マウス脳の水平海馬スライス

本稿は、マウスの水平海馬脳スライスを得るための体系的なプロトコルを説明することを目的としている。この方法論の目的は、穿角経路や苔むした繊維路などの海馬繊維経路の完全性を維持し、デンテート回関連の神経学的プロセスを評価することである。

このプロトコルは、さまざまな科学的アプリケーションで使用するための水平海馬脳スライスの調製を容易にします。この技術は、半球の単一のスライス内のすべての海馬線維経路の完全性を維持します。このスライスプロトコルは、歯状回で発生し現れる脳の病状で発生する神経学的変化を評価するのに理想的です。

このプロトコルの最も重要な側面は、可能な限り迅速な実行と脳組織の穏やかな取り扱いのバランスを見つけることです。ACSFの1リットルを準備するには、磁気攪拌棒で絶えず攪拌しながら800ミリリットルの水に示されているすべての固体化学物質をゆっくりと混合してから、適切な量の硫酸マグネシウムと塩化カルシウムをゆっくりと滴下します。次に、蒸気圧浸透圧計を使用して305〜315ミリオスモルの浸透圧を検証し、ACSF溶液を室温でカルボゲンで連続的に泡立てて、pHを7.3〜7.4に設定します。

250ミリリットルの高ショ糖スライス溶液を調製するには、表に示されているように25ミリリットルのスライス済み溶液に化合物を追加し、浸透圧が320〜325ミリオスモルであることを確認します。次に、高ショ糖スライス溶液をカルボゲンで10〜15分間泡立ててpHを7.3〜7.4に設定し、高ショ糖スライス溶液をマイナス80°Cで20〜30分間、部分的に凍結するまで保存します。解剖用のワークスペースを準備するには、回収チャンバーにカルボゲン化ACSF溶液を充填し、チャンバーを摂氏32度のウォーターバスに入れます。

ビブラトームを適切な切断プログラムに設定し、ホルダーに氷を入れてビブラトームに取り付け、ビブラトームアームにブレードを取り付けます。ヘラを使用して、部分的に凍結した高ショ糖スライス溶液を粉砕し、不均一なスラッシュが得られるまで混合します。次に、溶液をカルボゲンで泡立て、その溶液を使用して、冷やした90ミリメートル培養皿の上に濾紙を水和させ、35ミリメートル培養皿を氷の上に満たします。

脳を採取するには、解剖ハサミを使用して、生後2〜6週間のオスマウスの頭皮を切り開き、矢状縫合糸に沿って頭蓋を開きます。湾曲した鉗子を使用して、嗅球を含む脳全体が見えるまで頭蓋骨を切除し、へらを使用して無傷の脳組織を慎重にすくい取ります。脳を35ミリメートルの培養皿に入れ、高ショ糖スライス溶液で満たされたパスツールピペットを使用して、組織から髪の毛や血液粒子をやさしく取り除きます。

ヘラを使って、きれいにした脳を浸した濾紙に移し、ブレードを使用して脳を縦に半分に切ります。切りたての内側に両方の半球を置き、ブレードを使用して各半球の背側の上部に平行に切り込みを入れ、各脳片の背側領域を削除します。脳の腹側を上にして、切りたての背側に両方の半球を置き、標本プレートに瞬間接着剤を一滴垂らします。

ピペットチップを使用して、接着剤を大きな領域に広げて両方のティッシュを収容し、フィルターペーパーストラップを片方の半球の腹側に接触させます。別の濾紙ストラップを使用して、脳の背側を慎重に半乾かし、半球の背側を下にして標本プレートの接着剤の上に置きます。先ほど示したように、2つの追加の濾紙ストラップを使用して、2番目の半球を接着剤に配置し、試料プレートをスライスチャンバーに置きます。

次に、プレートを氷冷した高スクローススライス溶液スラッシュですばやく慎重に覆います。脳組織の一部を取得するには、ビブラトームブレードを半球の内側の前に置き、ビブラトームテーブルを持ち上げて、ブレードが上を向いている半球の腹側と同じ高さになるようにします。ビブラトームコントロールを使用して、ブレードを背側方向にさらに600ミクロン下げ、最初の2つのスライスが2つの半球から完全に分離するまで組織をスライスします。

最初の2つの組織スライスが得られたら、切断方向を逆にして、ブレードをさらに300ミクロン下げてから、再度スライスします。海馬が見えてきたら、幅を広げたプラスチック製のパスツールピペットを使用して、スライスを収集し、ウォーターバスの回収チャンバーに移します。スライスをACSF充填回収チャンバーに1時間放置し、その後、回収チャンバーを室温で30分間置いてから、組織サンプルの電気生理学的記録を行います。

ここでは、低品質スライスおよび高品質スライスからの代表的なネガティブおよびポジティブフィールド興奮性シナプス後電位記録を観察することができる。ネガティブな例のトレースは、刺激されたニューロン線維の脱分極時に、実際のfEPSP振幅よりもさらに高い大きなファイバーボレー振幅を示しますが、高品質のトレースは、小さなファイバーボレーとfEPSPの比率と高いfEPSP振幅を示しています。脳スライスの生存率は、フィールドの興奮性シナプス後電位の傾きとファイバーボレーの振幅をプロットすることによっても分析できます。

通常、スライスの品質を決定するために使用される入力/出力曲線は、脳スライスに増加する電流刺激を適用し、その後のfEPSP応答を監視することで取得できます。保存状態が不十分な脳組織の伝導特性が最適ではないため、低品質の脳スライスは入力/出力曲線が減少することを示しています。生存可能な脳スライスは安定したシナプス伝達ベースラインを持っていますが、不安定なベースラインを持つ脳スライスは、脳回路のシナプス可塑性を研究するためのさらなる条件付けプロトコルには使用できません。

fEPSPベースライン記録は、シナプス伝達自体に対する薬物の影響をモニタリングするのにも役立ちます。さらに、脳スライスをカルシウムインジケーターと組み合わせて使用 して、蛍光イメージング記録を取得し、さまざまなスライス条件または治療下でのカルシウム流入を研究することができます。脳の解剖が犠牲から1.5分以内に行われるようにし、これにより、脳組織が冷却と酸素供給なしで短時間だけであることが保証されます。

海馬の脳切片は、分子生物学的手法から電気生理学まで、さまざまな用途があります。この手順は、海馬の解剖学的構造と神経学的プロセスの集中的な調査を容易にします。