HiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング(英語)
2020年11月9日
このプロトコルは、標的タンパク質に融合した抗体フリーの内因性タンパク質検出タグを発現させるためにCRISPR/Cas9を使用して操作された生細胞におけるタンパク質分解動態の定量的発光検出について説明しています。定量的劣化パラメータ、レート、Dmax、DC 50、およびDmax50を計算および取得するための詳細な手順が含まれています。
このアプローチにより、タンパク質分解の細胞モニタリングと分解性化合物の迅速なスクリーニングが可能になります。分解のダイナミクスは、細胞内で高感度かつ定量的に監視できるため、主要な分解パラメータを正確に決定できます。これらの方法により、分解剤化合物の活性のHTSプロファイリングが可能になり、治療薬の早期発見段階でのトリアージが可能になります。
また、内因性標的レベルの調節を研究したい人には、増加しているか減少しているかにかかわらず、洞察を提供します。この手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるCelia Bisbachです。まず、哺乳類の接着細胞または懸濁細胞を調製し、プレーティングします。
細胞密度を1ミリリットルあたり5番目の細胞の10倍の2.22倍に調整し、実験および制御条件ごとに最低3ウェルのプレートに分注します。100%DMSO中に1000倍の濃度で、段階希釈したPROTACまたは分解剤テストコンパウンドプレートを調製します。次に、細胞培養培地で最終濃度の10倍に希釈します。
同量の DMSO を培地に添加して、化合物を含まない DMSO コントロールを作成します。プレート内の細胞に適切な量の10倍化合物またはコントロール溶液を加え、プレートを5%二酸化炭素中で摂氏37度でインキュベートします。エンドポイントの発光シグナルを測定するには、溶解バッファー1 mLごとに20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2倍溶解検出試薬を調製します。
すべてのウェルをアッセイするのに十分な試薬を準備します(ピペッティングエラーを考慮した追加の容量を含め)。調製した溶解性検出試薬を細胞に加え、プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで350 RPMで10〜20分間混合します。96ウェルプレートまたは384ウェルプレートを読み取ることができるルミノメーターでルミネセンスを測定します。
細胞生存率マルチプレックスを使用する場合は、溶解試薬を添加する前に行ってください。目的のエンドポイント測定の30〜40分前に、アッセイバッファーの2ミリリットルに10マイクロリットルの基質を添加して、6倍細胞生存率検出試薬溶液を調製します。調製した試薬をウェルに加え、マイクロプレートボルテックスミキサーで短時間混合します。
次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターで30分間インキュベートします。目的のエンドポイントで、96または384ウェルフォーマットの蛍光を読み取ることができる装置で蛍光を測定します。前述のように2倍溶解試薬を調製します。
次に、試薬をウェルに加え、マイクロプレートボルテックスミキサーでプレートを10〜20分間混合します。混合後、ルミノメーターを使用して発光を測定します。単一濃度エンドポイント溶解分解分析を実証するために、いくつかのCDK標的タンパク質をHiBiTで内因的にタグ付けし、パンキナーゼセレブロンベースのPROTAC TL12-186で処理しました。
CDKタンパク質レベルは異なる時点で測定され、フラクショナルRLUが決定されました。CDKタンパク質がタンパク質損失の点でどのように直接比較されるかを理解するために、フラクショナルRLUを総分解率として計算しました。BETファミリーメンバータンパク質に、LgBiTタンパク質を安定して発現するHiBiT細胞およびHEK293細胞に内因的にタグを付けることにより、速度論的分解解析を行いました。
次に、細胞を3つの異なる濃度のpan-BET PROTACで処理しました。セレブロンベースの dBET6 と VHL ベースの ARV-771 です。ここでは、4つの異なる分子接着剤化合物で処理したLgBiTタンパク質を安定して発現するIkaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat細胞の運動学的用量応答分解プロファイルを示します。
化合物間および濃度シリーズ全体での分解応答に大きな違いが観察されます。化合物の分解と順位を定量的に評価するために、用量反応プロファイルを使用して、分解率、分解最大、Dmax50値などの主要な分解パラメータを計算しました。細胞生存率マルチプレックスアッセイでは、試験した濃度で細胞生存率の低下は示されませんでした。
このプロトコルで最も重要なステップは、DMSO制御への正規化によるフラクショナルRLUまたはパーセント劣化を決定することです。このプロトコルに従って、表現型アッセイを実施して、特定のタンパク質の損失が細胞の健康または機能にどのように影響するかを理解することができます。さらに、これらのHiBiT細胞株は、NanoBRET技術を用いたタンパク質相互作用や低分子結合の研究にも使用できます。
概要
このプロトコルは、CRISPR/Cas9技術を用いて生細胞内でタンパク質分解動力学を定量的に検出する方法を概説しています。分解速度やDmaxなどの分解パラメータを計算するための詳細な指示を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- タンパク質分解
- CRISPR/Cas9技術
背景
- タンパク質分解の理解は細胞の健康にとって重要です。
- CRISPR/Cas9により、精密な遺伝子改変が可能になります。
- 分解のモニタリングは治療法の発見に役立ちます。
- 定量的手法は分解研究の精度を高めます。
研究目的
- 生細胞内でのタンパク質分解をモニタリングするプロトコルを開発すること。
- 分解化合物の高スループットスクリーニングを可能にすること。
- 内在性タンパク質レベルの調節に関する洞察を提供すること。
使用された方法
- 特定の密度での哺乳類細胞の準備と培養。
- テスト用PROTAC化合物の連続希釈。
- 分解測定のための発光検出試薬の使用。
- 発光データから分解パラメータの計算。
主要な結果
- 生細胞内でのタンパク質分解動力学の成功的なモニタリング。
- 化合物間での分解反応の有意な違いの特定。
- 分解速度と最大分解値の定量的評価。
- 実験中に細胞生存率の損失は観察されませんでした。
結論
- このプロトコルはタンパク質分解ダイナミクスの研究を容易にします。
- タンパク質損失が細胞機能に与える影響を評価するために適用できます。
- HiBiTタグ付き細胞株はタンパク質相互作用の研究に有用です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative, high-throughput assessment of targeted protein degradation in physiologically relevant cellular contexts, supporting early triage of degrader compounds. By maintaining endogenous expression and regulation of target proteins, it provides predictive confidence in lead optimization and reduces mechanistic ambiguity in discovery pipelines. The approach directly informs go/no-go decisions by linking compound-induced target degradation to measurable phenotypic outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of target protein loss in native cellular environments.
- Operational Value: Supports functional target validation by quantifying degradation kinetics and potency under physiological regulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating degradation rate, Dmax, and DC50 parameters for lead prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: CRISPR-engineered HiBiT cell lines provide standardized, reproducible systems for luminescent readout of target degradation.
- Multiplexing Capability: Compatible with cell viability assays to distinguish specific target effects from cytotoxicity during screening.
- Scalability: Luminescent signal detection in 96- or 384-well formats enables high-throughput profiling of degrader compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains endogenous protein expression and regulation, improving relevance to in vivo disease models.
- Mechanistic De-risking: Allows correlation of target degradation with functional cellular phenotypes, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Predictive Confidence: Quantitative degradation profiling reduces late-stage failure risk by confirming target engagement in relevant cellular backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification and preceding lead optimization, providing degradation-competent cellular systems for compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time or endpoint measurement of target protein degradation in live cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (rate, Dmax, DC50) for high-throughput evaluation of degrader compound libraries.
- Analytics: Generates normalized degradation metrics that allow cross-compound comparison and rank-ordering based on target engagement.
- Translational Research: Connects target degradation to functional outcomes via multiplexed viability assays, informing risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: HiBiT-tagged cell lines serve as reusable assets across multiple projects targeting different proteins or degradation mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target modulation, reduces mechanistic ambiguity, and enables functional target validation.
- Operational Value: Ensures assay standardization, reproducibility, and scalability across screening campaigns.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, enhances capital efficiency, and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of degrader leads based on quantitative degradation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 genome editing and clonal cell line development.
- Dependent on luminescent plate readers capable of 96- or 384-well format detection.
- Necessitates standardization of cell plating density and reagent preparation across wells.
- Adaptation considerations include varying endogenous expression levels and subcellular localization of target proteins.
- Practical limitations include signal dynamic range constraints in highly abundant or rapidly turning over target proteins.
