ヒト単球由来M1とM2の分極化と 結核 菌感染時のフローサイトメトリーによる解析

このプロトコールは、10色フローサイトメトリーを使用して、多様なマクロファージサブセットにおける緑色蛍光タンパク質標識Mtbの可視化と詳細な特性評価に基づいて、ヒト単球由来細胞の免疫分極を追跡する機会を提供します。これは、感染前後の表現型と機能の評価を含む、M1またはM2分極マクロファージにおけるMtb感染に対する反応を研究するための効率的で再現性の高い方法を表しています。ヒトドナーバフィーコートからPBMCを単離するには、ピペットを使用して、15ミリリットルのバフィーコート血液を50ミリリットルのチューブの側面から15ミリリットルの密度勾配培地にゆっくりと重ね、遠心分離によって細胞を分離します。

滅菌パスツールピペットを使用して上部の血漿層を取り出し、単核細胞層を新しい50ミリリットルのチューブに慎重に移します。無血清のRPMI培地を細胞に添加して最終容量50ミリリットルにし、チューブを数回静かに反転させてから遠心分離します。次に、細胞を20ミリリットルの無血清培地に再懸濁してカウントします。

マクロファージの分化を開始するには、細胞を無血清培地濃度の1ミリリットルあたり10倍から6番目の細胞に希釈し、2ミリリットルの細胞を6ウェルプレートの個々のウェルに播種します。プレートを細胞培養インキュベーターに2〜3時間置き、細胞がウェル底に付着することを確認します。インキュベーションの終了時に、1回の洗浄につき1ミリリットルの無血清培地でウェルを3回洗浄し、接着細胞の各ウェルにそれぞれ50ナノグラム/ミリリットルのGM-CSFまたは50ナノグラム/ミリリットルのM-CSFまたはM-CSF1ミリリットルあたり50ナノグラムを添加した完全RPMI培地をそれぞれ追加します。

分極開始の3日後、各ウェルから1ミリリットルの上清を、適切な成長因子を補充した1ミリリットルの新鮮な完全培地と慎重に交換します。培養の6日目に、インターフェロンガンマ線1ミリリットルあたり50ナノグラム、LPS1ミリリットルあたり10ナノグラムをGM-CSF処理ウェルに、IL-41ミリリットルあたり20ナノグラムをM-CSF処理ウェルに加えます。単球由来の細胞培養物の形態を光学顕微鏡で定期的にチェックし、小さな単球がより大きなマクロファージ様細胞に分化していることを確認します。

Mtb培養をセットアップするには、バイオセーフティレベルIII施設で、解凍した細菌懸濁液の1ミリリットルのアリコートと9ミリリットルの結核完全培地を50ミリリットルのフィルター付きキャップチューブに混合し、細胞培養インキュベーター内のチューブ内で24時間インキュベートします。翌日、遠心分離により細菌を採取し、ペレットを新しい50ミリリットルの濾過キャップ培養チューブに入れた15〜20ミリリットルの新鮮な結核完全培地に再懸濁してから、細菌を細胞培養インキュベーターに戻します。7〜10日間の培養後、1回の洗浄につき35〜40ミリリットルの滅菌洗浄緩衝液で細菌を2回洗浄し、2回目の洗浄後に1ミリリットルの無血清RPMI培地で細菌を再懸濁します。

細菌に無血清RPMI媒体の別の9ミリリットルを加えて、37°Cで5分間クラスIIのバイオセーフティキャビネットの水浴超音波装置で細菌を超音波処理します。次に、バイオセーフティキャビネット内に配置された分光光度計で、600ナノメートルの波長で1ミリリットルの細菌懸濁液の光学密度を測定します。単球由来細胞に感染させるには、無血清培地で細菌を1ミリリットルあたり10〜6コロニー形成単位の5倍に希釈し、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルの上清を1ミリリットルの新鮮な無血清培地と1ウェルあたり1ミリリットルの細菌懸濁液に置き換えて、5回の感染の多様性を得る。

細胞培養インキュベーターで4時間のインキュベーションを行った後、各ウェルを1回の洗浄につき1ミリリットルの滅菌洗浄バッファーで3回洗浄し、各洗浄後にプレートを慎重に傾けてウェルの角からバッファーの全量を除去します。次に、Mtb感染単球由来細胞を抗生物質を含まない2ミリリットルの完全培地に再懸濁します。フローサイトメトリーのために細胞を染色するには、感染した細胞を1ミリリットルのFACSバッファーにウェルあたり0.5ミリモルEDTAを添加して少なくとも30分間インキュベー

インキュベーションの終了時に、分離した細胞を穏やかなピペッティングで収集し、細胞を遠心分離用の個々のスクリューキャップ付き微量遠心チューブに移します。約50マイクロリットルの蛍光色素標識抗ヒト抗体カクテルおよび目的の生存率色素に細胞を再懸濁し、光から保護された摂氏4度で細胞を30分間インキュベートします。洗浄後、新たに調製した200マイクロリットルの固定緩衝液で細胞を室温で30分間、光から保護して固定します。

固定および洗浄後、細胞を400マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁し、細胞を1ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞を解析するには、コンペンセーションビーズを使用してカクテル中の各蛍光色素標識抗体の蛍光シグナルを補償し、未染色の細胞を使用してネガティブ細胞集団のゲートを設定します。次に、サンプルあたり最低50, 000個の細胞を取得します。

M1およびM2単球由来細胞はどちらも、Mtb感染時により高い粒度への垂直シフトと細胞サイズの縮小を示します。Mtbに感染したM1細胞およびM2細胞でも、非感染M0細胞と比較して5回の感染で細胞死の増強が観察されます。注目すべきは、M1細胞と比較して、感染4時間後のM2細胞で大幅に高いMtb GFP発現が観察されることです。

非感染M1細胞およびM2細胞は、それぞれCD64およびCD86またはCD200受容体およびCD163共発現によって特徴付けることができる。Mtb感染の4時間後、Mtb GFP陽性M1分極細胞ではCD200受容体陽性細胞の頻度の増加が観察され、M2細胞ではCD163の発現が減少します。Mtb GFP細菌は、共焦点顕微鏡法により、CD64陽性M1細胞およびCD163陽性M2細胞でも観察できます。

UMAP解析の結果、4時間のMtb感染ではマクロファージの分極に影響を与えるには不十分であり、24時間の感染では、感染していないM1細胞と感染したM2細胞のクラスターが明確に分離され、異なる表面マーカー発現プロファイルが発現することが明らかになりました。さらに、PhenoGraphの解析では、M1およびM2の非感染細胞とMtb感染細胞の間に、サイズの異なる24の異なるクラスターが一意に分布していることが示されています。M1またはM2分極の有効性、またはMtb感染性は、ヒトドナー間で大きく異なる可能性があります。

したがって、実験のばらつきを減らすために、各実験に少なくとも2人のドナーを含めることが推奨されます。このモデルでは、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡法、mRNA発現解析、可溶性因子のマルチプレックスアッセイ、GFP発現またはコロニー形成単位を用いた細菌定量を用いたヒトマクロファージの同時評価が可能です。