Name: 次世代シーケンシングを用いたT細胞受容体免疫レパートリー解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学ぶ T細胞受容体免疫レパートリー解析の方法。血液と腸生検からDNAを抽出し、TCRβとIGHのPCRライブラリーを作成して次世代シーケンスを実行します。リンパ球集団の動的変化を特定し、疾患における新規バイオマーカー発見に応用できます。

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この研究は、シェバ医療センターの機関審査委員会によって承認され、すべての参加対象からインフォームド・コンセントが得られました。
1. DNAの分離と定量
<ol><li>腸内生検の消化と細胞のリシス<ol>
<li>腸内生検を取り出し、採取したばかりか、-20°Cまたは-80°Cで保存したものを回収する。 凍結生検を使用する場合は、氷の上で解凍します。</li>
		<li>氷の上で冷やされた無菌1.7 mLマイクロ遠心分離チューブに600 μLの核溶解溶液を加えます。</li>
		<li>リシス溶液を用いたマイクロ遠心チューブに生検を入れ、65°Cで15〜30分間インキュベートします。</li>
		<li>17.5 μLの20 mg/mLプロテイナーゼKを加え、穏やかな揺れで55°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>サンプルを室温まで5分間冷却してから、ステップ1.3に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>全血の細胞リシス<ol>
<li>EDTA-、ヘパリン、またはクエン酸含有チューブで全血の3 mLを得る。</li>
		<li>チューブを十分に混合するまで軽く揺れ、9 mLの細胞溶解液を含む無菌15 mL遠心分離管に血液を移す。室温で10分のインキュベーション期間中に数回反転します。</li>
		<li>室温で10分間2,000 x gで遠心分離機を使用し、可視の白いペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を捨てます。残りの液体の約50〜100 μLが残ります。</li>
		<li>渦管は完全に再懸濁されるまで15 sのために精力的に。3 mLの核溶解溶液とピペットを数回加えます。解決策は粘性になるはずです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タンパク質沈殿<ol>
<li>組織に200μLのタンパク質沈殿バッファーを加えるか、血液に1 mLを加えます。20sのために激しく渦を、5分間氷の上でインキュベート。小さなタンパク質塊は、渦の後に見ることができる。</li>
		<li>遠心分離機 16,000 x g で 4 分間沈殿タンパク質を含むタイトなペレットが形成されるはずです。</li>
		<li>慎重にペレットを乱すことなく、上清を新しい1.7 mLチューブに移します。 注:ペレットがタイトでない場合は、4分間16,000 x g で別の遠心分離機を検討してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA沈殿と水分補給<ol>
<li>上清を含むチューブに2-プロパノール1mLを加え、反転させて軽く混ぜます。DNAは白い浮遊物質として見えるようになるはずです。</li>
		<li>16,000 x g で遠心分離機 1分間ピペットを使用して上清を完全に取り除く。</li>
		<li>1 mLの新しく調製した70%エタノールを加え、チューブを数回反転させます。室温で1分1分の16,000 x g で遠心分離機。上清を慎重に捨てなさい。</li>
		<li>ステップ 1.4.3 を繰り返します。</li>
		<li>開いたチューブをクリーンな吸収性紙に10〜15分間反転します。チューブを再反転し、完全な水分補給を確認します。必要に応じて、さらに10〜15分間空気乾燥してください。 注:ペレットを完全に乾燥させることは非常に重要です。</li>
		<li>50 μLの超純水(UPW)を加えます。必要に応じて、DNAは定量後により希釈することができる。</li>
		<li>65°Cのヒートブロックで1時間インキュベートし、DNAリハイドレーションを行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA定量 注:DNAは、材料表に指定されたフルオロメーターと指定試薬を使用して定量化しました。<ol>
<li>標準を室温に持ち込み、0.5 mL指定チューブを含むキットを準備します。</li>
		<li>サンプル数に応じて、バッファーと色分けを15 mLチューブで調製します。サンプルあたり200μLのバッファーと1μLの染料を加えます。標準用のサンプルを2つ含めます。バッファーが十分でないことを避けるために、追加サンプルを計算することをお勧めします。<ol>
<li>2つの標準では、上記の調製済みミックスの190 μLを0.5 mLチューブに入れてください。標準の10 μLを追加します。</li>
			<li>各サンプルに対して、上記の調製済みミックスの199 μLを0.5 mLチューブに入れてください。DNAを1μL加えます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>サンプルを読んでください。結果は、サンプルのDNA濃度を示す。</li>
		<li>サンプルが限界を超えている場合は、DNA 1:10をUPWで希釈し、読み取りを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 図書館の準備
注:現在のプロトコルは、NGSシーケンサーと互換性のあるマルチプレックスPCRベースのアッセイキットを使用しています。このキットには、V βおよびJ β領域内の各ターゲットの保存領域に24の異なるインデックスが含まれています。これにより、異なるサンプルのワンステップPCR反応とプールが可能になります。詳細については、資料一覧を参照してください。
<ol><li>DNAサンプルを準備します。150 ngのDNAを得て、合計5 μLのUPWを加えます。 注:最低濃度10 ng/μLで、ライブラリー調製には150ng未満のDNAを使用することが可能です。</li>
	<li>残留DNAを分解するために15分間UVライトでフードにピペットとチップを入れます。一方、異なるインデックスチューブ(ライブラリ調製用)とDNAポリメラーゼが氷の上で解凍することを可能にする。</li>
	<li>生物学的フードでは、異なるインデックスチューブから45 μLをPCRチューブに追加します。その後、ステップ2.1で作製したDNAポリメラーゼを0.2μL、5μLのDNAをPCRチューブに加えます。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、事前設定プログラムを使用してPCR反応を実行します。</li>
</ol>3. アンプリコンの精製と定量
<ol><li>過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素の除去には、磁気ビーズを使用してください。<ol>
<li>ビーズを室温まで30分以上温めます。サンプルあたり400 μLに対して、80%のエタノールを十分に準備します。</li>
		<li>各PCRチューブに50μL(IGH)または35μL(TCRβ)を加え、10回ピペットで混合します。室温で10分インキュベートします。</li>
		<li>混合サンプルを磁気スタンドに5分間置きます。</li>
		<li>透明液の95μL(IGH)または80μL(TCRβ)を吸引し、廃棄する。10 μL の先端を使用して残りの液体を吸引します。</li>
		<li>各サンプルに200μLの80%エタノールを加えます。インキュベート 30 s.195 μLのエタノールを吸引し廃棄する。10 μL の先端を使用して残りの液体を吸引します。</li>
		<li>ステップ 3.1.5 を繰り返します。チューブのキャップを開け、空気を5分間乾燥させます。</li>
		<li>5分後、磁気スタンドから取り出し、溶出バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0)を25 μL加えます。均質になるまでピペットで混ぜます。室温で2分間インキュベートします。</li>
		<li>チューブを磁気スタンドに5分間置きます。22 μL を新しい PCR チューブに移します。DNA濃度を測定する(ステップ1.5)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アンプリコン定量 注: 現在のプロトコルでは、DNAの濃度、サイズ、および完全性の品質管理に自動化された電気泳動機を使用しています。詳細については、資料一覧を参照してください。<ol>
<li>試薬とスクリーンテープを室温で30分以上置きます。</li>
		<li>新しい1.7 mLマイクロ遠心分離チューブで、ステップ3.1.8で定量したDNAサンプルを、少なくとも3μLの総体積でUPWで定量化します。</li>
		<li>使用前に渦を希釈したDNA。2 μL のバッファーを、事前にラベル付けされた特殊 PCR ストリップ (キットに用意) に希釈した DNA の 2 μL と共に置き、キャップを置きます。シェーカーに1分間置き、続いてPCRストリップのスピンダウンを行います。 メモ:バッファーの粘性のため、サンプルチューブに移る前に余分なバッファをチップから取り除くことを確認してください。</li>
		<li>キャップなしで機械、スクリーンテープ、PCRストリップに置きます。機械の中の先端箱のふたを開けろ。適切なラベルを使用して位置を割り当てます。マシンを起動します。 注: 出力ヒストグラムは、アンプリコンの目的のサイズで単一のピークにする必要があります(図1A)。品質の悪いサンプルでは、追加のピークが観察されます (図 1B),悪いビーズのクリーンアップまたはプライマーダイマーの形成を示します.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 次世代シーケンシング
<ol><li>ライブラリの定量化とプール<ol>
<li>nMの最終DNA濃度を算出し、ステップ3.1.8からのDNA値を用いて、製品のピークの塩基対(bp)のサイズと、電気泳動機の結果から得た( 図1参照)。</li>
		<li>各サンプルについて、最終濃度4 nMの最終濃度を10~20 μLの溶出バッファーで測定するDNA容積を計算します。</li>
		<li>各サンプルに新しい希釈ミックスを準備し、それから2μLを新しいプールミックスに取り込みます。 注: 4 nM 未満のサンプルの場合は、可能な限りサンプルの量を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>図書館のNGSラン 注: 現在のプロトコルでは、ベンチトップ シーケンサー プラットフォームを使用します。詳細については、資料一覧を参照してください。<ol>
<li>0.2 N NaOHの新鮮な溶液を準備します。ステップ 4.1.3 で作成した希釈ライブラリに 0.2 N NaOH の 10 μL を追加します。チューブと渦に5%のPhiXを短時間追加します。チューブをスピンダウンして、すべての溶液がチューブの底に落ち着くようにします。</li>
		<li>二重鎖DNAを変性させるために室温で5分間インキュベートする。キットから980 μLのプレチルドバッファーを、DNAと渦を含むチューブに短時間追加します。</li>
		<li>希釈したライブラリーを氷の上に置き、次のようにライブラリを準備します。17 pMの混合の場合、ステップ 4.2.2 および 575 μL のバッファーから 425 μL の DNA を追加します。ライブラリを数回反転し、スピンダウンします。最終ライブラリの600μLを指定カートリッジに積み込み、サンプルを機械に入れます。</li>
		<li>ソフトウェアの指示に従って実行を開始します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. シーケンシング解析
<ol><li>シーケンシング・メトリックをシーケンサーからダウンロードし、シーケンシング・データが次の範囲 (現行プロトコルで使用されているキットに固有) 内であることを確認します。これらの条件を満たさないサンプルは、繰り返し実行される可能性があります。 クラスター密度(密度(K/mm2)):945K - 1800K フィルターを通過する読み取りの割合 (クラスター PF (%)): >90% 品質スコア(%>=Q30):>85% PhiXアライメント(アラインメント%):1.5%-10% PhiXエラー率(%):<1.0%</li>
</ol>

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</ol>

すべての著者は開示するものは何もありません。

Bリンパ球およびTリンパ球の存在量および機能の変化は、しばしば異なる悪性腫瘍18において遭遇するが、慢性炎症性疾患(例えば、潰瘍性大腸炎および関節リウマチ)10、19、および種々の免疫不全17、20において。現在の方法では、NGSを利用してTCRおよびBCRレパートリーの詳細なビューを容易にし、TおよびB細胞のクローンの微妙な変化、クローンの共有、V(D)J遺伝子の使用、およびB細胞の場合の体細胞ハイパー突然変異の程度に関する情報を検出することができます。
腸内生検及び血液試料に対するDNA分離の方法について説明した。しかし、リシスやDNA抽出の改変により、この方法は腫瘍、リンパ節、滑液などの他の組織に適用することができる。図書館の準備中に異なるプライマーセットを交差汚染しないことが重要です。ビーズのク...

Tリンパ球とBリンパ球で構成される適応免疫系は、免疫学的記憶を利用して、以前に遭遇した抗原を認識し、迅速な応答を開始する。リンパ球は骨髄で発生し、胸腺(T細胞)または骨髄(B細胞)で成熟する。T細胞受容体(TCR)とB細胞受容体(BCR)の両方が、特異的抗原の認識を可能にする独自の構成を示す。ホメオスタシスでは、T細胞とB細胞は常に循環し、抗原提示細胞に提示される異なるペプチドの兆を調査する。高い親和性を有する特定の抗原のTCRまたはBCRライゲーションは、適切な共刺激と共に、細胞活性化をもたらし、サイトカイン分泌、クローン拡張および抗体の生成をもたらし、B細胞の場合に。
異なるTまたはB細胞の巨大な配列は、総称して免疫レパートリーと呼ばれます, 異なるエピトープの無数の認識を可能にします.このような広大なレパートリーを生成するために、異なる遺伝子セグメントのランダム集合の複雑なプロセスが起こり、ユニークな抗原1に結合することができる受容体のほぼ無限の組み合わせを作成する。このプロセスは、V(D)Jの組み換えと呼ばれ、異なる変数(V)、多様性(D)および結合(J)遺伝子の再配列を含み、結合部2におけるヌクレオチドのランダムな欠失および挿入を伴う。
適応免疫システムのアーキテクチャは、何十年もの間、異なる分野の科学者に興味を持っています。以前は、サンガーシーケンシング、相補決定領域3(CDR3)スペクトルタイピング、およびフローサイトメトリーを使用して免疫レパートリーを特徴付け、低分解能を提供した。過去10年間で、次世代シーケンシング(NGS)法の進歩により、個人のTCRおよびBCRレパートリー3,4の特性と組成に関する詳細な洞察が可能になった。これらのハイスループットシステム(HTS)配列と処理は、同時に並べ替えられたTCRまたはBCR製品の数百万を、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで特定のTおよびB細胞の高解像度分析を可能にします。NGSは、健康と病気の両方の免疫レパートリーを研究するための新しい戦略を提供します。HTSを利用した研究は、自己免疫疾患におけるTCRおよびBCRレパートリーの改変を実証した5、原発性免疫不全6、7、および急性骨髄性白血病における悪性腫瘍8などである。NGSを用いて、我々および他の人々は、炎症性腸疾患(IBD)を有する患者において、潰瘍性大腸炎およびクローン病9、10、11、12、13、14のオリゴクローナル拡張を示している。全体として、異なる分野からの研究は、レパートリーの変化が免疫媒介性疾患の病因において重要な役割を果たしていることを示唆している。
現在のプロトコルは、腸内生検および血液からのDNAの分離、NGS用のTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、およびシーケンシング実行の性能を記述する。免疫レパートリーデータ解析の基本ステップも提供しています。このプロトコルは、TCRα、TCRγ、およびIGLライブラリの生成にも適用できます。この方法は、組織特異的な消化プロトコルが使用されている限り、他の器官(例えば、リンパ節、腫瘍、滑液、脂肪組織など)と互換性がある。

<table><tbody><tr><td>2-プロパノール</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>8187631104051</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>グライナー</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>メルク</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Amplitaq Gold</td><td>サーモフィッシャー</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>Bioer</td><td>は、</td><td></td></tr><tr>高<td>感度D1000サンプルバッファ</td><td>Agilent</td><td>5067-5603</td><td>Tapestation用</td></tr>高<tr><td>感度D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>用適用できません。チューブは別々に販売</td></tr><tr><td>Lymphotrack アッセイキット</td><td>Invivoscribe</td><td>TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019</td><td>それぞれに24のインデックスが含まれています</td></tr><tr><td>MiSeq 試薬キット v2 (500 cycle)</td> <td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td>標準フローセルタイプと必要なすべての試薬が含まれています</td></tr><tr><td>MiSeq シーケンサー</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>PCR strips</td><td>4titude</td><td>4ti-0792</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Invitrogen</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 4 蛍光光度計</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td><td>バッファー、色素、標準、専用チューブを含む</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Biosan</td><td>該当</td><td></td>なし</tr><tr><td>Tapestation 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>ultra純水</td><td>Bio-lab</td><td>7501</td><td></td></tr><tr><td>Wizard DNA単離キット</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>細胞溶解液、核溶解液、タンパク質沈殿バッファーが含まれています</td></tr></tbody></table>

次世代シーケンシングを用いたt細胞受容体免疫レパートリー解析

T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing

免疫学的記憶は、適応免疫の特徴であり、Tリンパ球およびBリンパ球によって調整される。循環や異なる器官では、何十億ものユニークなT細胞クローンとB細胞クローンがあり、それぞれが特定の抗原に結合し、増殖、分化および/またはサイトカイン分泌につながる。T細胞とB細胞の広大な異種性は、異なる遺伝的セグメントのランダムな組み換えによって生成される。過去10年間に開発された次世代シーケンシング(NGS)技術は、TおよびB細胞受容体免疫レパートリーの前例のない詳細なビューを可能にします。様々な炎症性疾患、免疫不全、感染症および悪性腫瘍の研究は、クローン性、遺伝子使用法、および免疫レパートリーの生物物理学的特性の顕著な変化を示し、異なる疾患における適応免疫応答の役割に関する重要な洞察を提供した。
ここでは、血液および組織からのTおよびB細胞の免疫レパートリーのNGSに対する詳細なプロトコルを提供する。DNAの単離から図書館の準備、NGSシーケンサーのシーケンシング、基本的な分析で終わるパイプラインを提示します。この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでの特定のTおよびB細胞の探索を可能にし、したがって、異なる疾患におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。この技術はゆっくりと臨床現場に入っており、新しいバイオマーカー、リスク階層化、精密医療の同定の可能性を秘めています。

ここでは、腸組織および血液からのDNA分離方法、NGS用ライブラリの調製、免疫レパートリーシーケンシングのためのシーケンシングランの基本的なステップについて述べうる。実行は、国際ImMunoGenetics(IMGT)/HighV-QUESTプラットフォームで使用するために、さらにfastaファイルに変換することができ、fastqファイルを生成します。このHTSは、ヌクレオチドレベル15で、何万もの再構成されたTCRβおよびIGH配列の多くの分析を行い、管理する。IMGT/高V-QUESTは健康と病気の両方で異なるTDRおよびIGHレパートリーの分析を可能にする。これは、新しい「疾患特異的な」クローンの同定、クローン拡張および多様性パラメータの分析、微分V(D)Jの使用法の線引き、体細胞性ハイパー突然変異の分析、および多くのにつながる可能性があります。IMGT/HighV-QUESTは、特定のシーケンスとその豊富さを含むCSVファイルを提供します。ゲノムDNAを出発物質として使用すると、細胞番号を代表する配列番号が得られます。したがって、元のDNA量が等しい場合、所定のサンプル中のT細胞の...

現在のプロトコルは、血液サンプルおよび腸内生検からのDNA分離、次世代シーケンシングのためのTCRβおよびIGH PCRライブラリの生成、NGSランの性能および基本的なデータ分析のための方法を記述する。

次世代シーケンシングを用いたT細胞受容体免疫レパートリー解析

Immunological memory, the hallmark of adaptive immunity, is orchestrated by T and B lymphocytes. In circulation and different organs, there are billions ...

この方法は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで特定のTおよびB細胞を探索し、したがって、異なる障害におけるリンパ球集団および多様性パラメータの動的変化を同定することができる。次世代シーケンシングの利点は、ユニークなTまたはB細胞クローンを同定し、異なる解剖学的部位または異なる個体でそれらを追跡する能力です。これは、多様な疾患における新しいバイオマーカーの同定の可能性を秘めています。その手順を実証するのは、私の研究室の研究助手であるナオミ・サラモンです。まず、腸内生検の消化と細胞のリシスを行う。腸内生検を取り出す、新鮮な収集または負の20または負の80°Cで保存します。凍結生検を使用する場合は、氷の上でそれらを解凍します。氷の上で冷やした無菌1.7ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに600マイクロリットルの核溶解溶液を加えます。その後、生検をチューブに入れ、摂氏65度で15〜30分間インキュベートします。10ミリグラム/ミリリットルプロテイナーゼKの17.5マイクロリットルを加え、穏やかな揺れで摂氏55度で一晩チューブをインキュベートします。インキュベーション後、試料を室温まで5分間冷却します。血液からのDNA分離のために、チューブが完全に混合されるまでチューブを穏やかに揺らす。その後、9ミリリットルの細胞溶解溶液を含む無菌15ミリリットル遠心分離管に血液を移す。室温で10分間のインキュベーション期間中にチューブを数回反転させます。室温で10分間600gで遠心分離機。その後、可視の白いペレットを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を捨てます。完全に再懸濁されるまで15秒間チューブを激しく渦盛り。3ミリリットルの核溶解溶液を加え、ピペットを数回加え、粘性になる。サンプルにタンパク質沈殿バッファーを加えます。その後、20秒間激しく渦を流し、氷の上で5分間インキュベートします。遠心分離機を16,000gで4分間、沈殿したタンパク質を含むタイトペレットを形成した。慎重に新しい1.7ミリリットルのチューブにペレットを邪魔することなく上清を移動します。上清を含むチューブに2-プロパノールの1ミリリットルを加え、反転させて軽く混ぜます。DNAは白い浮遊物質として見えるようになるはずです。16,000回gで遠心分離機を1分間、上清を完全に取り除いた。作りたての70%エタノールを1ミリリットル加え、チューブを数回反転させます。室温で1分16,000gで遠心分離します。その後、上清を慎重に捨てます。エタノール洗浄を繰り返します。その後、DNAペレットを10〜15分間空気乾燥させます。DNAに50マイクロリットルの超純水を加え、テキスト原稿に記載されているようにDNA定量を行う。150ナノグラムのDNAを使用して、シーケンシング用のライブラリを準備します。残存DNAを分解するために15分間UVライトでフードにピペットとチップを入れます。一方、異なるインデックスチューブとDNAポリメラーゼが氷の上で解凍することを可能にする。生物学的フードでは、異なるインデックスチューブから45マイクロリットルをPCRチューブに加えて、クロスコンタミネーションを避けるように注意してください。その後、0.2マイクロリットルのDNAポリメラーゼと調製したDNAの5マイクロリットルをPCRチューブに加えます。メーカーの指示に従って、プリセットプログラムを使用してPCRを実行します。過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素の除去には、磁気ビーズを使用してください。ビーズを室温まで少なくとも30分間温め、サンプルあたり400マイクロリットルに対して80%エタノールを十分に新鮮に調製します。各PCRチューブにビーズを加え、10回ピペットで混ぜます。室温で10分間チューブをインキュベートします。混合サンプルを磁気スタンドに5分間置きます。その後、透明な液体を吸引し、廃棄する。残りの液体を10マイクロリットルの先端を使用して吸引する。各サンプルに200マイクロリットルの80%エタノールを加え、30秒間インキュベートします。195マイクロリットルのエタノールを吸引し、廃棄する。その後、残りの液体を10マイクロリットルの先端を使用して吸引する。エタノール洗浄を繰り返します。その後、チューブのキャップを開け、5分間空気乾燥させます。5分後、磁気スタンドからサンプルを取り出し、溶出バッファーを25マイクロリットル加えます。均質になるまでピペットで混ぜ、室温で2分間インキュベートする。チューブを磁気スタンドに5分間置きます。次いで、22マイクロリットルを新しいPCRチューブに移し、DNA濃度を測定します。テキスト原稿に記載されているアンプリコンを定量化します。製品のピークの塩基対の最終的なDNA濃度とサイズを計算した後、各サンプルに新しい希釈ミックスを準備し、その2マイクロリットルを新しいプールミックスに移します。0.2通常の水酸化ナトリウムの新鮮な溶液を調製し、希釈されたライブラリに10マイクロリットルを加えます。二本鎖DNAを変性させるために室温で5分間インキュベートする。次に、キットから980マイクロリットルのプレチルドバッファーをDNAを含むチューブに加え、渦を短時間加えます。最終ライブラリの600マイクロリットルを指定されたカートリッジに積み込み、サンプルを機械に入れます。シーケンス分析を実行するには、シーケンシング・メトリックをシーケンサーからダウンロードし、データが適切な範囲内にあるかどうかを確認します。基準を満たしていないサンプルに対して実行を繰り返します。このプロトコルは、IL10受容体欠損症の患者の代表的な自家血および直腸サンプルの基礎分析および重度の乳児発症IBDの歴史を実行するために使用された。TCR-βおよびIGHレパートリーの両方についてサンプルをアッセイした。すべてのクローンは、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルでのそれらのユニークな配列によって同定することができる。これらの配列は、共有クローンを探索する場合、または異なる解剖学的部位間の同じ患者で異なる患者間で比較することができる。各サンプルの最も頻繁な 5 つのクローンを次に示します。レパートリーの概要を示すツリーマップ画像が生成されました。色付きの正方形はそれぞれ異なるクローンを表し、サイズはその頻度と相関します。これらのTreeMap画像は、腸管IGHレパートリーのクローン拡張を示す。これに対し、TCR-βレパートリーでは、自家の腸に比べて血中に顕著なクローン拡張が認められる。遺伝子レベルでは、NGSは、遺伝子、家族、または対立遺伝子のレベルでV、D、およびJの使用に関する情報を提供します。さらに、TCR-βとIGHレパートリーのデータから特定のVDJの組み合わせを推測することができ、様々な条件での遺伝子の差動パターンを明らかにする。このプロトコルは、DNAとRNAの両方に適用することができ、TCR-α、TCR-γ、およびIGLレパートリーを生成するために使用することができます。また、わずかな消化修飾後に他の臓器と互換性があります。

t-b-cell-receptor-immune-repertoire-analysis-using-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このプロトコルは、リンパ腫の組み換え免疫グロブリン重鎖VDJ領域をディープシーケンシングによって調査し、VDJの再配列と体細胞の超突然変異の状態を取得して、個々の腫瘍のクローン構造を描写するアプローチを説明しています。ペアの診断サンプルと再発サンプル間でクローン構造を比較すると、リンパ腫の再発クローン進化モードが明らかになります。...

VDJ-のSeq：B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析

私たちは、単一のT細胞受容体(TCR)レトロウイルスベースのin vivo発現システムのための迅速で柔軟なプロトコールを提示します。 レトロウイルスベクターは、骨髄前駆細胞を形質導入するために使用され、TCRトランスジェニックマウスの代替として、in...

骨髄前駆細胞のレトロウイルス形質導入は、T細胞受容体Retrogenicマウスを生成するために、

ここでは、古典的なホジキンリンパ腫（HL）細胞から高品質、全exomeデータを生成するように設計された、フローサイトメトリーによる細胞ソーティングと低入力、次世代ライブラリー構築プロトコルを説明します。...

古典的なホジキンリンパ腫のリードステルベルグ細胞のフローソーティングとExome配列決定

本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。...

生成<em&gt;デ・ノボ</em&gt;センHemichainのレトロウイルス形質導入によって抗原特異的ヒトT細胞受容体

後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna...

マイクロ Rna と受ける DNA の組換えをクラス スイッチしてプラズマ細胞の分化誘導された B 細胞における Mrna のゲノム解析の HDAC 阻害剤を介した変調

単一のセル対人間 TCR アルファとベータ鎖シーケンスで現在のプロトコル結合合理化レトロウイルスベクターの in vitroとin vivoの TCR...

合理化単細胞 TCR 分離し体外の Retroviral ベクトルの生成、人間 Tcr の生体内で発現

ここでは、分析と構造の可視化と全体抗体レパートリーの憲法のためのプロトコルについて述べる。次世代シーケンシングによる抗体 RNA...

マウスと次世代シーケンサーによるひと抗体のレパートリーの同定

ヒト末梢血単核細胞から個々の抗原特異的抗体を同定し、回収するBSelex法は、フローサイトメトリーと単一細胞PCRおよびクローニングを組み合わせたものです。...

濃縮ヒト記憶B細胞集団からの所望特異性を持つ抗体の選択と回収のための単細胞スクリーニング法

RNAベースのアプローチを使用して、固形腫瘍組織の定量的免疫プロファイルを決定し、免疫腫瘍学バイオマーカー探索のための臨床コホートを活用することは、分子および情報学的プロトコルを介して記述されています。...

固形腫瘍の予知免疫モデリング

本論文では、大動脈の免疫成分を調査するために、フローサイトメトリーベースの方法を提示。本稿では、また別々に周囲の外膜と血管壁を調べることができる追加のテクニックを示しています。このメソッドは、大動脈白血球の表現型解析を実行し、アテローム性動脈硬化症の研究のためにいくつかの免疫学的アッセイを適用する可能性を開きます。...

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

学ぶ T細胞受容体免疫レパートリー解析の方法。血液と腸生検からDNAを抽出し、TCRβとIGHのPCRライブラリーを作成して次世代シーケンスを実行します。リンパ球集団の動的変化を特定し、疾患における新規バイオマーカー発見に応用できます。

次世代シーケンシングを用いたT細胞受容体免疫レパートリー解析

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