Name: 3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぼう、3次元再構築ヒト表皮の大規模培養法。正常ヒト表皮角化細胞を用いて、15日間で完全層状組織を形成するプロトコルを解説。動物実験代替法として化粧品安全性評価に応用可能です。

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マリー・スクウォトフスカ・キュリー・グラントの下での欧州連合(EU)のホライゾン2020研究・イノベーションプログラムは、765602がこの仕事に資金を提供しました。すべての著者は、アドルフ・メルクル財団とフェラーラ大学の支援を認め、ダウ・シリコーンズ・ベルギーを感謝しています。ミゲル・スプチ=カルバー博士は、RhE栽培プロセスのグラフィック画像を作成したことで認められています。著者らは、バーバラ・ドラスラー博士、フランコ・セルヴェラティ博士、アニエス・テシエ博士の技術支援と議論に感謝している。

マーク・イーマンとベネデッタ・ペトラッカはダウ・シリコーンズ・ベルギーの従業員です。他のすべての著者は開示するものは何もありません。

RhEsは医薬品および皮膚化粧品分野36、75、76、77、78のスクリーニングツールとして広く使用されています。いくつかの企業は、このようなRhEsを市販していますが、コストが残っており、新しい研究の質問に対処するために必要に応じて栽培パラメータを変更する可能性を制限しています。本論文では、堅牢で信頼性の高い方法で社内RhEの製造手順を説明し、動物実験の代替アプローチとしてモデルの関連性を確認するために得られた組織の詳細な特徴付けを提供する。
プロトコルの一部のステップは、適切なケラチノサイト分化およびRhE再現性を保証するために重要です。最適な細胞、培地タイプ、栽培条件を利用して行うことができます。提案されたRhEモデルでは、新生児のNHEKsは、成人のNHEKと比較して、抗原暴露の欠如のために選択された。さらに、ケラチノサイトは、種間変動を避けるために白人民族に限定された。一次角化細胞は、通常、差別化と階層化の能力のために使用される79.それらは商業的にまたは大人の皮からの社内の隔離によって得ることができる80.ポリカーボネート膜上の細胞株(すなわち、HaCaT)の培養は、分化を失敗させ、バリア形成に必要な脂質を合成する能力の低下を示した。81.しかし、ヒドロゲル、コラーゲン、フィブリン、スフェロイドなどの異なる培養マトリックスを含めることで、3Dスキンモデルの開発に成功しました。78,82,83,84,85,86.不死化細胞株N/TERTは、RhEの開発に適することが示されている35.原発性角化細胞は4番目または5番目の通路で増殖し続ける61したがって、現在のプロトコルは、第3の通路におけるケラチノサイトの使用を含む。De Vuystら. 細胞の播種密度が重要であり、十分である必要があることを実証しました(すなわち、≥2.5x105 セル/cm2)を使用して、バソラテラコンパートメントからの媒体が、補助コンパートメントに拡散しないようにする。不十分なシード密度(すなわち、 < 2.5x105 セル/cm2) は、適切なバリアを形成できなくなる可能性があり、これは、バソラテラからアピカルコンパートメントへの培地の拡散によって示され、ALI培養条件の代わりに水没する結果となる62.無血清ケラチノサイト増殖培地(参照) 資料表)は、化学的に定義された媒体を使用して作業する利点を提供し、汚染のリスクを低減するので、再現性の目的のために好ましい。この培地はカルシウム濃度が低く(すなわち、60μM)、したがってケラチノサイトの増殖を刺激する87.RhE栽培の第1段階からカルシウム濃度(すなわち1.5mM)を増加させ、ケラチノサイト分化および皮膚バリア形成および恒常性を好む49.さらに、アリ培地は、SC脂質の形成および分化を促進するために重要であることが示されているアスコルビン酸を添加する52,53,54.ALI培地にはKGFも含まれており、角化膜貫通受容体に結合し、活性化時に分化および創傷修復に二重の役割を果たす線維芽細胞によって分泌される成長因子である55,88.RHEに新鮮な栄養素を一定に供給するために、特定の時間間隔でALI培地をリフレッシュすることが重要です。キャリアプレートシステムの使用は、より大きなスケール(すなわち、24のインサート/プレート)でのRhE栽培にとって非常に重要です。これは、時間を節約し、汚染のリスクを減らし、人為的ミスの導入のための余地を少なくする利点を提供します。また、大量のメディア(すなわち、1.5 mL)でRhEを培養する可能性もあり、ALI培地のリフレッシュの必要数を減らすことができます。さらに、挿入物の完全なプレートを新鮮な媒体でプレートに移し、挿入物との接触を個別に避けたり、プレートの蓋を明らかにしたりする可能性があります。
RhE モデルには、いくつかの制限があります。ネイティブのヒト皮膚では、基底層におけるケラチノサイトの増殖とSCにおける角質細胞の剥離(すなわち、脱生物)との間に平衡がある89.しかし、体外では、デスクワモレーションは行われません。したがって、角性細胞はRhEに付着したままで、生理学的に関連性の低い厚いSCを形成する。したがって、レーズの栽培期間は限られています。さらに、このRhEモデルは、表皮の最も豊富な細胞型である単数形細胞型、すなわちケラチノサイトから構成されているため、単純で簡単である。しかし、表皮に存在する他の細胞タイプは、例えばメラノサイト、樹状細胞(すなわち、ランゲルハンス細胞)、T細胞(例えば、CD8)+ セル) およびメルケルセル13.皮膚モデルの生理学的関連性を高めるために、研究者はメラノサイトを加えることによって皮膚モデルをより複雑にした38 、免疫細胞39、または患者由来細胞90.人間の皮膚モデルのバリア特性は、特に異なるSC脂質組成とより高いバリア透過性のために、ネイティブのヒト皮膚と比較して異なることを覚えておいてください 91,92,93,94,95.しかし、いくつかの研究は低酸素下での培養によるヒト皮膚モデルのバリア特性の変化を報告している96 または相対湿度の低下97、真皮マトリックスのキトサンによる変調98、および培地中の遊離脂肪酸の変化99.さらに、単純で複雑なRhEの両方において、培養条件および培地組成を病理学的特徴を模倣するように変調することができる。サイトカインでモデルに挑戦することで、異常な形態100 アトピー性皮膚炎や乾癬などの一般的な皮膚障害で一般的に観察される遺伝子およびタンパク質発現レベルの変化が確立される35,101,102,103,104,105.3Dモデルの再構成プロセスを開始する前にケラチノサイトの特定の遺伝子をサイレンシングすることは、皮膚障害の特徴を模倣し、新しい治療ソリューションを調査するために使用されるもう一つのアプローチです106,107.表皮層のみをモデル化することに加えて、RhE再構成前にコラーゲンマトリックスに線維芽細胞を埋め込むことで、真皮コンパートメント(すなわち、ヒトの皮膚同等物または全厚モデル)をモデルに含めることができ、老化および創傷治癒関連の研究により生理学的に関連し、治癒関連する研究に適している108,109,110.さらに、腫瘍スフェロイドは、黒色腫の進行を研究するためにヒトの皮膚同等物に追加されました111,112.皮膚モデルの分野における最新の進歩は、バイオプリンティングとスキンオンチップです。最近、複数の研究グループが(透過性の)バイオプリントされた皮膚の開発に成功しました45,113,114.提案された議定書は24ウェルフォーマットおよびキャリア版を利用し、個々に取り扱われる挿入を避ける。しかし、研究規模は依然としてかなり限られており、自動化が欠けている。バイオプリンティングまたはスキンオンチップの使用を実装することにより、より小さなスキンモデルは、より自動化されたプロセスとより大きなスケールで使用することができます。
このプロトコルで説明されているRhEは、既に開発され、よく特徴づけられる商業表皮モデルと複数の類似点を有する。形態学的解析は、提案されたRhEモデルにおける生存可能な層の数が、ネイティブのヒト皮膚のそれと比較して低い(すなわち、7-14と比較して6-7)、EpiDerm RhEモデル(すなわち、8-12)70のそれに匹敵することを実証した。エピダーム、エピスキン、およびスキンエチシカルモデルと同様に、上側RhE層は、密に詰まったコロネサイト層28のバスケット織りパターンを示す。さらに、TEM解析は、提案されたRhEモデルにおけるSC層の数(すなわち、15-25)がEpiDerm(すなわち、16-25)70のSC層の数に匹敵することを明らかにした。全体として、提案されたRhEモデルは、他の商業化された表皮モデルと同様の構造を示し、ヒトの表皮を模倣する。TEERによって測定される組織の完全性は、市販のRhEモデル(すなわち、3000-5600 Ω.cm2)71、72、73および他の社内RhEs(すなわち、約5000 Ω.cm2)74、115と範囲内である。提案されたRhEモデルは、分化および組織接着マーカーの存在および正しい局在化によって示されるように、十分に分化されることを示す。さらに、提案されたRhEモデルは、炎症促進刺激(すなわち、LPSおよびTNF-α)に対して応答性を示す。
結論として、現在のプロトコルは、学術機関と民間機関の両方の研究者のニーズを満たすために、RhEを信頼性の高い方法で比較的大規模に生産する方法を示しています。提案されたRhEモデルは、他の既存の商用モデルと同様の形態、表皮分化、および生物学的応答性を有することを示している。関連する皮膚モデルへのアクセスが必要な場合、医薬品および皮膚化粧品分野の両方に代替ツールを提供します。

表皮は、人体と外部環境との直接の界面で、皮膚の最外層である。その主な機能は、保護と水分補給1を提供することです。表皮は、外部剤に対する効果的な物理的障壁として機能し、身体からの過度の水の損失を防ぎます。これらの皮膚機能は、主に皮膚の最外層における細胞配列、組成、および細胞間脂質2の構成に依存する。表皮は主に組織の外側に上方に移動し、分化を受ける角化細胞で構成される。分化の段階によって特徴付けられる4-5の表皮層がある。内側から外側に、表皮層は生存性表皮、すなわち、層バサレ(SB)、尖層(SS)、および層顆粒球(SG)から、最上層、すなわち角層(SC)3から始まる。基底層は主に増殖性ケラチン濃縮ケラチノサイトで構成され、分化時にSSを介して移動する。ケラチノサイト成熟の間、タンパク質の発現および構造に様々な変化が生じる。ケラチノサイトはデスモソーム接合部5の形成を通して接着する。SGでは、ラメラ体の生成が開始される。それらは、皮膚バリア機能6の形成に重要な脂質前駆体および酵素からなる。SGはまた、ケラチノサイトの細胞質におけるケラトヒヤリン顆粒の存在によって特徴付けられる。SCとの界面では、ラメラ体の含有量が細胞間空間に押し出され、セラミド、コレステロール、遊離脂肪酸などの非極性脂質が積層層ラメラ脂質二重層に組織化され、細胞外脂質マトリックス7を形成する。SCでは、細胞は酵素分解プロセスのために核を含むすべての細胞小器官を失い、平坦化された形態を採用する。それらは架橋された蛋白質層から成っている角膜化された封筒に囲まれ、そして、角質細胞8,9と呼ばれる。デスモソーム成分は、角膜状エンベロープに架橋して、コルネオデスモソームを形成し、角質細胞を結合する。得られた上皮は、幹細胞から継続的に更新され、約5〜6週間のターンオーバー時間が10である。完全に層状表皮をもたらすケラチノサイトの分化過程は、皮膚11のバリア機能の形成にとって極めて重要である。
創傷および炎症の間、ケラチノサイトは接着分子および表面受容体の変化を誘発し、サイトカイン、ケモカイン、および抗菌ペプチド12の分泌を介して炎症反応を引き起こす。皮膚は外因性物質に対する物理的な障壁だけではありません。また、病原体への暴露時に免疫センサーとして機能します。さらに、脱水から人体を保護するために水分含有量など、その層全体にいくつかの物質の拡散を調節します。皮膚はまた、ビタミンDの合成に関与しており、他の様々な代謝機能3、13、14を有する。
外因性物質の有害作用を評価するために、毒物学者は何十年も動物実験に依存してきましたが、今日では好ましいアプローチではありません。人間の毒性に対する予測能力が限られていることに加えて、動物モデルには多くの倫理的問題が伴います。化粧品業界における動物実験の禁止と研究における3R原理(すなわち、交換、削減、および改良)に従うことを勧告することは、インビトロアプローチ15に基づく代替試験方法の開発につながっている。初のin vitro皮膚細胞モデルは90年代にすでに記載されており、単純なヒトケラチノサイト単培養から完全に分化した表皮および完全な厚さのモデルへの印象的な開発は16を達成した。今日では、皮膚組織工学は、医薬品と皮膚化粧品の両方の分野で重要性を増しています。過去20年間で、いくつかの企業は、皮膚関連の研究のための標準化され、再現可能なツールを表す3次元(3D)再構築ヒト表皮(RhE)を製品化しました。いくつかの市販のRhEモデルは、皮膚刺激の試験のためのOECDガイドラインに従って化学物質のインビトロ皮膚試験のために受け入れられている17,18 (すなわち, 試験ガイドライン 43919)および皮膚腐食20 (すなわち, 試験ガイドライン 43121).皮膚感作22(すなわち、SENS-ISアッセイ)のインビトロ試験は、現在承認トラック中であり、ピアレビュー23の下にある。また、市販のRhEモデルを利用する他にも数多くのアッセイが開発されており、光毒性24を評価し、薬物製剤25を試験し、化粧品製剤および有効成分26を試験し、皮膚バリア機能27を研究し、環境ストレッサー28、29、30、31に対する生物学的応答を試験する。
市販の3Dスキンモデルに加えて、複数の研究グループが独自のRhE32、33、34、35、36、37を開発しました。社内のRhEは、研究の目的に応じて培養条件を制御するための利点を提供します。具体的には、研究者は、3D表皮モデルの再構成に使用されるケラチノサイトの種類と供給源を選択することができます(すなわち、一次対不死化、新生児対高齢者、単一対プールランダムドナー、性別、民族性、喫煙などの個人生活習慣)。彼らは、培養培地の組成を変化させ、増殖因子、ビタミン、または標的タンパク質または脂質の発現を調節することができる他の化合物を組み込む可能性を有する。社内のRhEを使用すると、3Dモデルの分化状態の関数として生物学的応答と生体力学的特性を調査することもできます。これらの直観的なパラメータに加えて、例えば他の表皮細胞タイプ(例えばメラノサイトおよび免疫細胞)38、39を加えることによって、線維芽細胞が含まれるコラーゲンマトリックス40、41、42、および44の構成要素によって、3D皮膚モデルの複雑さを増大させ、より生理的に関連するようにする継続的な努力がある。
特定のニーズに応じてカルチャ条件を調整することは可能ですが、RhE の品質と関連性の両方を保証するために尊重する必要があるパラメーターがあります。RhE組織を培養するために、正常なヒト表皮角化細胞(NHEKs)は、多孔質合成膜がウェルを2つの区画、すなわち、有端およびバソラテラコンパートメントに分離する特定の透過培養インサートに播種される。膜の空隙率(すなわち、0.4μmの孔径)は、基底挿入側への細胞の移動を伴う有端コンパートメント内の細胞単層の形成、およびバソラテラコンパートメントに含まれる培養培地からの必須栄養素を含むケラチノサイトの供給を可能にするものである。再構成プロセスの開始時に、NHEKsは数日間水没した状態で培養され、膜への接着が可能になります。両方の区画のカルシウム濃度は、細胞の増殖を遅くし、その分化を促進するためにNHEKsの2D培養に使用されるカルシウム濃度に比べて増加する46.表皮カルシウム勾配は、バリア形成およびホメオスタシス47,48を調節するために不可欠である。高カルシウムレベル(すなわち、最大1.5mM)は、細胞間接合の形成を促進し、末端分化中に角膜状エンベロープの形成を調節する。一旦、角化膜上に連続的かつ堅固な単層を形成すると、その空気室からの培地が除去され、培養プロセスは、空気・液体界面(ALI)で継続して層形成を刺激し、表皮バリア50,51を確立する。完全に階層化された上皮36を得るためには、特定の培養条件が重要である。ALIでの再構成プロセス中に、バソラテラルコンパートメント内の培地は、ケラチノサイト成長因子(KGF)、インスリン、カルシウム、およびアスコルビン酸で補充される。アスコルビン酸は、適切なSC脂質バリアの形成において大きな役割を果たし、ヒトの皮膚52に近い。アスコルビン酸添加培地で増殖したケラチノサイトは、角質藻肉の粒状化の数を増強した、ならびに角質細胞52のインターステクスにおける細胞間脂質ラメラを組織化した分化表現型を示す。このような補充は、角膜化エンベロープ含有量を増加させ、親水性抗酸化ストア53,54の枯渇を回避することによって表皮バリア機能を改善するために不可欠である。KGFは、表皮増殖および分化の重要なパラクリンメディケーターであり、NHEKs55を刺激するために使用される。
社内のRhEの主な欠点は、研究機関間の標準化の喪失と労働強度と時間消費の増加(すぐに使用できる商用モデルと比較して最大3週間)です。本稿の目的は、これらの欠点に対処し、生産の基礎を大きな規模にすることです。上記の社内RhEの利点に加えて、現在のプロトコルは、組織間の可変性と組織間の変動性を低減し、汚染リスクを低減し、栽培プロセスを合理化することを目的としています。
現在のプロトコルは新生児のNHEKsを使用してRhEを栽培するために再生可能で、強い方法を記述する。さらに、表皮分化に特異的なRhEs形態の特徴づけ、バリア完全性、およびタンパク質の発現の代表的な結果を示す。RhEs形態構造を、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色および透過電子顕微鏡(TEM)を用いて検討した。バリア完全性を評価するために、経上皮電気抵抗(TEER)とトリトンX-100への曝露時間を組織生存率の50%を減少させる(ET50)測定した。デスモソーム接合(すなわちデスモグレン1)の形成を免疫蛍光(IF)で解析し、ケラチノサイト接着を評価した。表皮構造タンパク質(すなわち、インボルクリン、ロリクリン、フィラグリン)の形成を評価し、IFで検出した。これらのタンパク質は、SC角質細胞を取り囲む高度に架橋されたタンパク質エンベロープの形成に関与し、その結果、後期表皮分化56,57の重要なマーカーである。さらに、IFを用いて、SS58において初期の分化細胞において誘導されるタンパク質であるケラチン10を分析し、全ての分化層の内部に見つかった。最後に、炎症促進性刺激(すなわち、リポ多糖および腫瘍壊死因子α)に対するRhEの反応を調査した。インターロイキン1α(IL-1α)およびインターロイキン8(IL-8)のレベルを、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて細胞培養培地で測定した。

<table><tbody><tr><td>酢酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td>エオシン溶液を100mLあたり1mLの酢酸で酸性化します。</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬 (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>エオシンY水溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>HT110280</td><td>100 mLあたり1 mLの酢酸でエオシン溶液を酸性化します。</td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)</td><td>Sigma AldrichまたはMerck</td><td>C8106または1.02378.0500</td><td>0.144 Mのストック溶液を調製し、ろ過滅菌し、アリコートを-20°Cで保存します。6か月ごとに新しいアリコートを準備することをお勧めします。</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ロシュ</td><td>10236276001</td><td>100&muで在庫を準備します。g/mL で、-20 °C のアリコートを保管します。作業条件は 1 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>Entellan 埋込剤</td><td>Merck</td><td>1.07960.0500</td><td>H&E染色。</td></tr><tr><td>EpiLife培地(ケラチノサイト増殖培地)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(Gibco)</td><td>MEPI500CA</td><td>0.06 mMのCa2+が含まれています。</td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>任意のサプライヤー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン 10%</td><td>ライカ バイオシステムズ</td><td>3800770</td><td></td></tr><tr><td>ヒト ケラチノサイト成長サプリメント (HKGS) (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td> <td>S0015</td> 最終<td>濃度 0.2% [v/v] BPE、0.2 ng/mL ヒト組換え EGF、0.18 &mu;g/mL ヒドロコルチゾン,5 &μ;g/mL ウシトランスフェリン、および 0.01 &micro;g/mL ヒト組換えインスリン様成長因子-I.</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>バイオソルブB.V.</td><td>0016264102BS</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser's グリセロールゼラチン、フェノールフリー</td><td>Merck</td><td>1.08635.0100</td><td>IF染色用封入剤。</td></tr><tr><td>ケラチノサイト増殖因子(KGF)</td><td>R&D Systems</td><td>251-KG-050</td><td>KGFタンパク質を100 &mu;g/mL 滅菌 0.1% [w/v] BSA 含有 PBS 溶液。アリコートを準備し、-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)アッセイキット</td><td>ロシュ</td><td>4744926001</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸 セスキマグネシウム塩水和物&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>25 mg/mLのストック溶液を調製し、ろ過滅菌し、アリコートを-20°Cで保存します。6か月ごとに新しいアリコートを準備することをお勧めします。暗闇で保管してください。</td></tr><tr><td>リポ多糖類(LPS)、大腸菌株O55:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4524</td><td>滅菌PBSで1 mg / mLのストックを準備し、-20°Cでアリコートを保存します。g/mL.&nbsp;</td></tr><tr><td>メイヤー's ヘマトキシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MHS80</td><td></td></tr><tr><td>正常なヒト表皮ケラチノサイト (NHEKs)</td><td>ロンザ</td><td>00192906</td><td>新生児包皮から分離されたヒト初代ケラチノサイトは、少なくとも 3 人のドナーからプールされています。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Thermo Fisher Scientific(Gibco)</td><td>10010056 または 10010-015</td><td>参照番号は国によって異なる場合があります。</td></tr><tr><td>組換え腫瘍壊死因子アルファ(TNF-&alpha;)</td><td>ImmunoTools</td><td>11344483</td><td>100 &mu;滅菌超純水中のg / mL。使用濃度は40ng/mL</td></tr><tr><td>滅菌超純水</td><td>任意のサプライヤー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>チアゾリルブルーブロミドテトラゾリウム(MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td>滅菌PBSに5mg/mL MTTのストックを準備します。使用濃度は1 mg / mLです。</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー (0.4% [v/v])</td><td>任意のサプライヤー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA (0.05% [v/v])</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック (Gibco)</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG H&L (Alexa Fluor 488)</td><td>Abcam</td><td>Ab150113</td><td></td></tr><tr><td>三ナトリウムクエン酸二水和物</td><td>Merck</td><td>1.06448.0500</td><td>IF染色用抗原賦活化緩衝液用&nbsp;</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgGハンド&L (Dylight 488)</td><td>Agrisera</td><td>AS09 633</td><td></td></tr><tr><td>Filaggrin Mouse antibody</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-53243</td><td></td></tr><tr><td>Involucrin Rabbit antibody</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-33742</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 10 Mouse antibody</td><td>BioTechne (Novus Biologicals)</td><td>NBP2-32962</td><td></td></tr><tr><td>Desmoglein-1 Mouse antibody&nbsp;</td><td>BioTechne(ノーバスバイオロジカルズ)</td><td>MAB944</td><td></td></tr><tr><td>ロリクリンウサギ抗体</td><td>BioTechne(ノーバスバイオロジカルズ)</td><td>NBP1-33610</td><td></td></tr></tbody></table>

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

新生児原発性角化細胞から再構築された3次元ヒト表皮モデルを発表する。本明細書において、モデルの育成過程および特性評価のためのプロトコルについて説明する。新生児一次角化細胞は、透過性ポリカーボネートインサートに水没して成長し、播種の3日後に空気液体界面に持ち上げられる。高カルシウム培養培地における定義された成長因子およびアスコルビン酸による刺激の14日後、モデルは完全に分化される。組織学的分析は、完全に階層化された表皮を明らかにし、人間の皮膚の形態を模倣した。モデルおよびそのバリア機能を特徴付けるために、初期段階のケラチノサイト分化(すなわち、ケラチン10)に特異的なタンパク質レベルおよび局在化、後期分化(すなわち、インボルクリン、ロリクリン、およびフィラグリン)および組織接着(すなわち、デスモグレイン1)を免疫学的に評価した。組織バリア完全性を、経上皮電気抵抗を測定することによってさらに評価した。ヒト表皮が 炎症促進性刺激(すなわち、リポ多糖および腫瘍壊死因子α)に反応し、サイトカイン放出の増加(すなわち、インターロイキン1アルファおよびインターロイキン8)に至った。このプロトコルは、環境への影響と幅広い皮膚関連研究を評価するためのツールとして 、再構築された ヒト表皮を育成するための簡単で再現可能なインビトロ法を表しています。

2Dで培養されたNHEKsは、一貫した多角形の形状を持つ伝統的な形態を表示する(図2A)。上述のように、NHEKは約80%の合流度に達した後に培養インサートに播種される。RhEsの形態をH&amp;E染色とTEMを用いて解析した。ALIでの15日後、その4つの主要な表皮層(SB、SS、SG、およびSC)によって示されるように完全に層状組織が得られる(図2B)。SB レイヤーでは、セルは柱状の形状を持っています。2番目の層からRhEの上層に向かって、NHEKsは細胞形態の変化によって観察されるように区別する(SB層の柱状形状から、SS層の棘形状に向かって)。SG層では、細胞はより平坦な形状を有し、細胞質に紫色の点として表される角質ヒヤリン顆粒(KG)を表示する。その特徴的な丸い形状と恒星形状は、H&amp;E画像上の白い矢印で強調されています(図2C)。SC内の細胞は、末端分化され、完全に平坦化され、細胞核を欠いている。層状のRhEの全体の厚さは84.3±2.4 μmで、SCの厚さは19.6±3.2μm(図2D)です。これらの値は、ネイティブのヒト皮膚、すなわち60-120 μmおよび10-20 μm、それぞれ69に対して報告されるものと同等である。生存層の数は6~7で、人間の皮膚に比べて少ないが、7~1470程度である。再構成プロトコルの異なる時点でのRhEの超構造解析(すなわち、7、10、13、および15日)は、時間の経過とともに多くの角質層を有するRhEの角化プロセスを明らかにする(図2E)。ALIで15日後、RhE組織のSCは、約15〜25層で作られており、これは、ネイティブのヒト皮膚(すなわち、15〜20層)69に対して報告された値に匹敵する。
<img alt="皮膚層と細胞増殖の組織学;顕微鏡画像と厚さ分析用の棒グラフが含まれています。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:一次角化細胞および再構成されたヒト表皮(A)挿入物に播種する前の第一次角化細胞の位相対照顕微鏡画像。スケールバーは、RhEの50μm(B-C)H&amp;E明るいフィールド顕微鏡画像です。スケールバーは50μm(B)、25μm(C)です。(D) RhE および SC の厚さの定量化 (平均 ± SEM、n =3)。(E) ALIで7、10、13、および15日後のRhE断面の透過型電子顕微鏡画像。スケールバーは4μmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
彼らの分化段階によると、3Dで成長するNHEKは、その分化段階に応じて異なるタンパク質発現プロファイルを示す。初期のケラチノサイト分化に特異的なタンパク質(すなわち、ケラチン10)、後期ケラチノサイト分化(すなわち、インボルクリン、ロリクリン、フィラグリン)、およびケラチノサイトの接着(すなわち、デスモグライン1)を用いて決定した。インボルクリン発現は、その発現が分化プロセス(図3D)の間に早く開始されるので、より主にSG層に位置するように見えるが、フィラグリンとロリクリンは上層で表される(図3B-C)。ケラチン10発現は、SB層を除くすべての実行可能な層に見つかった(図3E)。RhEは、生き生きした表皮層の細胞間空間におけるデスモグレイン1の発現によって示されるように、機能的デスモソーム接合部を表示する(図3F)。結論として、5つのマーカーすべてが適切な表皮層に発現され、位置し、健全な表皮分化プロセスに翻訳される。
<img alt="表皮皮膚層の組織学および免疫蛍光顕微鏡検査。H&amp;Eおよびタンパク質マーカー。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:表皮分化、組織接着、および再構築されたヒト表皮の組織完全性を示す(A)H&amp;E明るい視野顕微鏡画像RhE(B)フィラグリン(FLG)、(C)ロリクリン(LOR)、(D)インボルクリン(INV)、(E)ケラチン10(K10)、および(F)デスモグレン1(DSG-1)の共焦点蛍光顕微鏡画像。核染色(DAPI)は青色で表される。スケールバーは25μmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
RhEモデルのバリア特性を、組織の生存率と完全性の両方を評価することによって調査した。組織の完全性は、電圧計を用いてTEERを測定することによって15日後に決定した。2567 ± 415 Ω.cm2値は、RhEs に記録され、連続的なバリアの形成を変換します (図 4A)。これらの値は、RhE モデル71、72、73、74で報告された値と範囲内にあります。さらに、細胞毒性基準化学物質(すなわち、トリトンX-100)が組織生存率を50%減少させるために必要な暴露時間(ET50)をチアゾリルブルーの臭化テトラゾリウム(MTT)アッセイで決定した。RhEについて測定したET50値は2.1時間であった。この値は、刺激分類の信頼性の高い予測のために修飾されている他の3D表皮モデルの受け入れ範囲内に収まる (OECD ガイドライン 439)19.
<img alt="組織の抵抗と生存率と曝露時間を示す箱ひげ図と折れ線グラフ。ET50=2.1時間です。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:再構成されたヒト表皮のバリア特性(A)経上皮電気抵抗(平均 ±sEM、n=6)で測定された組織の完全性。(B) ET 50は、トリトンX-100(± 平均sEM、n=3)の78.3 μLへの局所暴露時の組織生存率(すなわちMTTアッセイ)を測定することによって決定される。
RhEの応答性は、既知の炎症刺激を受けた上で調べた。RHEは、100μg/mL大腸大腸リポ多糖(LPS)および40ng/mL腫瘍壊死因子α(TNF-α)を用いて、バソラテラコンパートメントの培地に刺激を加えて全身的に処理した。24時間の刺激後、細胞培養培地を採取した。細胞毒性を乳酸脱水素酵素(LDH)アッセイを用いて測定し、既知の膜破壊剤の値と比較して、Triton X-100洗剤を比較した(図5)。トリトンX-100で処理されたRhEsのLDH活性において有意な増加(p&lt;0.05、一方向ANOVA、ダネットの多重比較検定)が示された。LPSおよびTNF α治療はいずれも細胞毒性を示さなかった。
<img alt="LDH活動棒グラフ;TX-100、LPS、TNF-αの比較。酵素アッセイの結果;統計分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5:乳酸脱水素酵素(LDH)アッセイを用いて測定した細胞毒性。 データは、コントロール、未処理の組織(CTRL)に対する相対値として表示されます。± 平均は、SEM、n=9(トリトンX-100)、n=8(LPS)、n=3(TNF-α) を意味します。有意性は、ダネットの多重比較試験である一方向のANOVAで試験された。アスタリスクは、CTRL、****p &lt; 0.0001) と比較して統計的に有意な差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
RhE培地におけるインターロイキン1α(IL-1α)及びインターロイキン8(IL-8)の放出を、エリザを用いて定量した。 図6 はLPSおよびTNF-αでの挑戦時にRhEsによる定量および相対IL-1αおよびIL-8放出の両方を示す。LPS処理は、IL-8(9.6±1.0倍増加)およびIL-1α(2.7±1.3倍増加)の放出を誘発した統計的に有意な(p&lt;0.05、未組の学生のTテスト)をもたらした。TNF-αは、IL-8レベルの上昇傾向が認められたにもかかわらず、IL-8放出を有意に誘導しなかった(2.3±0.8倍増加)。しかし、TNF-αは有意に(p &lt;0.05、未組の学生のT検定)はIL-1α放出を引き起こした(1.8±0.5倍増加)。
<img alt="IL-8、IL-1α発現レベルの棒グラフ比較。LPS、TNF-α効果;統計分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図6:再構築されたヒト表皮における炎症反応を示す。LPS(A)とTNF-α(B)による24時間の挑戦に対するRhEによるIL-8放出の濃度。データは、SEM、n=8 (LPS)、n=3 (TNF-α) ±平均として表されます。(C) データは、制御、未処理組織 (CTRL) ± SEM、n=8 (LPS)、n=3 (TNF-α) と比較した相対値の平均として表されます。LPS(D)およびTNF-α(E)による24時間チャレンジ時のRhEのIL-1α放出の濃度。 データは、SEM、n=8 (LPS)、n=3 (TNF-α) ±平均として表されます。(F) データは、Ctrl ± SEM、n=4 (LPS)、n=3 (TNF-α) と比較した相対値の平均として表されます。有意性は、ペアになっていない学生のT検定によってテストされました。アスタリスクは、CTRL、*p &lt;0.05、****p &lt;0.0001)と比較して統計的に有意な差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、再現性と堅牢な方法で三次元再構成ヒト表皮を栽培するための簡単な方法を記述する。さらに、表皮バリアモデルの構造機能関係を特徴付けます。炎症促進刺激の際に再構成されたヒト表皮の生物学的応答も提示される。

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

in vitroまたは構築されたヒト表皮モデルは、動物実験に代わる試験方法を開発することを第一の目標と共に、90年代に最初に開発されました。これらの3D表皮モデルは、現在、化粧品成分の安全性と有効性の両方をテストするために一般的に使用されています。複数の組織サプライヤーから購入できるのに対し、実験室で3Dモデルを再構成できることで、目的の終点に柔軟性が与えます。3D表皮モデルの再構成プロトコルを簡単に説明した研究記事がいくつかありますが、現在までに、再構成プロセスの重要なステップを示すビデオはありませんでした。これがこのビデオペーパーの出版の背後にある理由です。ヒト表皮の創製は、培養培地組成の変化、炎症促進または酸化ストレスの誘発、目的遺伝子のサイレンシング、特定の生物学的プロセスの阻害または刺激など、培養プロセスにおいて多くの自由を可能にする。まず、バイアルの一部を水中に沈めることで、摂氏37度の水浴で100万個のクライオ保存された正常なヒト表皮角化細胞(NHEKs)を有するバイアルを解凍する。小さな氷が見えるまで、水浴でバイアルを1〜2分間インキュベートします。2~3回上下にピペットを入れ、細胞を非常に慎重に再懸濁させます。細胞懸濁液を、合計15ミリリットルの事前警告解凍媒体を含む2つのT75フラスコに移し、その結果、10倍の4番目の細胞に6.7倍の播種密度が得られる。24ウェルプレートに1.5ミリリットルの水没培地をプレフィルし、理想的にはディスペンサーピペットを使用します。80%合流まで細胞を培養した後、それらは再構築されたヒト表皮、またはREの培養のための挿入物に播種する準備ができている。NHEKsを使用してT75フラスコから基底媒体を取り出します。各T75フラスコに5ミリリットルの事前温めたPBSを加えて細胞をすすいで、フラスコからPBSを取り出します。各フラスコに2〜3ミリリットルのプリ温め0.05%トリプシン-EDTAを加え、トリプシン溶液がフラスコの細胞培養領域に均等に分配されるようにする。フラスコを細胞培養インキュベーターに4分間入れ、顕微鏡で細胞が10倍の倍率で剥離するかどうかを確認します。フラスコの表面から細胞が放出するのを助けるためにフラスコをラップします。すべての細胞が剥離したら、各T75フラスコに均等な量のプリ加温トリプシン阻害剤を加え、フラスコから遠心分離管に細胞懸濁液を移す。フラスコを5ミリリットルの予め温めたPBSでリンスし、細胞懸濁液を含む遠心分離管に移します。5分間Gの400倍で収穫した細胞を遠心分離する。チューブに約100~200マイクロリットルを残して上清のほとんどを慎重に捨てます。慎重にペレットを緩めるために指でチューブを軽くフリックします。少量の水没培地で細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、5~10回上下にピペットを回し、均一な細胞懸濁液を確保する。細胞凝集体の形成を避けるために少量から始め、最初のT75フラスコごとに水没培地を1ミリリットルまで加えます。トリパンブルー除外法を使用して、懸濁液中のセルをカウントします。テキスト原稿に用意されている最初の式を使用して、追加の水没培地で細胞懸濁液を希釈し、1ミリリットル当たり5番目の細胞に3.525倍の濃度に達する。希釈溶液の第2の細胞数を実行し、テキスト原稿の第2の方程式を用いて、培養インサートに播種される細胞懸濁液量を算出する。キャリアプレートの最高位置に24ウェル培養インサートを掛け、液状の培地であらかじめ充填された24ウェルプレートにキャリアプレートを移す。各挿入物にセルサスペンションの決定されたボリュームを追加し、挿入物に触れないように注意してください。播種後、24ウェルプレートを室温で10~15分間インキュベートし、エッジ効果を克服します。この間はプレートを動かさないで下します。プレートを細胞培養インキュベーターに移し、3日間水没した状態にしておきます。細胞培養インキュベーターでの3日間のインキュベーションの後、吸引システムとガラスパスツールピペットを用いて、空気液界面に付着した細胞を空気液体界面(ALI)に露出させる。新しい24ウェルプレートに1.5ミリリットルの新鮮な事前温めたALI培地を充填し、新しいマルチウェルプレートに培養インサートを使用してキャリアプレートを転送します。マルチウェルプレートを細胞培養インキュベーターに戻します。ALI メディアを 2 ~ 3 日ごとに 14 日間更新します。2D培養におけるケラチノサイトは、一貫した多角形の形状を持つ伝統的な形態を示す。ALIで15日後、再構築されたヒト表皮は完全に層状組織を形成し、これはその4つの主要な表皮層によって示される。再構成プロトコルの異なる時点で再構成されたヒト表皮の超構造解析は、時間の経過とともに角膜部位層の数が増加する角化プロセスを明らかにする。表皮のケラチノサイトは、その分化段階に応じて異なるタンパク質発現プロファイルを示す。インボルクリン発現はSG層でより主に現れ、フィラグリンとロリクリンの発現は上層に位置する。ケラチン-10発現は、SB層を除くすべての実行可能な層で発見された。再構築されたヒト表皮は、生じ得る表皮層の細胞間空間におけるデスモグレイン-1の発現によって示されるように、機能的なデスモソーム接合部を示す。再構築された表皮モデルのバリア特性を、既知のバリアディスラプターによる局所治療時の組織生存率を評価し、組織の完全性を評価することによって調べた。組織の完全性は、電圧計でTEERを測定することによって15日後に決定した。リポ多糖および腫瘍壊死因子αに対する表皮の応答性を調べた。LPSとTNFのアルファ治療はいずれも無毒であった。トリトン X-100 コントロールに対して相対的です。RHE培地におけるインターロイキン-1アルファおよびインターロイキン-8の放出をILリシスを用いて定量した。LPS治療は、インターロイキン-1アルファおよびインターロイキン-8の放出において統計的に有意なアップレギュレーションをもたらした。TNFアルファ治療は、インターロイキン-1アルファの放出のみにおいて統計的に有意なアップレギュレーションをもたらした。しかし、TNFαによる刺激ではインターロイキン-8レベルの上昇傾向も明らかであった。このプロトコルに従って、TEER はバリアの完全性の値として測定することができます。生存性または細胞毒性は、例えばMTTまたはLDHアッセイによって測定することができる。上清はサイトカインまたは他のタンパク質の分泌を測定するために使用することができる。さらに、組織は、目的のタンパク質または遺伝子の発現を研究するために使用することができる。

cultivating-three-dimensional-reconstructed-human-epidermis-at-large

Research

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Bioengineering

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