多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化

ここで説明するプロトコルは、神経変性の病因における乏突起膠欠損症に関する将来の研究を促進することが期待されます。これは、わずか3〜4週間で機能的なヒトオリゴデンドロサイト系統細胞を作製し、ニューロンオリゴデンドロサイト結合をモデル化するための共培養システムを確立するために使用できる改良された方法です。このプロトコールは、アルツハイマー病だけでなく、ニューロンオリゴデンドロサイト相互作用の他の疾患に関連するあらゆる側面を研究するために使用できます。

まず、各T75フラスコに約100万個のHEK293T細胞を播種して40%の密度を達成し、次にテトラサイクリン誘導性NGN2およびピューロマイシン耐性テトラサイクリントランスアクチベーター遺伝子を発現するプラスミドと、3つのヘルパープラスミドをトランスフェクションします。トランスフェクションにはPEIを使用してください。16時間後にメディアを交換します。

毎日培地を収集し、3日間新鮮な培地と交換することでウイルス粒子を放出しました。収集した培地を精製のためにプールし、0.22マイクロメートルのフィルターでウイルスをろ過し、Gの49,000倍で90分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを適切な量のPBSグルコースに再懸濁します。

市販のH1ヒトES細胞を使用して、ニューロン誘導を行います。細胞外マトリックス溶液でコーティングした6ウェルプレートをESL維持培地で培養し、プレートを5%二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。分化誘導の2日前に、1ミリリットルの細胞剥離液を加え、室温で10分間インキュベートしてES細胞を剥離します。

細胞をチューブに移し、次にウェルを2ミリリットルの培地で洗浄し、同じチューブに加えます。細胞をGの300倍で5分間遠心分離します。次に、ペレットを培地に再懸濁し、細胞をマトリックスコーティングされた6ウェルプレート上に、ウェルあたり10の1倍から5番目の細胞の座席密度でプレートします。

翌日、NGN2とピューロを発現するレンチウイルスを添加します。R、およびテトラサイクリントランスアクチベーターとポリブレンを新鮮なES細胞維持培地に配合。0日目に、N2を添加し、モルフォゲンを含まないDMEM/F-12培地に1ミリリットルあたり2マイクログラムのドキシサイクリンを追加します。

1日目に、新鮮なDMEM/F-12にピューロマイシンを加え、さらにN2とドキシサイクリンを最終濃度1ミリリットルあたり1マイクログラムまで加えます。ピューロマイシン中の形質導入細胞を少なくとも24時間選択します。2日目に、分化ニューロンを細胞剥離溶液で剥離し、マトリックス溶液でコーティングした24ウェルプレートに再播種します。

ドキシサイクリンを含まないMBA B27培地でそれらを維持します。細胞外マトリックスベースの溶液でコーティングされたプレート上で純粋な誘導ニューロンを培養します。神経前駆細胞の作製を行うには、本文原稿に記載されているように、H1ヒトES細胞を培養し、それらを神経前駆細胞に分化転換します。

ネガティブな1日目に、ES細胞維持培地中の0.5〜100万個の細胞を、成長因子低減マトリックス溶液でコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに播種します。0日目に、2%DMSOを添加したES細胞維持培地で細胞を24時間処理します。1日目から6日目にかけて、市販のキットからいくつかの追加阻害剤を含む温かい神経誘導培地でフルメディアを交換します。

7日目に、細胞剥離溶液を使用してNPCを継代し、24ウェルプレートのウェルあたり10〜5番目の細胞の1〜2倍の座席密度でそれらをプレートします。免疫組織化学染色により、多能性マーカーの不在およびNPCマーカーの存在について分化効率をアッセイします。オリゴデンドロサイト前駆細胞を作製するには、NPCを温かい神経誘導培地にプレートし、市販のキットからインヒビターを添加します。

8日目に、OPC分化培地に1%DMSOの溶液を調製し、めっきしたNPCを24時間処理します。9日目に、培地をDMSOを含まない新しいOPC分化培地と交換し、15日目まで隔日で細胞を給餌します。細胞が15日目より前に合流点に達した場合は、ウェルあたり5番目の細胞に10の1〜2倍の座席密度にそれらを継代します。

14日目に、OPC分化培地でOPCを1ウェルあたり10〜5番目の細胞の1〜2倍の密度で、24ウェルプレートでプレート化します。IHC染色またはqPCRによるOPC特異的マーカーの存在、およびNPCマーカーの不在について細胞を試験します。15日目に、培地をOL成熟培地と交換します。

媒体は一日おきまたは毎日交換してください。細胞が90%のコンフルエントに達したら、最大2つの継代の間、または細胞分裂が大幅に遅くなるまで、細胞を1対3の比率で分割します。OPCの分裂が速すぎて3日以内に合流点に達する場合は、2〜5マイクロモルの濃度でAra-Cを1〜3日間追加します。

14日目に、OPC分化培地中の24ウェルプレートで、1ウェルあたり10〜5番目の細胞の密度でIOPCをプレート化します。翌日、誘導されたヒトニューロンを細胞剥離液で剥離します。培養したOPCにニューロンを添加し、ウェルあたり5番目の細胞に10の2倍の座席密度でプレーティングします。

ニューロベースA培地、2%B27サプリメント、および100ナノグラム/ミリリットルのT3トリヨードチロニンを含む共培養培地を使用してください。翌日に媒体を交換し、その後は一日おきに交換します。OPCの増殖が速すぎて3日以内にコンフルエントに達する場合は、2〜5マイクロモルのAra-Cを追加します。

誘導ニューロン、すなわちOPCおよびオリゴデンドロサイトの正常な生成のためには、開始するヒト多能性幹細胞が高度な多能性を示すことが重要です。したがって、いずれかの誘導プロトコルを開始する前に、OCT-4やSOX2などの特定のマーカーについて細胞を染色する必要があります。ヒトH1細胞を用いて、誘導された興奮性前脳ニューロンを得た。

培養中の純粋なニューロンは、14日目から16日目にシナプスを1つに発現し始めました。IOPCは2週間で生成され、成熟したオリゴデンドロサイトは4〜5週間で生成されました。DMSO処理により、初期のG1期の細胞数が濃縮され、シグナル伝達の統合が改善されました。

特異的なOPCマーカーは、ES H1細胞のプレーティング後2週間という早い時期に検出されました。2週間後のIOPC集団はかなり均質で、95%以上の細胞が04染色で陽性であり、他のマーカーでは免疫反応性が高かった。オリゴデンドロサイトの成熟開始後、28日目から特異的なオリゴデンドロサイトマーカーが検出されました。

誘導されたニューロンやIOPCの理想的なプレーティング密度は、適切な分化を達成するために、一連の細胞数滴定で決定する必要があります。4週間後、共培養では、IOPCはMBPなどの特定のマーカーに陽性のオリゴデンドロサイトに適切に分化する必要があります。この共培養システムは、シナプスの数を強力に増加させることができ、IOPCが物理的接触または栄養因子の放出を通じてニューロンのサポートを提供することを示しています。

この説明された手順は、異なる脳細胞タイプを追加することにより、さらに洗練することができます。例えば、幹細胞はヒトのアストロサイトを誘導し、健康と疾患におけるニューロングリア相互作用の新たな側面をモデル化しました。