts of Nanotechnology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 211-266 (2009).</li>
<li>Hoet, P., Brüske-hohlfeld, I., Salata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+known+and+unknown+health+risks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and known and unknown health risks.</a> Journal of Nanobiotechnology. 2 (1), 12(2004).</li>
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<li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271(2017).</li>
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<li>Walker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nano-particle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Improved nano-particle tracking analysis.</a> Measurement Science and Technology. 23 (6), 065605(2012).</li>
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<li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%3A+An+Interdisciplinary+Forum+for+Nanoscale+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research: An Interdisciplinary Forum for Nanoscale Science and Technology. 15 (12), 2101(2013).</li>
<li>Analytical and Characterisation Excellence in nanomaterial risk assessment: A tiered approach. ACEnano. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cordis.europa.ue/project/id/720952">https://cordis.europa.ue/project/id/720952</a> (2019).</li>
<li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSoille%2C+P+%22Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations%22">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations</a>. 1360, VC, SPIE (1990).</li>
</ol>

著者のジョー・サリバン、アニエスカ・シウパ、ポーリン・カーネル=モリス、ミケーレ・カルボニは、この記事で使用される機器を製造するモルバーン・ピアナリシス・リミテッドの従業員です。

ラウンド1 ILCから得られた矛盾した結果は、古いシステムの計測器ヘルスチェックの必要性、より詳細なSOPの開発、実践的なトレーニングの必要性、測定と分析の設定の理解を深め、異なるラボ全体でより一貫した結果を確保することを強調しました。実際、Hole et al. NTAシステムの使用方法とサンプルの調製方法に関する共通のガイドラインが存在しない場合、比較的単分散サンプル16であっても、実験室間で変動性が生じることを発見した。そのため、すべてのILC参加者は、システムの運用と測定の条件のベストプラクティス、および特定のNTA機器の清掃とメンテナンスのガイダンスをカバーするトレーニングワークショップに参加しました。参加者全員が、後続のILCラウンドのために、自分のラボで同じ計測器で測定を行いました。この手順では、まず、ラテックス標準サンプル(ILCラウンド2)でILCを実行して各実験室でシステムをローカルにテストしたラウンドを行い、パートナーが金測定を繰り返すために使用しました(ILCラウンド3)。NTAを用いてこれらの金サンプルを測定する目的は、ナノセーフティガイダンスプロトコルに影響を与えるために必要なナノ材料リスク評価方法と実践に自信と明快さを導入することであった。
NTAは、流体力学的な球状の粒子の直径を測定し、粒子によって粒子に使用することができる技術であり、粒子、粒子、10 nmから50nm、約1000 nmのサイズ(サンプル特性および機器構成に応じて)の範囲の多分散系のリアルタイムの視覚的分析を使用することができます。最小限のサンプル準備が必要です。サンプルの調製は最小限に抑えられていますが、このステップはプロトコルにとって重要であり、サンプルを希釈して希釈剤を選択する際には細心の注意を払う必要があります。形状は、球形の同等サイズの測定が得られ、非球状粒子が正確でないサイズ値を有するので、NTAに対する制限因子となり得る。
NTA技術では、サンプル全体から代表的なサンプルのみが観察されるため、結果の変動が常に予想されます。いずれにせよ、すべての結果は、パーティクルサイジングの ISO 19430 標準を満たしています。提供する最適濃度は、通常、30-60秒の分析時間内に約108 粒子/mlです。粒子濃度が低いサンプルの場合、再現性のある結果を得るためには、より長い分析時間が必要になります。109 個の粒子/mLを超える粒子濃度を含むサンプルの場合、トラッキングの問題が発生する可能性が高く、サンプルをNTA測定に適した範囲に希釈する必要があります。
全体として、第3ラウンドILCの結果は、正確性と再現性を高め、NTAによる金ナノ粒子測定の良好な再現性を示しています。NTAの測定はすべて、ソフトウェアの自動セットアップ機能で選択された画像を調整するために、カメラの自動レベルとフォーカス設定を使用して行われました。ソフトウェアによって設定されたカメラレベルは非常に一貫しており、予想通り、より多くの自動化プロセスがより一貫性を持っていることを示すすべてのケースで10または11のカメラレベルが設定されています。サイズ決定の結果は、結果が再現可能であることを示すTEMによって製造業者が得たものと同等であったが、TEMは水力学的直径を決定しないため、異なる技術から最小の違いが期待される。結果の一貫性の大幅な改善は、NTAの機器のメンテナンス、詳細なSOP、ベストプラクティスのアップデート、ユーザーの知識と応用測定自動化の重要性と利点を示しています。結論として、ILCはこの特定のNTA SOPを検証し、したがって、この特定のナノ材料リスク評価方法に自信と明確さを導入しました。

ナノマテリアル(NMs)は、物理的および化学的特性の両方で変化し、その動作、安定性、および毒性1、2、3、4、5に影響を与えることができます。大きな課題の1つは、NMの特性、危険、行動を十分に理解する際に、物理的および化学的なナノ材料特性に関する再現性のある情報を得ることができるというものです。このような物理的性質の例としては、粒径およびサイズ分布6,7,8が挙げられる。これらは、欧州委員会(EC)の「ナノ」9という用語の定義の重要な側面であるため、重要なパラメータです。
正確な粒子サイズ測定を達成することは、NMs6,10の運命と毒性の影響を理解することに加えて、多くの異なる産業および研究用途およびプロセスにとっても重要である。正確に、確実に、そして再現的に、NMのサイズを測定することができる十分に確立された方法を持つことは重要である。さらに、報告された情報は、例えば、使用される技術の深い理解を提供すべきであり、例えば、サイズパラメータの種類(例えば、実際のサイズまたは流体力学的サイズ)ならびにサンプル条件、例えば、NMが存在する特定の媒体、および異なる媒体において確実に実行する方法を示す。サイズを測定するために、電子顕微鏡(EM)、動的光散乱(DLS)、単一粒子誘導結合プラズマ質量分析(spICP-MS)、微遠心沈降(DCS)、走査型X線散乱(SPM)、ナノ粒子追跡(NTAA)を含む多くの技術を使用することができる。
NTAは近年高度に進められている比較的新しい技術であり、環境に関連する水媒体などの複雑な水媒体中の球形の流体力学的直径を確実に測定することが示されている。例えば淡水システム。流体力学的直径は「測定される粒子と同じ方法で拡散する架空の硬い球の大きさ」である。実際的に言えば、水性媒体では、これは粒子自体の直径よりも大きく、弱い静電力によって粒子の表面に保持される分子(主に水)の層も含む。粒子の流体力学的直径は、異なる媒体で変化し、測定される媒体のイオン強度が高くなるにつれて小さくなる。
NTA技術の他の重要な特徴は、アナリストがECナノ材料定義の文脈で必要とされる数加重サイズ測定を達成できることです。高分解能、粒子ごとの分析は、粒子スループット10,12の高い速度を有する異種試験試料中に存在する場合に、この技術が凝集体またはより大きな粒子によって引き起こされる干渉を起こしにくい。
測定手順は、サンプル希釈を必要とするサンプルの適切な懸濁液を調製することと、粒子のブラウン運動挙動およびビデオ分析のビデオ記録を行う。試料チャンバーからはレーザー光が通過し、レーザー光散乱光の経路の懸濁粒子がカメラを搭載した光学顕微鏡を用いて可視化する。カメラは、ブラウン運動の下で移動する粒子から散乱レーザー光のビデオファイルをキャプチャします。多くの粒子は、ストークス・アインシュタイン方程式を用いて、それらの拡散係数を決定するために個別に追跡することができ、それらの流体力学的直径は、ストークス・アインシュタイン方程式を用いて計算することができる:d= kT/3πηDは流体力学的直径であるd、kはボルツマン定数、Tは温度 η、粘度、Dは拡散係数10である。NTAはまた、一般的にコロイド的に不安定である粒子の凝集挙挙を追跡するために使用することができる(ただし、粒子は、測定時間スケールでコロイド的に安定でなければならない)13、14。NTAは絶対的な方法であり、この作業で使用される装置にシステム校正は必要ありません。ユーザーがシステムの性能を確認したい場合、これはサイズ標準材料を必要な頻度で測定することで簡単に行うことができます。
NTAの器械は速い分析の時間と作動容易である(サンプルごとの10分の下で)。データの再現性と再現性の高い高品質の測定には、サンプル調製と計測器の操作の両方で多くの要因を考慮する必要があります。このような要因を慎重に検討しないと、異なる実験室とオペレータ間の同じ材料の測定は、未知のまたは不十分な定量化された不確実性にさらされる可能性があります。NP特性評価の間、社内で開発されたベストプラクティスを使用して、DLS技術15のRoebbenらが示すように、他の研究室との一貫性を必ずしも保証するとは限らない。
実際、異なる実験室、ユーザー、機器間の初期の(第1ラウンド)NTA ILCは矛盾した結果を明らかにしました。主な問題の1つは、定期的なサービスやキャリブレーションチェックを行っていなかった古い古い機器の使用と、メソッドの解釈の違いでした。Hole et al. の NTA ILC の調査によると、システムの使用方法やサンプルの準備方法に関する共通のガイドラインがないため、比較的単分散したサンプル16でも、実験室全体の変動性が大きくなる可能性があることがわかりました。これは、ILCの第1ラウンドの結果と共に、良好な機器のメンテナンス、メソッドトレーニング、およびよく開発された標準操作手順(SSP)の必要性を強調しています。後者は、良い方法での準拠を記述し、文書化するための強力なツールとして機能します。詳細な場合、標準的な運用手順(SSP)は、明確さ、説明、理解、標準化、および品質保証を提供することができます。
したがって、ILC研究を採用するための推奨事項は、プロトコルの開発とテストの両方に最適です16.ILC演習は、この特定のNTA SOPを検証するために行動し、したがって、この特定のナノ材料リスク評価方法に自信と明確さを導入しました。それは3ラウンドを含んでいました。ラウンド1は、トレーニング前に各参加者自身の機器上の60 nmの金ナノ粒子を分析しました。ラウンド2では、計測器が正しく設定され、ユーザーが計測器の使い方に関する知識を持っていることを確認するために、共通の構成を備えた新しい機器を使用して100 nm latexを分析しました。ラウンド3は、トレーニング後に、共通の構成で新しい機器上の60 nm金ナノ粒子の分析を含んでいました。ILCの参加者は、Horizon 2020 ACEnanoプロジェクト17の7つの異なるラボ、すべてのコンソーシアムメンバーから来ました。
この記事の目的は、60 nmゴールドの NP が詳細なトレーニングと SOP 開発に続いて 7 つのパートナーによって再分析された NTA 技術のベンチマークの第 3 ラウンドの結果を説明することです。ILCの第1ラウンドで得られた結果の比較と参照も行われます。ILCのラウンド3からのすべての分析は、405 nmレーザーと高感度sCMOSカメラで供給される同一の構成の同じ機器( 材料表を参照)を使用して行われました。ベンチマークは、サンプル上の技術の性能を評価し、したがって、「ベストプラクティス」プロトコルの開発につながります。したがって、この記事では、国際規格に従ってICを実施・評価することにより調和を取り入れ、このILCで使用される機器のNTA法を科学界に提供する。

<table><tbody><tr><td>60 nm金コロイド分散液</td><td>BBI Solutions OEM Ltd.</td><td>製品EM。GC60、バッチ番号 024650</td><td></td></tr><tr><td>0.02 & マイクロ;mシリンジフィルター - Whatman Anotop 25 滅菌シリンジフィルター</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA68092102</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight</td><td>Malvern Panalytical Ltd.</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTAソフトウェア v3.4</td><td>Malvern Panalytical Ltd.</td><td>v3.4</td><td></td></tr><tr><td>シリンジPP / PEニードルルアースリップチップなし、中央揃え、容量1&nbsp;mL、卒業、0.01&nbsp;mL、滅菌済み</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Z230723</td><td></td></tr></tbody></table>

ナノ粒子追跡分析と実験間比較による水性メディアにおける金ナノ粒子の解析

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

ナノテクノロジーの分野では、ナノ材料(NMs)の挙動や毒性を理解する上で、分析的特徴付けが重要な役割を果たします。特性評価は徹底的に行う必要があり、選択した技術は、決定する特性、分析対象の材料、およびそれが存在する媒体に適している必要があります。さらに、計測器の動作と方法論は、データ収集エラーを回避するために、ユーザーが十分に開発され、明確に理解する必要があります。適用された方法または手順の不一致は、差を引き起こし、取得したデータの再現性が悪くなる可能性があります。本論文は、ナノ粒子追跡解析(NTA)を用いて金ナノ粒子の流体力学的直径を測定する方法を明らかにすることを目的とする。この研究は、標準的な手術手順の性能と再現性を検証するために、7つの異なる実験室間の実験室間比較(ILC)として行われた。このILC調査から得られた結果は、詳細な標準操作手順(SSP)、ベストプラクティスの更新、ユーザーの知識、および測定自動化の重要性と利点を明らかにします。

さまざまな NTA 計測器構成を使用したラウンド 1 ILC の結果を 図 4に示します。ラボ 6 を除き、5 回のキャプチャの繰り返しの繰り返し性は良好でしたが、いくつかのラボでは、予想よりも高いモード サイズを記録しました。ラボ6の結果は、再現性が悪く、はるかに高いモードサイズを測定した。調査の結果、最大サイズの変動を報告するシステムが推奨どおりに維持されていないか、希釈工程が異なるピペット装置、ユーザー操作と技術、および/または測定設定によって異なるピペット装置、ユーザー操作および技術、および/または測定設定によって生じる変動を作成することができるサンプル準備の矛盾の影響を受けたことが判明しました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig4v2.jpg"> 図 4: ILC ラウンド 1 モード サイズ結果モードサイズは、異なるNTA機器(x軸で省略された)で行われたラウンド1 60 nm金ナノ粒子分散のすべてのNTAベンチマークパートナーから生じます。
ラウンド3からのNTA結果精度は、同じSOPと計器の設定を実装するすべての研究所によって改善されました。この ILC ラウンド 3 で得られたモードサイズの結果は 、図 5に示されています。全ラボの平均モードは 62.02 ± 1.97 nm でした。ラウンド3から測定されたすべての結果は、第1段階の結果よりも一貫しており、結果は製造業者が述べたようにバッチの60.5 nmの平均サイズの10%以内に収まる。メーカーが述べた金サンプルの変動係数は≤8%であった。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61741/61741fig5v2.jpg"> 図 5: ILC ラウンド 3 モードサイズ結果モードサイズは、同じNTA機器で分析された60 nmゴールドILCラウンド3のすべてのNTAベンチマークパートナーから得られたものです。全ラボの平均モードは 62.02 ± 1.97 nm でした。
粒子径を検証するために、製造業者が提供する、少数の粒子(N=82)を透過電子顕微鏡(TEM)で分析した。希釈されていない分散液の約10 μlをカーボンコートCu TEMグリッドに滴下し、200kVで分析TEMでイメージングする前に空気中で乾燥させた。 補助図1 のような画像は、粒子の重複が最小の領域から撮影され、半自動画像解析プロセスを使用して分析された。自動集水域法を別々の粒子に適用し、このプロセスのアーティファクトを除外した。平均直径は、主軸および短径(61±7nm)から平均値として、または球状粒子を想定して測定領域(62±6nm)からの変換として計算した。パーティクルは、平均アスペクト比が 1.1 の球状に見えます。TEM の結果は、製造元の値 (60.5 nm) よりもわずかに高い直径を示しますが、許容レベル内です。さらに、流体力学の直径の NTA の派生値と非常に良い一致があります。
補足図1:60nm金ナノ粒子のTEM像<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/61741supfig01.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>
補足ファイル 1: 測定スクリプト。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/Measurement_script.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 2: PDF 結果レポートの例。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61741/PDF_results_report.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここで説明するプロトコルは、ナノ粒子追跡解析(NTA)を用いて、水媒体中の球状ナノ粒子、より具体的には金ナノ粒子の流体力学的直径を測定することを目的とする。後者はブラウン運動による粒子の動きを追跡し、ストークス・アインシュタイン方程式を実施して流体力学的直径を得ることを含む。

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

このプロトコルでは、ナノ粒子トラッキング分析を使用して、目的のナノ材料の流体力学的直径の正確で信頼性が高く、再現性のある測定を実行します。この方法は迅速かつ簡単に実行でき、粒子ごとのリアルタイムの視覚分析と最小限のサンプル調製により、粒子の流体力学的球状等価直径の測定を容易にします。測定を行う前に、分析に使用する超純水の量を0.02ミクロンのシリンジフィルターでろ過してください。ろ過水でサンプルを適切に希釈します。この60ナノメートルの金コロイド分散サンプルでは、体積を50倍に希釈します。NTA機器、シリンジポンプ、およびコンピューターを接続し、ハードウェアとソフトウェアの電源を入れます。レーザーモジュールをシステムから取り外し、ティッシュと圧縮空気を使用して、ガラス表面とLVFC内部チャネル、チューブ、および流体ポートを完全に乾燥させます。LVFCをレーザーモジュールに置き、4本のネジで斜めに締め付けて固定します。アウトレットチューブをセルの右側にあるポートに取り付けます。インレットチューブを廃液ボトルに挿入し、背圧が許す限り迅速に900マイクロリットルの洗浄液を洗い流します。インレットチューブに取り付けられたシリンジを、1ミリリットルのろ過水が入った新しいシリンジと交換し、インレットチューブをフローセルの左ポートに接続します。その後、約500マイクロリットルの液体をサンプルチャンバーにゆっくりと導入し、ロード中に気泡が入らないように注意します。レーザーモジュールをロードするには、水で満たされたLVFCを機器に挿入し、セルを所定の位置にロックします。シリンジとシリンジポンプクレードルを固定し、ソフトウェアインターフェースの[カメラの開始]をクリックしてカメラを初期化します。ハードウェアタブで、[Scatter] をクリックして参照位置を移動し、カメラ レベルを 16 に設定します。フォーカスを手動で調整して粒子の希釈剤を確認し、メインの viewウィンドウで左クリックしてドラッグし、視野を調整します view 粒子を確認します。システムを清掃するには、シリンジを空気のみで満たされたシリンジと交換し、チャンバー内の水をゆっくりと空気と交換します。レーザーモジュールからセルを装置から取り外し、チューブの一部を外します。レーザーモジュールの光学ガラスとLVFCのガラス表面を水で洗浄し、ティッシュと圧縮空気で乾かします。LVFCとレーザーモジュールを再組み立てし、チューブをプライミングした後、60ナノメートルの金ナノ粒子懸濁液を1ミリリットル入れたシリンジを下部ポートに接続し、750マイクロリットルのサンプルをLVFCチャンバーにゆっくりと注入します。レーザーモジュールをロードしてカメラを初期化した後、[散乱]をクリックして参照フォーカスを所定の位置に移動し、フォーカスが正しく設定され、粒子の鮮明な画像が得られることを確認します。視野がレーザービームの位置に対して中央に設定されていることを確認し、自動セットアップ機能を実行してフォーカスとカメラレベルを自動的に最適化し、最適な画質が得られるようにします。サンプルを分析するには、[Standard Measurement Standard Operating Procedure]タブを開き、低速および一定流量で60秒のビデオを5本取得するように装置を設定します。次に、データのファイル名と場所を設定し、実行を開始します。データを分析するには、「検出しきい値」タブのスライドバーをドラッグして検出しきい値を設定し、できるだけ多くの可視粒子が検出され、追跡されるようにします。ノイズを示す青い十字が5つ以下観察されていることを確認してください。粒子追跡分析ビデオを自動的に処理するには、[設定]、[OK] の順にクリックし、すべての処理パラメータを自動設定のままにします。データ処理が完了したら、データをCSVフォーム結果ファイルとしてエクスポートします。ここでは、さまざまなナノ粒子追跡分析装置の構成を使用して得られたラウンド1のラボ間比較結果を示します。ラボ 6 を除き、5 回のキャプチャリピート間の再現性は良好でしたが、いくつかのラボでは予想よりも高いモードサイズが記録されました。ラウンド3からのナノ粒子追跡分析結果の精度は、すべてのラボで平均モードが62.02±1.97ナノメートルの同じ標準操作手順と機器設定を実装することにより向上しました。粒子の平均直径は、NTAの補完的な技術として透過型電子顕微鏡画像を使用して計算でき、粒子サイズ、形態、およびアスペクト比を検証できます。この解析では、粒子は平均アスペクト比が 1.1 の球形に見えます。使用前に少量フローセルが十分に洗浄されていること、サンプルが適切に希釈され、十分にロードされ、焦点が合っていること、およびSOPが守られていることを確認することが重要です。この方法は、エキソソームやウイルスなど、他のナノ粒子の特性評価に使用でき、安定性の研究や品質管理プロセスをサポートします。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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