3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成
May 28th, 2021
このプロトコルは、再現性と堅牢な方法で三次元再構成ヒト表皮を栽培するための簡単な方法を記述する。さらに、表皮バリアモデルの構造機能関係を特徴付けます。炎症促進刺激の際に再構成されたヒト表皮の生物学的応答も提示される。
in vitroまたは構築されたヒト表皮モデルは、動物実験に代わる試験方法を開発することを第一の目標と共に、90年代に最初に開発されました。これらの3D表皮モデルは、現在、化粧品成分の安全性と有効性の両方をテストするために一般的に使用されています。複数の組織サプライヤーから購入できるのに対し、実験室で3Dモデルを再構成できることで、目的の終点に柔軟性が与えます。
3D表皮モデルの再構成プロトコルを簡単に説明した研究記事がいくつかありますが、現在までに、再構成プロセスの重要なステップを示すビデオはありませんでした。これがこのビデオペーパーの出版の背後にある理由です。ヒト表皮の創製は、培養培地組成の変化、炎症促進または酸化ストレスの誘発、目的遺伝子のサイレンシング、特定の生物学的プロセスの阻害または刺激など、培養プロセスにおいて多くの自由を可能にする。
まず、バイアルの一部を水中に沈めることで、摂氏37度の水浴で100万個のクライオ保存された正常なヒト表皮角化細胞(NHEKs)を有するバイアルを解凍する。小さな氷が見えるまで、水浴でバイアルを1〜2分間インキュベートします。2~3回上下にピペットを入れ、細胞を非常に慎重に再懸濁させます。
細胞懸濁液を、合計15ミリリットルの事前警告解凍媒体を含む2つのT75フラスコに移し、その結果、10倍の4番目の細胞に6.7倍の播種密度が得られる。24ウェルプレートに1.5ミリリットルの水没培地をプレフィルし、理想的にはディスペンサーピペットを使用します。80%合流まで細胞を培養した後、それらは再構築されたヒト表皮、またはREの培養のための挿入物に播種する準備ができている。
NHEKsを使用してT75フラスコから基底媒体を取り出します。各T75フラスコに5ミリリットルの事前温めたPBSを加えて細胞をすすいで、フラスコからPBSを取り出します。各フラスコに2〜3ミリリットルのプリ温め0.05%トリプシン-EDTAを加え、トリプシン溶液がフラスコの細胞培養領域に均等に分配されるようにする。
フラスコを細胞培養インキュベーターに4分間入れ、顕微鏡で細胞が10倍の倍率で剥離するかどうかを確認します。フラスコの表面から細胞が放出するのを助けるためにフラスコをラップします。すべての細胞が剥離したら、各T75フラスコに均等な量のプリ加温トリプシン阻害剤を加え、フラスコから遠心分離管に細胞懸濁液を移す。
フラスコを5ミリリットルの予め温めたPBSでリンスし、細胞懸濁液を含む遠心分離管に移します。5分間Gの400倍で収穫した細胞を遠心分離する。チューブに約100~200マイクロリットルを残して上清のほとんどを慎重に捨てます。
慎重にペレットを緩めるために指でチューブを軽くフリックします。少量の水没培地で細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、5~10回上下にピペットを回し、均一な細胞懸濁液を確保する。細胞凝集体の形成を避けるために少量から始め、最初のT75フラスコごとに水没培地を1ミリリットルまで加えます。
トリパンブルー除外法を使用して、懸濁液中のセルをカウントします。テキスト原稿に用意されている最初の式を使用して、追加の水没培地で細胞懸濁液を希釈し、1ミリリットル当たり5番目の細胞に3.525倍の濃度に達する。希釈溶液の第2の細胞数を実行し、テキスト原稿の第2の方程式を用いて、培養インサートに播種される細胞懸濁液量を算出する。
キャリアプレートの最高位置に24ウェル培養インサートを掛け、液状の培地であらかじめ充填された24ウェルプレートにキャリアプレートを移す。各挿入物にセルサスペンションの決定されたボリュームを追加し、挿入物に触れないように注意してください。播種後、24ウェルプレートを室温で10~15分間インキュベートし、エッジ効果を克服します。
この間はプレートを動かさないで下します。プレートを細胞培養インキュベーターに移し、3日間水没した状態にしておきます。細胞培養インキュベーターでの3日間のインキュベーションの後、吸引システムとガラスパスツールピペットを用いて、空気液界面に付着した細胞を空気液体界面(ALI)に露出させる。
新しい24ウェルプレートに1.5ミリリットルの新鮮な事前温めたALI培地を充填し、新しいマルチウェルプレートに培養インサートを使用してキャリアプレートを転送します。マルチウェルプレートを細胞培養インキュベーターに戻します。ALI メディアを 2 ~ 3 日ごとに 14 日間更新します。
2D培養におけるケラチノサイトは、一貫した多角形の形状を持つ伝統的な形態を示す。ALIで15日後、再構築されたヒト表皮は完全に層状組織を形成し、これはその4つの主要な表皮層によって示される。再構成プロトコルの異なる時点で再構成されたヒト表皮の超構造解析は、時間の経過とともに角膜部位層の数が増加する角化プロセスを明らかにする。
表皮のケラチノサイトは、その分化段階に応じて異なるタンパク質発現プロファイルを示す。インボルクリン発現はSG層でより主に現れ、フィラグリンとロリクリンの発現は上層に位置する。ケラチン-10発現は、SB層を除くすべての実行可能な層で発見された。
再構築されたヒト表皮は、生じ得る表皮層の細胞間空間におけるデスモグレイン-1の発現によって示されるように、機能的なデスモソーム接合部を示す。再構築された表皮モデルのバリア特性を、既知のバリアディスラプターによる局所治療時の組織生存率を評価し、組織の完全性を評価することによって調べた。組織の完全性は、電圧計でTEERを測定することによって15日後に決定した。
リポ多糖および腫瘍壊死因子αに対する表皮の応答性を調べた。LPSとTNFのアルファ治療はいずれも無毒であった。トリトン X-100 コントロールに対して相対的です。
RHE培地におけるインターロイキン-1アルファおよびインターロイキン-8の放出をILリシスを用いて定量した。LPS治療は、インターロイキン-1アルファおよびインターロイキン-8の放出において統計的に有意なアップレギュレーションをもたらした。TNFアルファ治療は、インターロイキン-1アルファの放出のみにおいて統計的に有意なアップレギュレーションをもたらした。
しかし、TNFαによる刺激ではインターロイキン-8レベルの上昇傾向も明らかであった。このプロトコルに従って、TEER はバリアの完全性の値として測定することができます。生存性または細胞毒性は、例えばMTTまたはLDHアッセイによって測定することができる。
上清はサイトカインまたは他のタンパク質の分泌を測定するために使用することができる。さらに、組織は、目的のタンパク質または遺伝子の発現を研究するために使用することができる。
概要
このプロトコルは、炎症促進刺激に対する生物学的反応と構造機能関係を強調しながら、三次元再構成されたヒト表皮を培養する方法を概説しています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 組織工学
背景
- 3D表皮モデルは、動物実験の代替手段として開発されました。
- これらのモデルは、化粧品成分の安全性と効果のテストに広く使用されています。
- 実験室で3Dモデルを再構成することで、実験条件のカスタマイズが可能になります。
- 以前の文献では、再構成プロセスの詳細な視覚的プロトコルが不足していました。
研究の目的
- ヒト表皮の再構成のための包括的なプロトコルを提供すること。
- さまざまな刺激に対する表皮の生物学的反応を実証すること。
- 表皮バリアモデルの理解を深めること。
使用した方法
- 正常なヒト表皮角化細胞（NHEKs）の解凍と培養。
- 表皮再構成のための培養挿入物への細胞の播種。
- 水没下での培養に続く空気-液体界面ばく露。
- 組織の生存性とバリア特性の評価。
主要な結果
- 再構成された表皮は、15日後に完全に層化した組織を形成します。
- 角化細胞は分化段階に基づいて異なるタンパク質発現プロファイルを示します。
- 生存可能な表皮層に機能的なデスモソーム接合部が存在します。
- モデルのバリア特性は、既知のバリア破壊物質を使用して評価されました。
結論
- このプロトコルは、ヒト表皮モデルでの柔軟な実験を可能にします。
- 再構成された表皮は、in vivo条件を効果的に模倣します。
- このモデルは、さまざまな生物学的プロセスと反応を研究するために使用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Large-scale cultivation of three-dimensional reconstructed human epidermis (RHE) enables robust, physiologically relevant in vitro models for skin biology and barrier function studies. This capability supports predictive confidence in early safety, efficacy, and mechanistic de-risking for dermatological and transdermal product pipelines. RHE models facilitate portfolio decisions by providing standardized, reproducible systems for compound evaluation and environmental effect assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of skin barrier mechanisms and cellular differentiation pathways.
- Supports functional validation of targets involved in epidermal structure and response.
- Facilitates mechanistic de-risking for compounds affecting skin integrity or inflammation.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, stratified tissue platform for quantitative barrier and viability assays.
- Enables standardization of cytokine release and protein expression readouts for screening.
- Supports scalability and adaptation for high-throughput compound or environmental testing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human skin biology for translational biomarker studies.
- Bridges discovery findings to preclinical validation of skin-targeted interventions.
- Reduces reliance on animal models by offering human-relevant tissue responses.
Pipeline & Workflow Integration
This RHE cultivation protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, screening, and translational validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven studies of epidermal differentiation, barrier function, and inflammatory response.
- Screening: Delivers quantitative outputs such as TEER, cytokine release, and viability for compound triage.
- Analytics: Supports immunofluorescence and protein localization analyses for comparative condition assessment.
- Translational Research: Provides continuity for biomarker alignment and disease-relevant modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, modifiable platform adaptable to diverse R&D objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in skin biology studies.
- Operational Value: Standardizes tissue model production for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust in vitro testing.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of dermatological assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary keratinocyte culture and tissue engineering.
- Needs access to cell culture infrastructure, TEER measurement, and immunofluorescence capabilities.
- Demands cross-team standardization for reproducible tissue generation and assay outputs.
- Adaptable to various experimental triggers, gene silencing, or compound testing as supported by the protocol.
- Limitations include model complexity and the need for careful handling to maintain tissue integrity.
