HiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング(英語)

このアプローチにより、タンパク質分解の細胞モニタリングと分解性化合物の迅速なスクリーニングが可能になります。分解のダイナミクスは、細胞内で高感度かつ定量的に監視できるため、主要な分解パラメータを正確に決定できます。これらの方法により、分解剤化合物の活性のHTSプロファイリングが可能になり、治療薬の早期発見段階でのトリアージが可能になります。

また、内因性標的レベルの調節を研究したい人には、増加しているか減少しているかにかかわらず、洞察を提供します。この手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるCelia Bisbachです。まず、哺乳類の接着細胞または懸濁細胞を調製し、プレーティングします。

細胞密度を1ミリリットルあたり5番目の細胞の10倍の2.22倍に調整し、実験および制御条件ごとに最低3ウェルのプレートに分注します。100%DMSO中に1000倍の濃度で、段階希釈したPROTACまたは分解剤テストコンパウンドプレートを調製します。次に、細胞培養培地で最終濃度の10倍に希釈します。

同量の DMSO を培地に添加して、化合物を含まない DMSO コントロールを作成します。プレート内の細胞に適切な量の10倍化合物またはコントロール溶液を加え、プレートを5%二酸化炭素中で摂氏37度でインキュベートします。エンドポイントの発光シグナルを測定するには、溶解バッファー1 mLごとに20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2倍溶解検出試薬を調製します。

すべてのウェルをアッセイするのに十分な試薬を準備します(ピペッティングエラーを考慮した追加の容量を含め)。調製した溶解性検出試薬を細胞に加え、プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで350 RPMで10〜20分間混合します。96ウェルプレートまたは384ウェルプレートを読み取ることができるルミノメーターでルミネセンスを測定します。

細胞生存率マルチプレックスを使用する場合は、溶解試薬を添加する前に行ってください。目的のエンドポイント測定の30〜40分前に、アッセイバッファーの2ミリリットルに10マイクロリットルの基質を添加して、6倍細胞生存率検出試薬溶液を調製します。調製した試薬をウェルに加え、マイクロプレートボルテックスミキサーで短時間混合します。

次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターで30分間インキュベートします。目的のエンドポイントで、96または384ウェルフォーマットの蛍光を読み取ることができる装置で蛍光を測定します。前述のように2倍溶解試薬を調製します。

次に、試薬をウェルに加え、マイクロプレートボルテックスミキサーでプレートを10〜20分間混合します。混合後、ルミノメーターを使用して発光を測定します。単一濃度エンドポイント溶解分解分析を実証するために、いくつかのCDK標的タンパク質をHiBiTで内因的にタグ付けし、パンキナーゼセレブロンベースのPROTAC TL12-186で処理しました。

CDKタンパク質レベルは異なる時点で測定され、フラクショナルRLUが決定されました。CDKタンパク質がタンパク質損失の点でどのように直接比較されるかを理解するために、フラクショナルRLUを総分解率として計算しました。BETファミリーメンバータンパク質に、LgBiTタンパク質を安定して発現するHiBiT細胞およびHEK293細胞に内因的にタグを付けることにより、速度論的分解解析を行いました。

次に、細胞を3つの異なる濃度のpan-BET PROTACで処理しました。セレブロンベースの dBET6 と VHL ベースの ARV-771 です。ここでは、4つの異なる分子接着剤化合物で処理したLgBiTタンパク質を安定して発現するIkaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat細胞の運動学的用量応答分解プロファイルを示します。

化合物間および濃度シリーズ全体での分解応答に大きな違いが観察されます。化合物の分解と順位を定量的に評価するために、用量反応プロファイルを使用して、分解率、分解最大、Dmax50値などの主要な分解パラメータを計算しました。細胞生存率マルチプレックスアッセイでは、試験した濃度で細胞生存率の低下は示されませんでした。

このプロトコルで最も重要なステップは、DMSO制御への正規化によるフラクショナルRLUまたはパーセント劣化を決定することです。このプロトコルに従って、表現型アッセイを実施して、特定のタンパク質の損失が細胞の健康または機能にどのように影響するかを理解することができます。さらに、これらのHiBiT細胞株は、NanoBRET技術を用いたタンパク質相互作用や低分子結合の研究にも使用できます。